elisa检测抗体效价.doc

实验目的：实验材料：1、 碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、浓硫酸、Tween-20 、BSA等。2、 酶标抗小鼠IgG3、 TMB溶液配制：1、抗原包被液：PH9.6的碳酸盐缓冲液（0.05 M） 批号：称取：Na2CO3（分子量105.99） 1.59 g NaHCO3（分子量84.01） 2.9 g加蒸馏水至1000ml，调PH值。滤膜（0.45 m）过滤，4保存。2、洗涤缓冲液(PBS-T) 批号：PBS缓冲液 1000 ml Tween-20: 0.5 ml 调PH值至7.39。滤膜（0.45 m）过滤，室温保存或4保存。 3、封闭液（1.0% BSA/PBS-T） 批号： 洗涤缓冲液 1000 ml BSA: 10 g 现用现配。 4、血清稀释液(pH7.4 PBS)：0.0067 M(PO4+) 5、洗涤用PBS (pH7.4), 0.15 M(PO4+) 批号：称取： NaCl 8.0 g Na2HPO412H2O2.9 g KH2PO4 0.2 g KCl 0.2 g 加蒸馏水至1000 ml， 调PH值至7.39。滤膜（0.45 m）过滤，室温或4保存。6、二抗稀释液：同洗涤缓冲液 7、终止液：2M H2SO4 批号：水 90ml 浓硫酸 10.64ml 浓硫酸逐滴加入水中，不断搅拌，防止局部过热。4保存。实验器材：1、1 ml枪头；200 l枪头；10 l枪头，。2、1.5 ml EP管。3、移液器1 ml、200 l、100 l、20 l、10 l、2 l。4、96孔板（costor，美国）。5、电子天枰。6、酶标仪（Labsystems DragonMK3，芬兰）。7、洗板机（BIORAD MODEL 1575，美国）。8、电子pH计（SevenEasy S20）。方法步骤：1 包被抗原： 用 g/ml 的 蛋白包被，每孔100l。密封，4过夜。2 洗板：取出预先4包被过夜的96孔板，用PBS-T洗液300 l/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。3 封闭： 每孔加入封闭液300 l/孔。封膜，37放置1 h。5 洗板： 用PBS-T洗液300 l/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。6 加一抗： 96孔板上血清稀释倍数为1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，共8个稀释梯度，具体操作如下：血清在Ep管中稀释成100倍： 1： 10 ： 5 l原倍血清 + 45 l血清稀释液；1： 100 ： 30 l 10 倍血清+ 270 l血清稀释液；按设计加入96孔板相应位置，然后依次按倍比稀释至200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍：1： 400 ： 100 l 200 倍血清+ 100 l血清稀释液；1： 800 ： 100 l 400 倍血清+ 100 l血清稀释液；1： 1600 ： 100 l 800 倍血清+ 100 l血清稀释液；1： 3200 ： 100 l 1600倍血清+ 100 l血清稀释液；1： 6400 ： 100 l 3200倍血清+ 100 l血清稀释液；1： 12800 ： 100 l 6400倍血清+ 100 l血清稀释液；所有样本加完后，封膜，37放置1 h。7 洗板： 用PBS-T洗液300 l/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。8 加酶标二抗：酶标抗小鼠IgG稀释5000倍： 稀释过的酶标二抗液100 l/孔，封膜，37放置1 h。9 洗板： 用PBS-T洗液300 l/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。10 底物显色：底物显色液TMB直接使用，注意避光放置。100 l/孔，37避