毕业设计（论文）-基于反向找靶的天然产物活性研究.docx

基于反向找靶的天然产物活性研究摘 要利用计算机辅助药物设计（CADD）技术对Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)、Pubesenside A、2-氟代腺苷和腺苷的潜在靶标进行预测并对预测结果进行进一步的验证与分析。采用Pharmmapper网络服务器进行初步预测，并结合文献进行筛选与验证，然后采用Discovery Studio3.0（以下简称DS3.0）对靶蛋白与Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)、Pubesenside A、2-氟代腺苷和腺苷分子进行对接并对其相互作用进行进一步分析与讨论。结果Pharmmapper筛选结果显示Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)与表皮生长受体（Epidermal growth factor receptor以下简称EGFR）的结合较好，Pubesenside A与血管内皮生长因子受体2（Vascular endothelial growth factor receptor 2以下简称VEGFR-2）的结合较好，2-氟代腺苷和腺苷与-内酰胺酶（Beta-lactamase）的结合较好。查阅文献发现EGFR是当前药物治疗非小细胞癌症的主要靶标，例如厄洛替尼、吉非替尼等1；VEGFR-2是当前治疗肾癌的主要靶标，例如索拉菲尼等；Beta-lactamase是著名抗生素-青霉素的靶标。DS3.0的对接结果也显示Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)尤其是（2）与EGFR具有静电作用、氢键、范德华力、PiPi键等相互作用；Pubesenside A与VEGFR-2之间具有静电作用、氢键、范德华力等相互作用；2-氟代腺苷和腺苷尤其是2-氟代腺苷与Beta-lactamase之间具有静电作用、氢键、范德华力、Pi键等相互作用。本次实验就Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)与厄洛替尼相比较分别与EGFR进行分子对接；Pubesenside A与索拉菲尼相比较并与VEGFR-2进行分子对接；2-氟代腺苷和腺苷与青霉素相比较并分别与青霉素进行分子对接。并比较得出结论：Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)的潜在靶标最有可能是EGFR。而且无论是在Pharmmpper的筛选结果还是在DS3.0中的对接结果来看Chinese Bittersweet Alkaloid (2)与受体EGFR的对接匹配度以及分子间相互作用的强度明显高于Chinese Bittersweet Alkaloid (1)。Chinese Bittersweet Alkaloid (2)可能是治疗非小细胞肺癌理想的新型化合物。有望成为现如今非小细胞肺癌靶向药物出现耐药性的替代药物，以及出现严重不良反应时的替代药物。Pubesenside A的潜在靶标最有可能是VEGFR-2，Pubesenside A可能是治疗肾癌的理想的新型化合物，有望成为代替索拉菲尼进行肾癌治疗。2-氟代腺苷和腺苷的潜在靶标可能是Beta-lactamase，2-氟代腺苷和腺苷有望成为新型抗生素来代替青霉素等一些已经出现耐药性的抗生素的替代药物。关 键 词：CADD;Pharmmapper，Discovery Studio3.0，潜在靶标，对接论文类型：基础研究Study on the activity of natural products based on reverse targetingABSTRACTThe potential targets of Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2), Pubesenside A, 2-fluoroadenosine and adenosine were predicted by computer-aided drug design (CADD) technique and the results were further validated and analyzed. Pharmmapper network server for preliminary prediction, combined with the literature for screening and validation，The target protein was then docked with Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2), Pubesenside A, 2-fluoroadenosine and adenosine molecules using Discovery Studio 3.0 (hereinafter DS3.0) ，and its interaction for further analysis and discussion. Results The results of Pharmmapper screening showed that the combination of Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2) with epidermal growth factor receptor (Epidermal growth factor receptor) was better. Pubesenside A and vascular endothelial growth factor receptor 2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2 hereinafter referred to as VEGFR-2), the binding of 2-fluoroadenosine and adenosine to -lactamase is better. Access to the literature found that EGFR is the current drug treatment of non-small cell cancer, the main target, such as erlotinib, gefitinib, etc. 1; VEGFR-2 is the main target for the treatment of renal cancer, such as sorafenib; Beta-lactamase is a well-known target for antibiotic-penicillin. The results of docking with DS3.0 also show that Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2) especially (2) interact with EGFR with electrostatic interactions, hydrogen bonds, van der Waals forces, Pi - Pi bonds; Pubesenside A and VEGFR - 2 2-fluoro-adenosine and adenosine, especially 2-fluoro-adenosine and Beta-lactamase between the electrostatic interaction, hydrogen bond, van der Waals force, Pi bond And so on. In this experiment, Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2) were compared with erlotinib, respectively, and molecular adherence to EGFR; Pubesenside A compared with sorafenib and with VEGFR-2 molecular docking; 2-fluoro Adenosine and adenosine were compared with penicillin and were respectively confluent to penicillin. And compare the conclusion that the potential target for Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2) is most likely to be EGFR. And the docking match and the intermolecular interaction intensity of Chinese Bittersweet Alkaloid (2) with receptor EGFR were significantly higher than those of Chinese Bittersweet Alkaloid (1), both in Pharmmppers screening results and in docking results in DS3.0. Chinese Bittersweet Alkaloid (2) may be the ideal new compound for the treatment of non-small cell lung cancer. Is expected to become now non-small cell lung cancer drug resistance drug-targeted alternative drugs, and the emergence of serious adverse reactions when the alternative drugs. The potential target for Pubesenside A is most likely to be VEGFR-2, and Pubesenside A may be the ideal new compound for the treatment of renal cell carcinoma and is expected to be a substitute for sorafenib for renal cancer. The potential targets of 2-fluoroadenosine and adenosine may be Beta-lactamase, 2-fluoroadenosine and adenosine is expected to become a new antibiotic instead of penicillin and some other antibiotic resistance has been the alternative drug.KEY WORDS: CADD; Pharmmapper, Discovery Studio 3.0, potential targets, dockingDissertation Type: Basic Research目录基于反向找靶的天然产物活性研究1摘 要1Study on the activity of natural products based on reverse targeting2ABSTRACT2符号说明6第一章 前 言71.1研究天然产物靶点的意义71.2现有研究天然产物靶点的手段81.3计算机辅助药物设计（CADD）的发展及特点81.4 Pharmmapper、Discovery Studio、PDB蛋白数据库简介91.4.1 PharmMapper服务器91.4.2 Discovery Studio91.4.3 PDB蛋白数据库10第二章 天然产物Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)的靶点筛选以及分子对接模拟实验112.1天然产物Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)的靶点筛选112.1.1 天然产物Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)的概况112.1.2拟采用的研究路线132.1.3虚拟筛选结果132.1.4虚拟筛选小结142.2 利用Discovery Studio3.0对筛选结果进行分子对接验证筛选结果的实验操作152.2.1 Chinese Bittersweet Alkaloid （1）and（2）及厄洛替尼分子的预处理。152.2.2 EGFR靶蛋白的预处理。182.2.3利用DS3.0中的Dock Ligands（LibDock）模块进行模拟对接。定义受体蛋白的活性位点对接202.2.4分析对接结果。生成配体-蛋白相互作用的二维平面图在靶蛋白三维结构图中观察分子结合情况252.3本章小结28第三章 天然产物Pubesenside A的靶点筛选以及分子对接模拟实验293.1天然产物Pubesenside A的靶点筛选293.1.1天然产物Pubesenside A的结构及概况293.1.2拟采用的研究路线293.1.3虚拟筛选结果303.2 利用Discovery Studio3.0对筛选结果进行分子对接验证筛选结果的实验操作303.2.1 Pubesenside A及索拉菲尼分子的预处理。303.2.2 VEGFR-2靶蛋白的预处理。323.2.3利用DS3.0中的Dock Ligands（LibDock）模块进行模拟对接。343.2.4分析对接结果。3在靶蛋白三维结构图中观察分子结合情况373.3本章小结38第四章 天然产物2-氟代腺苷和腺苷的靶点筛选以及分子对接模拟实验384.1天然产物2-氟代腺苷和腺苷的靶点筛选384.1.1天然产物2-氟代腺苷和腺苷的结构及概况384.1.2拟采用的研究路线394.1.3虚拟筛选结果394.2 利用Discovery Studio3.0对筛选结果进行分子对接验证筛选结果的实验操作404.2.1 2-氟代腺苷和腺苷及索拉菲尼分子的预处理。404.2.2 Beta-lactamase靶蛋白的预处理。424.2.3利用DS3.0中的Dock Ligands（LibDock）模块进行模拟对接。434.2.4分析对接结果。504.3本章小结60参考文献61致谢62附录63符号说明英文缩写英文全称中文名称CADDComputer Aided Drug Design计算机辅助药物设计EGFRepidermal growth factor receptor表皮生长因子受体DSDiscovery StudioPDBprotein data bank蛋白数据库NSCLCnonsmall-cell lung cancer非小细胞（型）肺癌TCMDTraditional Chinese Medicines Database中药化学数据库CNPDChinese Natural Product Datebase中国天然产物数据库第一章 前 言1.1研究天然产物靶点的意义天然产物是指从生物体或自然界中发现的化学成分物质。部分天然产物具有良好的药理活性或生物活性，常被应用于药物发现和药物设计领域中，如青蒿素、紫杉醇、番荔枝内酯、喜树碱、阿霉素、As2O3等等。药物靶标是药物发挥作用实现疗效的目标分子，是指具有重要生理或病理功能，能够与药物分子相结合并产生药理作用的生物大分子(包括基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等)及其特有的结构域。因此，药物靶标是药物筛选的基础，也是创新药物的前提，对新药创制具有源头创新意义。天然产物是新药创制的重要来源，识别其作用靶点不仅为临床预防治疗提供可能新策略，也为进一步阐释中草药及其复方的作用特点及分子机制提供参考依据2。1.2现有研究天然产物靶点的手段图1-1 研究天然产物靶点的手段31.3计算机辅助药物设计（CADD）的发展及特点随着结构生物学与计算化学的发展，基于计算机辅助设计的药物发现过程逐渐为人们所重视。与传统药物筛选过程相比，计算机辅助药物设计从理论出发，避免传统药物筛选过程中的盲目性并能进行直观的设计，它的出现极大地节省了资本，加快了新药开发的进程。2001年反向分子对接( inverse docking) 概念的提出4，无疑为药物靶点发现掀起了一场新的革命。继 INVDOCK 软件后， TarFis Dock 、PharmMapper 等免费在线服务器为人们所熟知并逐渐得到认可。其方便快捷的预测功能为药物靶点的发现提供了至关重要的作用，是药物研究与开发及中药现代化进程中不可或缺的重要工具5。现如今CADD技术在整个药物设计与开发中起着越来越重要的作用，CADD技术不仅能够大大降低药物开发成本，减少盲目的浪费，节省有限的实验资源，而且其筛选速度还能大大缩短药物开发周期，加快新药的发现与制备速度。目前CADD介入中药研究最多的领域是针对某一个药物作用靶标，在中药和天然产物化合物数据库中搜索，找到该靶标的特异作用的化合物，通常称之为虚拟筛选。虚拟筛选分为两个方面，一是基于受体结构的筛选方法，又称为分子对接：二是基于配体结构的筛选方法又称药效团搜索。虚拟筛选是CADD应用最为成功的一项技术，这项工作的基础是必须具备化合物数据库。以往的筛选工作也大多基于化学合成商品化合物数据库的搜索6。近年来国内研究人员开始尝试中药中的活性化合物的搜寻。一些国内研究机构已经开发出了用于虚拟筛选的中药化合物数据库。其中已经授权代理销售的就有TCMD(中药化学数据库)7和CNPD(中国天然产物数据库)8。这些数据库大量用于特定靶标活性化合物的搜寻，其中有不少的成功实例。1.4 Pharmmapper、Discovery Studio、PDB蛋白数据库简介1.4.1 PharmMapper服务器PharmMapper是上海药物研究所刘晓峰博士开发的以活性小分子为探针、搜寻潜在药物靶点,从而预测小分子生物活性的反向药效团匹配方法。该课题组建立了相应的公共网络服务器PharmMapper(1/pharmmapper)。PharmMapper内置了超过7000个药效团模型,这些模型关联1627个药物靶点信息。PharmMapper可自动寻找与查询分子构象最为匹配的药效团,并根据其匹配程序进行打分排序。PharmMapper在计算速度方面具有较大优势,可以在数分钟至数十分钟内完成靶点的预测,为药物新靶标发现提供信息技术支撑,有力地促进药物靶标发现研究9。基于配体结构特征的药物靶点预测方法近年来发展迅速,一方面是由于具有靶点注释信息的生物活性数据库越来越多,这些数据库均可利用相似度搜索进行靶点预测;另一方面该类方法计算速度非常迅速,可在数秒内完成对数百万分子的检索,这为通过网络访问提交任务从而迅速反馈结果提供了可行性10。1.4.2 Discovery StudioDiscovery Studio(DS), 是基于Windows/Linux系统和个人电脑、面向生命科学领域的新一代分子建模和模拟环境。它服务于生命科学领域的实验生物学家、药物化学家、结构生物学家、计算生物学家和计算化学家，应用于蛋白质结构功能研究，以及药物发现。为科学家提供易用的蛋白质模拟、优化和药物设计工具。通过高质量的图形、多年验证的技术以及集成的环境，DS将实验数据的保存、管理与专业水准的建模、模拟工具集成在一起，为研究队伍的合作与信息共享提供平台。DS目前的主要功能包括：蛋白质的表征（包括蛋白-蛋白相互作用）、同源建模、分子力学计算和分子动力学模拟、基于结构药物设计工具（包括配体-蛋白质相互作用、全新药物设计和分子对接）、基于小分子的药物设计工具（包括定量构效关系、药效团、数据库筛选、ADMET）和组合库的设计与分析等。DS可以应用于生命科学以下研究领域：新药发现，生物信息学，结构生物学，酶学，免疫学，病毒学，遗传与发育生物学，肿瘤研究11。1.4.3 PDB蛋白数据库PDB是protein data bank 的简写，在生物学软件中，一般把蛋白质的三维结构信息用pdb文件保存。PDB文件本质是一种ASICLL码文件，可以用普通的文本编辑器编辑，也可以用专业软件编辑。不过要展示该文件所表示的蛋白质三维空间结构则需要借助相关软件，如winCoot、Moe等。PDB蛋白数据库是目前最主要的收集生物大分子(蛋白质、核酸和糖)2.5维（以二维的形式表示三维的数据）结构的数据库,是通过X射线单晶衍射、核磁共振、电子衍射等实验手段确定的蛋白质、多糖、核酸、病毒等生物大分子的三维结构数据库。随着晶体衍射技术的不断改进,结构测定的速度和精度也逐步提高。90年代以来,随着多维核磁共振溶液构象测定方法的成熟,使那些难以结晶的蛋白质分子的结构测定成为可能。蛋白质分子结构数据库的数据量迅速上升。据2000年5月统计，PDB数据库中已经存放了1万2千多套原子坐标,其中大部分为蛋白质，包括多肽和病毒。此外,还有核酸、蛋白和核酸复合物以及少量多糖分子。核酸三维结构测定进展迅速。PDB数据库中已经收集了800多套核酸结构数据12。PDB数据库允许用户用各种方式以及布尔逻辑组合(AND、OR和NOT)进行检索，可检索的字段包括功能类别、PDB代码、名称、作者、空间群、分辨率、来源、入库时间、分子式、参考文献、生物来源等项。用户不仅可以得到生物大分子的各种注释、坐标、三维图形、VAML等,并能从一系列指针连接到与PDB有关的数据库，包括SCOP、CATH、Medline、ENZYME、SWISS-3DIMAGE等。可通过FTP下载PDB数据。所有的PDB文件均有压缩和非压缩版以适应用户传输需要。PDB的电子公告版BBS和电子邮件兴趣小组(Mailing List)为用户提供了交流经验和发布新闻的空间。在PDB的服务器上还提供与结构生物学相关的多种免费软件如Rasmol、Mage、PDBBrowser、3DB Brower等13。第二章 天然产物Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)的靶点筛选以及分子对接模拟实验2.1天然产物Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)的靶点筛选2.1.1 天然产物Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)的概况2-吡咯基-1, 3-氧氮杂环己烷（2-pyrrolyl-1, 3-oxazacyclohexane）分子是一个新的生物碱活性化合物。该化合物是首次从卫矛科南蛇藤属杀虫植物苦皮藤(Celastrus angulatus. Maxin.)的种子油中分离得到的一类具全新骨架生物碱类活性手性化合物，被命名为Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)，它们的化学结构式如下：图1-1 化合物Chinese Bittersweet Alkaloid (1)和(2)的结构经过美国NCI癌症研究中心筛选，在筛选的9个细胞系的60个癌细胞株中，揭示该类化合物对非小细胞肺癌（Non small cell carcinoma, NSCC）HOP-92细胞株展现出好的抑制活性。化合物Chinese Bittersweet Alkaloid (2)的抗HOP-92肿瘤细胞半数生长抑制率为GI50=9.6 mg/mL (3.010-5 M)。体外测试结果，初步展示了该类化合物具有较强的抗非小细胞肺癌的高选择性活性。由于Chinese Bittersweet Alkaloid (2)的抗非小细胞肺癌肿瘤的活性很高，有望解决非小细胞肺癌对现今已存在的药物的耐药性。因此对该类新颖结构分子的全面认识和掌握其作用原理以及能否证明或有望成为具有高度选择性的新骨架抗肺癌药物的先导化合物，都是有待深入研究、剖析和拟解决的问题。2.1.2拟采用的研究路线研究路线如下图： 图1-2 研究路线图2.1.3虚拟筛选结果我们将Chinese Bittersweet Alkaloid (1)和(2)的分子式上传到Pharmmpper服务器中，点击Submit Job菜单，上传我们保存的sdf文件，点击Upload进入下一步。然后在Pharmacophore Mapping栏下Select Targets Set里勾选Human Protein Targets Only (v2010, 2241)，其它选项默认。点击Submit。建立任务，然后Pharmmpper服务器自动为我们的任务进行编号排队处理。这个编号需要我们保存以查询任务进行情况及结果。经过快则几个小时慢则几天不等的运算，Pharmmpper服务器会回馈我们任务结束的邮件。邮箱是事先填好的。在邮箱里可以直接进入Pharmmpper服务器返回的结果页面。在页面中我们可以看到所有与我们的化合物可能有匹配可能的靶蛋白。我们需要对这些靶蛋白逐一进行筛选找到我们需要的靶蛋白。筛选结果如下表：PDB ID靶标名称Fit Score(1) Fit Score(2)相关疾病相关药物1M17Epidermal growth factor receptor2.1643.745非小细胞肺癌厄洛替尼埃克替尼 表1-1 Pharmmapper服务器筛选出的Chinese Bittersweet Alkaloid (1) and (2)与非小细胞肺癌相关的靶标查阅文献发现表皮生长因子及其受体由范德堡大学的Stanley Cohen发现。Cohen与Rita Levi-Montalcini也因此分享了1986年的诺贝尔医学奖。EGFR作为致癌基因的鉴定现如今已经成功研制出针对EGFR的抗癌治疗剂（称为“EGFR抑制剂”），包括吉非替尼14，厄洛替尼15，阿法替尼，布替格尼和埃克替尼16用于肺癌，西妥昔单抗用于结肠癌。最近，阿斯利康开发了第三代酪氨酸激酶抑制剂奥司米替尼17，用于治疗非小细胞肺癌。2.1.4虚拟筛选小结基于Pharmmpper服务器的虚拟筛选，利用Pharmmpper服务器对其数据库中的7000余种靶蛋白进行反向对接，结果按照Fit Score的得分进行排序，分值越大则匹配度越高，分子间作用力越大。从表中数据不难得出Chinese Bittersweet Alkaloid （1）and（2）与EGFR都有一定的匹配度，而且Chinese Bittersweet Alkaloid（2）的匹配度Fit Score的得分在3.5以上，说明其匹配度很高，十分有望成为治疗癌症肿瘤的新型化合物。将筛选结果在PDB蛋白数据库中打开，在打开的页面中可以查看当前与其结合最好的分子结构与名称。我们发现PDB ID为1M17的靶蛋白正是时下治疗非小细胞肺癌的药物厄洛替尼的靶蛋白。查阅文献发现厄洛替尼作为分子靶向药物，能选择性抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶，大部分临床研究显示其对晚期非小细胞肺癌(nonsmall celllung cancer,NSCLC)有一定的疗效18。为此我们接下来的研究方向就很明确了，只要利用DS3.0软件对此靶蛋白与我们的新型化合物Chinese Bittersweet Alkaloid （1）and（2）进行对接验证，并与厄洛替尼的对接结果进行比较分析就不难得出我们想要的结果。2.2 利用Discovery Studio3.0对筛选结果进行分子对接验证筛选结果的实验操作2.2.1 Chinese Bittersweet Alkaloid （1）and（2）及厄洛替尼分子的预处理。首先用ChemDraw绘制出所需要进行对接的分子，在这里我们需要绘制出Chinese Bittersweet Alkaloid （1）and（2）及厄洛替尼的分子式如下：图1-3 化合物Chinese Bittersweet Alkaloid (1)和(2)图1-4 厄洛替尼用DS3.0分别打开这三个化合物。如图： 图1-5 Chinese Bittersweet Alkaloid (1)和(2) 厄洛替尼然后使用DS3.0里的Prepare Ligand模块对这三个化合物进行预处理，得出分子在空间中的所有可能构象，结果如下：图1-6 Chinese Bittersweet Alkaloid (1)的所有可能空间构象图1-7 Chinese Bittersweet Alkaloid (2)的所有可能空间构象图1-8 厄洛替尼的所有可能空间构象从结果中得出Chinese Bittersweet Alkaloid (1)共有4中可能的空间构象，Chinese Bittersweet Alkaloid (2)共有32中可能的空间构象，厄洛替尼共有8种可能的空间构象。Chinese Bittersweet Alkaloid （1）and（2）及厄洛替尼分子对接前的预处理至此结束。2.2.2 EGFR靶蛋白的预处理。首先在PBD蛋白数据库中输入1M17靶蛋白代号，找到并以PDB的格式下载此蛋白，然后用DS3.0打开此蛋白显示结果如下图：图1-9 EGFR靶蛋白二维结构图图中红色小圆点是悬浮在蛋白周围的水分子，中间一个化合物即是厄洛替尼。受体分子在对接前需进行一定的处理，删除受体分子(PDB文件中)水分子，加上极性氢原子，赋予电荷，添加磁场。在系统视图中，点击选中 Water，按 Delete 键删除。除掉靶蛋白附近的水分子。在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开 Macromolecules | Prepare Protein，点击 Clean Protein。 对蛋白分子进行加氢，对非标准名称、非完整的氨基酸及某一残基同时存在多个构象等一系列问题进行校正，从而完成对受体蛋白分子的预处理。在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开 Macromolecules | Prepare Protein，点击 Show Clean Report。 可以查看相应的报告文件。其预处理结果如下图：图2-10 EGFR受体蛋白预处理结果及报告2.2.3利用DS3.0中的Dock Ligands（LibDock）模块进行模拟对接。定义受体蛋白的活性位点在系统视图（Hierarchy）中点击选中 1M17 整个分子。 在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开 Receptor-Ligand Interactions | Define and Edit Binding Site，点击 Define Receptor。 在系统视图中添加 SBD_Receptor 一栏。 将 1M17 定义为对接体系中的受体分子。在系统视图中，点击选中 Ligand Groups，然后在Define Site栏下点击From Current Selection以厄洛替尼为中心定义一个受体结合区域图中以红色球形区域表示。最后按Delete键删除靶蛋白中已存在的Ligand Groups（厄洛替尼）为即将对接的分子腾出空间。结果如下：图1-11 定义EGFR受体蛋白的活性位点 对接首先将受体蛋白与厄洛替尼进行对接。在 Tools 浏览器中展开 Dock Ligands |High-Throughput Screening| Dock Ligands (LibDock) 流程，流程对应参数在参数浏览器中打开。在参数浏览器中，点击 Input Receptor，从下拉列表中选择“1m17:1M17”设置受体蛋白。 点击 Input Ligands 参数，从下拉列表中选择“厄洛替尼:All”，指定对接配体。其余选项默认。点击Run开始分子对接。然后重复相同步骤将受体蛋白分别与化合物Chinese Bittersweet Alkaloid (1)和(2)进行对接。其结果（只选取对接匹配度最高的POSE结果）如下：图1-12 EGFR与厄洛替尼分子对接结果图1-13 EGFR与Chinese Bittersweet Alkaloid (1)的对接结果图1-13 EGFR与Chinese Bittersweet Alkaloid (2)的对接结果表1-2 配体与EGFR的对接参数表Ligand NameAbsolute EnergyConf NumberRelative EnergyLibDock Score厄洛替尼76.7723347.15415114.869Chinese Bittersweet Alkaloid (1)15.82516110.15180.5331Chinese Bittersweet Alkaloid (2)24.1779889.1236102.534利用DS模块LibDock模拟分子对接，模拟分析可以得到分子对接绝对自由能(Absolute Energy)、对接姿式数(Conf Number)、相对自由能(RelativeEnergy)，以及LibDock综合打分(LibDock Score)等参数值。其中，绝对自由能和相对自由能代表了该抑制剂与位点对接所需的能量，通常绝对自由能和相对自由能越低，表明该对接位点的对接越紧密，即抑制剂对该位点的抑制作用越强。对接姿式数越大，表明抑制剂与该位点作用的可能性越大。LibDock综合打分是LibDock模块综合绝对自由能、相对自由能和对接姿式数对该对接姿式的打分；LibDock综合得分越高，抑制剂对该位点的抑制作用越强。通过比较LibDock综合得分，可以有效评判抑制剂与蛋白对接的紧密程度，从表中数据可以看出Chinese Bittersweet Alkaloid (2)与EGFR靶蛋白的对接综合得分为102.534分远远高于Chinese Bittersweet Alkaloid (1)80.5331分的对接得分，且与厄洛替尼的114.869分相差不多。甚至Chinese Bittersweet Alkaloid (2)与EGFR对接的绝对自由能远低于厄洛替尼与EGFR对接的绝对自由能，在对接姿势数上Chinese Bittersweet Alkaloid (1)and(2)均高于厄洛替尼与EGFR对接的对接姿势数。只是在相对自由能上Chinese Bittersweet Alkaloid (1)and(2)低于厄洛替尼与EGFR对接的相对自由能。2.2.4分析对接结果。生成配体-蛋白相互作用的二维平面图在 Tools 浏览器中点击 Analyze Complexes |Analyze Single Complex 下的 Show 2D Diagram 命令，可以看到在一新窗口中打开配体-蛋白相互作用二维平面图，便于我们更直观的观察两者的相互作用及关键的氨基酸和基团。图1-14 厄洛替尼与EGFR相互作用的二维平面图图1-15 Chinese Bittersweet Alkaloid (1)与EGFR相互作用的二维平面图图1-16 Chinese Bittersweet Alkaloid (2)与EGFR相互作用的二维平面图结果说明图如下：图1-17 对接相互作用二维平面图说明图从图中可以很清晰的看出三个化合物与EGFR的相互作用以及关键的氨基酸与基团。其中厄洛替尼与EGFR的第LysA:721之间有Pi相互作用，与MetA：769之间形成了很强的氢键。Chinese Bittersweet Alkaloid (1)与EGFR的ThrA:766、LysA:721、ThrA:830、AspA:831之间形成了很强的氢键但没有形成任何Pi相互作用。Chinese Bittersweet Alkaloid (2)与EGFR的PheA:699之间有Pi-Pi相互作用，与AspA:831、LysA:766之间形成了很强的氢键。在靶蛋白三维结构图中观察分子结合情况打开厄洛替尼所在窗口在 View 浏览器中点击Dis Style选择以三维结构显示。在 Tools 浏览器中点击 Define and Edit Binding Site |Display 下的Show/Hide Site Sphere然后点击Show/Hide Residues Outside Sphere命令这样将只显示结合位点球附近的氨基酸，其余氨基酸将被隐藏，以便更好的观察配体与受体之间相互作用在三维空间的情况。在Tools浏览器中选择Analyze Docking Results |Visualize Interactions |Receptor-Ligand Hydrogen Interactions以及Receptor-Ligand Pi Interaction在视图窗口中，受体原子与配体对接poses间的氢键及Pi相互作用会通过绿线和黄线显示出来。结果如图：图1-18 三维结构显示下厄洛替尼的对接结果图1-19 三维结构显示下Chinese Bittersweet Alkaloid (1)的对接结果图1-20 三维结构显示下Chinese Bittersweet Alkaloid（2）的对接结果从图中可以看到EGFR中的氨基酸残基形成的活性口袋19与各个化合物对接时形成的作用力在具体的空间中的作用位置与情况。其中在EGFR与厄洛替尼的结合中形成了以LysA:721和MetA:769为主要作用氨基酸残基的活性口袋，在EGFR与Chinese Bittersweet Alkaloid (1)的结合中形成了以ThrA:766、LysA:721、ThrA:830和AspA:831为主要作用氨基酸残基的活性口袋，在EGFR与Chinese Bittersweet Alkaloid (2)的结合中形成了以PheA:699、AspA:831和LysA：766为主要作用氨基酸残基的活性口袋。不难看到LysA:721以及AspA:831在分子结合中起着很关键的作用，应该为EGFR中活性很高的氨基酸残基。2.3本章小结1、本次实验可以表明这三个化合物对EGFR的抑制作用效果由强至弱的综合初步排序为：厄洛替尼Chinese Bittersweet Alkaloid (2) Chinese Bittersweet Alkaloid (1)。但是在对接的绝对自由能以及对接姿势数上Chinese Bittersweet Alkaloid (1)and（2）甚至好于厄洛替尼。而厄洛替尼和Chinese Bittersweet Alkaloid (2)与EGFR的对接得分远高于Chinese Bittersweet Alkaloid (1)的原因极有可能是因为其在对接时形成了很强的Pi相互作用。同时这一结论也印证了上述Pharmmpper服务器返回的筛选结果以及实验均是Chinese Bittersweet Alkaloid (2)的抑制作用优于Chinese Bittersweet Alkaloid (1)的结论。2、三种化合物在EGFR空间上的结合位点相似，但是具体作用的氨基酸残基却不同，而且其作用机理也因为其结构的不同而不尽相同，由于服用厄洛替尼后大部分患者出现皮疹、腹泻、肝转氨酶升高、粒细胞减少、食欲下降及呕吐等不良反应20，甚至出现耐药性。新型化合物Chinese Bittersweet Alkaloid (1)and（2）有望成为用于替代厄洛替尼的新型化合物。其具体的毒副作用还需进一步深入研究。厄洛替尼和Chinese Bittersweet Alkaloid (2)均能与EGFR形成Pi相互作用，这可能是厄洛替尼和Chinese Bittersweet Alkaloid (2)与EGFR对接综合得分高于Chinese Bittersweet Alkaloid (1)的原因。由于Chinese Bittersweet Alkaloid (2)比Chinese Bittersweet Alkaloid (1)多了一条侧链使得Chinese Bittersweet Alkaloid (2)与EGFR对接的空间位置与Chinese Bittersweet Alkaloid (1)存在