western-blot实验步骤.doc

Western bolt一、实验目的通过实验了解western blot技术的原理和操作。二、实验原理 SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。三、实验器材1. 电泳槽，胶板架子2. 转膜仪3. NC膜4. 电泳电源5. 滤纸6. 摇床7. X射线摄影暗匣8. X射线胶片9. 塑料薄膜四、实验试剂1.runningbuffer5xrunningbuffer(1L)Tris 15.1gGlycine 94.0gSDS 5.0gddH2O 定容至1L使用前稀释5倍2.Transfer buffer10Transfer buffer(1L)Tris 30.3g Glycine 144.0g ddH2O 定容至1L使用前稀释10倍，加入1/4体积的甲醇 3. TBS10TBS(500mL)Tris 12.1gNacl 40.0gddH2O 定容至500mL 用HCl调节溶液的pH值至7.64. TBST(1L)1TBS:Tween-20=1000:1ddH2O定容至1L5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)脱脂奶粉 2.5gTBST 定容至50ml6.一抗溶液7.二抗溶液8.显影液现配现用，溶液A：溶液B=1:1配置。9.SDS-PAGE（配方见下一页）五、操作步骤 1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.1SDS-PAGE胶的配置先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。准备好试剂。计算所需要使用试剂的量。例：6%的分离胶，每块胶板分离胶约需要7ml，10块胶，共需要70ml将胶板安装在架子上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。较高的板有正反之分，上面的“up”朝上。准备配胶按照上面配方依次添加。注意：1.添加量少的试剂要注意混匀 2.TEMED，APS要最后加配好分离胶，将胶液注入胶板缝隙中。注意速度不能太慢，否则胶液会凝，越是浓度高的胶液凝的越快。分离胶加入后，用异丙醇或水封平胶面，注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。半小时后观察分离胶是否凝结，左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。凝结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或水。配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。配好后倒胶。每块胶用约3ml。注意不要到过多的浓缩胶，以防插梳子后胶会溢出，倒置在之后用胶前拔梳子的时候出现上扬孔破损现象。且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。A.分离胶6%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.853.994.565.740%Acr/bis0.751.051.21.51.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0040.00560.00640.0088%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.63.644.165.240%Acr/bis11.41.621.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0030.00420.00480.00610%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.353.293.764.740%Acr/bis1.251.7522.51.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.00412%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.12.943.363.340%Acr/bis1.52.12.44.01.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.510%SDS0.050.070.080.110%AP（过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.00415%GEL5ml7ml8ml10mlH2O1.7252.4152.763.4540%Acr/bis1.8752.62533.751.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.004B.浓缩胶5%GEL2.02ml4.04ml6ml10mlH2O1.482.964.443.440%Acr/bis0.250.500.750.831.0Mtris-HCl（pH6.8）0.250.500.750.6310%SDS0.020.040.060.0510%AP（过硫酸铵）0.020.040.060.05TEMED0.0020.0040.0060.0051.2 凝胶电泳将电泳槽和胶板架子用去离子水清洗干净，把事先准备好的胶板和电泳槽与胶板架子组装好。注意：胶板较短的一侧朝内。往电泳槽内注入running buffer，如果胶板架子和胶板组装的不是很严密需要将running buffer加超过上样孔，但也不要漫过胶板最上方。根据自己需求上样。盖上电泳槽的盖子，注意电极的正负。插上电源，打开电源，设置时间和电压。一般需要设置两次时间，浓缩胶100v，0.5h；分离胶要根据分离胶的浓度和实验的需求而定。分离胶浓度越低，蛋白样跑的越快。开始电泳。2.转膜（半干转） 转一张膜需准备2张比分离胶部分略大的滤纸和1张与滤纸相同大小的NC膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。在转膜前要将NC膜先放在去离子水中浸泡几分钟，因为直接将NC膜泡在Transferring buffer 中会导致NC膜变的很皱。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。） 在加有Transferring buffer 的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、一支试管、滤纸和浸过的膜。 将转膜仪打开，在上面垫浸泡过的滤纸，用试管取一些Transferring buffer 轻轻倒在上面，再用试管来回擀几遍以擀走里面的气泡。 在滤纸上摆放好NC膜,注意膜的中间先与滤纸接触，然后两边慢慢放下。将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。记住正反面，切去一角已标记方向。小心剥下分离胶去离子水中清洗掉上面的废胶，后用手拿着胶的轻轻置于NC膜上，注意胶的中间要先与NC膜接触，然后慢慢放下，以防有气泡。用手调整使其与NC膜对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。在最上面铺上最后一层滤纸。用纸吸取多余的Transferring buffer。盖上转膜仪的盖子，插上电源，打开电源，设置时间和电压，25v，45min。3.免疫反应 1.取出NC膜于，用剪刀减去多余的NC膜部分，用同样的方法剪去一个角，标记正反。将NC膜置于TBS中在摇床上摇3次，10分钟/次，倒去TBS液。2.封闭：加入5%的脱脂奶粉溶液，1h，倒去。3.一抗（1：10000）孵育4过夜。4.取出NC膜，用TBST在摇床上洗三次，每次15min。5.封闭：加入5%的脱脂奶粉溶液，1h，倒去。6.用同样的方法，二抗（1：10000）孵育，1h。7.取出NC膜，用TBST洗三次，每次15min。4.显影取两张塑料膜，剪成比膜大的相同的大小。将其中一张铺在X射线摄影暗匣里。按照1：1配制好显影液，混匀。将NC膜平铺在第一张塑料膜上，将显影液均匀的铺在NC膜上,左右摇晃X射线摄影暗匣使显影液尽量铺满NC膜。将第二张塑料膜从左到右或从上到下铺在最上面