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乳酸菌的简介 一、乳酸菌的起源 根据圣经旧的书上记载，公元前 4000 多年，人类已经开始发酵乳酸肉制品 及蔬菜腌渍物。直到公元 1857 年，巴斯德(Pasteur)发现酸乳(sour milk)中有微小 生物体存在，将其定名为”levue lactique”，发酵乃微生物作用所致的秘密才首次 得以揭露；这是发现乳酸菌的开端。1873 年李斯特(Lister)利用稀释法，由酸乳 中纯化分离出 Bacterium lactis，也就是目前的 Lactococcus lactis，这是乳酸菌最 早被分离出来的纪录(廖,1998；李,2000)。 二、 乳酸菌的定义 乳酸菌一般是指能将碳水化合物发酵分解为乳酸的细菌群(佐佐木隆,1998)。 乳酸菌群具有以下几点特性： 1. 为革兰氏阳性(gram positive)球菌或杆菌。 2. 不产生孢子(nonsporting)且无运动性(nonmotile) 3. 不具分泌催化酶(catalase negative)之能力。 4. 可在有氧环境生长，但以无氧状态下生存较佳，亦有绝对厌氧者。 5. 需有碳水化合物、胺基酸、维生素等多种生长因子方能生长之复合营养需求 性(complex nutritional requirements)。 6. 依代谢途径与最终产物的不同，可分为同质发酵(homofermentative)及异质发 酵(heterofermentative)两种乳酸菌。同质发酵性乳酸菌含有 aldolase，最终产 物 90-100为乳酸；异质发酵性乳酸菌具有 phosphoketolase，其最终产物 除了 40-50的乳酸外，还包括乙醇、二氧化碳及醋酸等多项产物 (Ingledew,1995)。 乳酸菌普遍存在动物体消化道中，因耐酸性佳且可分泌乳酸及抗菌物质等有 利于生存的条件，故消化道三大菌群当中最占优势(Nemcova et al. 1997) 三、乳酸菌的分类 乳酸菌一般包括 Lactobacillus (L)、Leuconostoc (Leuc.)、Streptococcus (S)及 Pediococcus (Ped.)四属； 广义的乳酸菌尚包括Bifidobacterium与Sporolactobacillus 两个属(Jay, 2000)。近年来依据 DNA 和 RNA 序列相似性比对，将传统特上归类 不明的菌属，一一明确独立成群，并赋与分类上之位置；至 1999 年底为止，乳 酸菌共被分成 18 个属，分别为 Abiotrophia、Atopobium、Bifidobacterium、 Carnobacterium 、 Enterococcus 、 Lactobacillus 、 Lactococcus 、 Lactospaera 、 Leuconosto 、 Oenococcus 、 Pediococcus 、 Sporolactobacillus 、 Streptococcus 、 Tetragenococcus、 Vagococcus、 Weissella、 Granulicatella、 Paralactobacillus(李, 2000)。 其中 Streptococcus 属及 Enterococcus 属中的部份菌株对人类及动物具有病原性， Bifidobacterium 属、Pediococcus 属及 Leuconostone 属中的少数菌种，曾有报告 指出在人类感染病例中被分离到(Gasser, 1994；Donohue & Salminen, 1996)。而 Lactobacillus 属及 Lactococcus 属两者则普遍被认为对人类及动物体无害 (Salminen et al. , 1998)。 第一節 洛德乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)的简介 一、洛德乳酸杆菌的发现 洛德乳酸杆菌是 1962 年 Lerch 及 Reute 等首次由人类的粪便中分离所得。 直到 1980 年之前都被归类在 Lactobacillus fermentum type 中。后经 Kandler (1980)等人进一步研究，发现本菌基因的 G+C mol为 40，较 L. fermentum 之 32 高 ， 且 其 细 胞 壁 的 型 别 ( 含lysine-D-iso-asparagine) 、 D-lactate dehydrogenase(D-LDH)NAD-dependent L-LDH之电泳速度与L. fermentum差异甚 大。因此将此菌株独分类，重新命名为 Lactobacillus reuteri(Kandler et al., 1980； Axellson et al., 1987)。 二、洛德乳酸杆菌的特性 Lactobacillus reuteri 为革兰氏阳性菌，其型态随外界环境变化而呈长链或长 杆状，属多型性，但一般多为短杆菌。不具芽孢及鞭毛，没有运动性，缺催化酶 (catalase reaction negative)。本菌属兼性厌氧，于含有 5CO2、35-38下生长 最佳。L. reuteri 的醣解代谢最终产物包括乳酸、乙醇及二氧化碳，故属异质性发 酵(heterofermentation)之乳酸菌(Kandler et al.,1980)。 除了人类消化道之外， 在鸡、 猪、老鼠及牛等动物均曾分离出 L. reuteri( Kandler et al., 1980；Vescovo et al., 1982；Sarra et al., 1985；Savage, 1985；Morelli et al., 1987；Axellson et al., 1987； Chung et al., 1991；Wagner et al., 1997；Song et al., 2000)，证实 L. reuteri 广泛存 在于许多动物消化道中。 三、洛德乳酸杆菌分泌的洛德因 1. 洛德因(reuterin)的发现 洛德因是洛德乳酸杆菌所皆泌的抗菌物质(图 2-1)。洛德因的发现，是 Axelsson 等在 1987 年从一批瑞典仔猪肠道所分离的乳酸菌，以共同培养技术 (co-culture technique)筛选各菌株产生制菌素的能力时，发现编号 1063 的菌株可 产生一种很强的制菌物质， 经 DNA/DNA 相似比对结果得知该菌为 L. reuteri。 其 所产生的抑菌素， 有别于一般乳酸菌所产生的蛋白质性制菌素(bacteriocin)、 H2O2 或酸代谢产物(Chung et al., 1989)， 而且并非所有的正菌皆可分泌此产物， 仅部份 L. reuteri strain， 如 DSM 20016、 ATCC23272、 G-60 等才能产生相同的制菌物质， 因此将该产物命名为洛德因。 2. 洛德因的特性 依据 Talarico(1988)等人的研究发现，L. reuteri 在厌氧状态下代谢甘油 (glycerol)会生成低分子量、 非蛋白质性、 酸碱值中性的中间产物-洛德因(图 2-2)。 其化学名为：3-hydroxy-propionaldehyde(3-HPA)，对脂肪分解酵素(lipolytic enzymes)及蛋白分解酵素(proteolytic enzymes)具有抗性(Axelsson et al., 1989)。分 泌至菌体外的洛德因具有广效抗菌作用，浓度在 0.1-0.8 mole/ml 即可抑制革兰 氏阳性菌(如 Clostridium、Bacillus、Staphylococcus 及 Streptococcus)、革兰氏阴 性(如 Candida、Torulopsis、Saccharomyces 及 Saccharomycoides)、霉菌(如 Aspergillus 及 Furarium)及原虫(如 Trypanasoma 及 Eimeria)等(Axelsson et al., 1989； Chung et al., 1989； Talarico and Dobrogosz, 1989)， 高浓度时为强力杀菌剂。 当其浓度提升 4-5 倍或环境中有紧迫因子时， 洛德因不仅可能抑制洛德乳酸杆菌 本身生长，甚至成为其致死因子(Talarico et al., 1988；Chung et al., 1989；Rasch et al., 2002)。 四、洛德因的功能 生体外试验(in vitro)结果显示，必须将洛德乳酸杆菌培养于类似动物消化道 环境下， 菌体才可合成高量的洛德因(Chung et al., 1989)， 而在洛德乳酸杆菌接触 到其他细菌的刺激时， 亦会提高洛德因的产量(el-Ziney et al., 1998)。 对于 reuterin 的杀菌机制尚不完全了解，目前只知其作用机制可能与微生物中的 RNA 还原酶 (ribonucleotide reductase)或硫氢基酵素(sulfhydryl enzyme)受到 reuterin 之抑制， 引起 DNA 合成受阻有关(Talarico et al., 1988；el-Ziney et al., 1998)。近年有研究 将洛德因应用于生医材料工程中， 研发出洛德因交联处理生物组织(reuterin-fixed biological tissues)。相较于传统的戊二醛交联处理生物组织(glutaraldehyde-fixed biological tissues)，洛德因处理的产物不但在生物组织中具有相同的杀菌能力， 引起的炎症反应也较轻微， 甚至能冠抑制用戊二醛交联处理之生物组织所引起的 组织钙化，显示出洛德因在生医材料的应用上有很大的潜力(Chen et al., 2002； Sung et al., 2002；Rasch, 2002)。 第二節 乳酸杆菌之应用 乳酸杆菌大多归属于安全的食用级微生物， 因具有将蛋白质产物直接分泌到 环境中的特性，长期以来被广泛运用食品工业、农产业甘制产品、发酵饮料、肉 制品及蔬菜的保鲜与防腐等(Adams & Marteam, 1995； Drouault & Corthier, 2001)。 在生活保健及临床医学上，乳酸杆菌也受到重视；包括利用 L. reuteri 减缓醇糖 不耐、胃肠道感染、或抗生素引起之下痢和胃炎等消化道症状(Saavedra, 2000； Rosenfeldt et al., 2002)。由于乳酸杆落动物体消化道中可引发有效之黏膜免疫反 应(Ahrne et al., 1998；McAuliffe et al., 2001；Christensen et al., 2002；Mack et al., 2003)，近年来学界致力于研究乳酸杆菌表现-分泌异源性抗原的功能，期望开发 乳酸杆菌成为疫苗携带者(vaccine carrier)，在加强疫苗投予的方便性及降低生产 成本的同时，能有效引发动物免疫能力(Slos et al., 1998；Wolf et al., 1998)。 第三節 第四節 讯号序列(signal sequences)的简介 一、讯号序列的特性 原核及真核细胞虽具有完全不同的特性， 但在将胞内所合成的蛋白质送往细 胞内特定胞器或是分泌至细胞外时，均有一段衔接于分泌蛋白质(exported protein)N 端的氨基酸，以将该蛋白质送达特定位置，此段氨基酸即为讯号序列 (signal sequence)。 在原核系统探讨蛋白质通过细胞莫的机制， 多根据 E. coli 的相 关研究进行更深入的探讨。从其基因序列中显示出，革兰氏阳性菌与革兰氏阴性 菌之蛋白质分泌系统利用的主要结构相似，因此普遍相信，其作用机制也是类似 的(van Wely et al., 2001)。根据 Nielsen 等人于 1997 年统计 3379 条源自各类真核 及原核细胞的讯号序列得知，其平均长度介于 18-25 个氨基酸之间。 二、革兰氏阳性菌讯号序列的特性 讯号序列在革兰氏阳性菌的蛋白分泌系统中所扮演的角色至今仍不完全明了。 相 较于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌之讯号序列平均长度， 发现阳性菌讯号序列之 平均长度较阴性菌长(Asseldonk et al., 1993)。根据 Tjalsma 等人于 2000 年针对 Bacillus subtilis 所进行的统计分析，发现其讯号序列的初级结构普遍显示三个明 显相似的区段(图 2-6)，具有下述特性： 1. amino-terminal N-domain： 此区段的平均长度为 2-7 个核苷酸，包含一个以上的 arginine 或 lysine 残留 基， 根据其带正电的结构推测，可能与细胞膜上带负电荷的双层磷脂层之间的交 互作用有关。 2. amino-terminal H-domain： 此区域接于 N-domain 之后，属疏水区，常形成 -helical 结构嵌插于细胞膜 中，在 C 端多有 hairpin-like 结构，使讯号序列嵌入细胞膜后形成 unlooping。平 均长度约有 17 个碱基。 3. amino-terminal C-domain： 此区域接于 H-domain 之后，包含有可能被讯号序列切割酶(signal peptidase； SPase)辨识之切割序列。在分泌蛋白质完全通过细胞膜的同时，其讯号序列受 SPase 作用，与蛋白质序列分离，使蛋白质完全分泌出去(图 2-7)。 由于革兰氏阳性菌细胞外围绕着庞大的细胞壁，如同一层分子筛，使其存在细胞 壁上的金属离子作用受限。这些金属离子是转位后蛋白质(post-translocational protein)修饰的决定因子，影响着新形成之分泌性蛋白质的折迭与稳定性(van Wely et al., 2001)。Dieye 等在 2001 年利用 L. lactis 菌体进行异源蛋白分泌测试， 也发现其蛋白的穿膜部位(transmembrane)， 取决于不同来源讯号序列及其融合蛋 白之间的电荷性。 菌体中讯号序列携带蛋白分泌的能力，则以同源性讯号序列较 异源性讯号序列为佳(Le Loir et al., 2001)。 三、讯号序列之选殖 讯号序列的选殖方式多利用探针载体(probe vector)作为基因选殖工具(Virolle et al., 1988；Sibakov et al., 1991；Hols et al., 1992；Hols et al., 1994；Poquet et al., 1998)。探针载体的设计常因选殖目的不同而变化(Smith et al., 1987)，其所必须 具备的条件如下述： 1. 质体复制区(replication region)： 探针载体需具备穿梭载体的特性，带有两种不同细菌之 replication region。 通常多先藉由 E. coli 进行初步细胞转形， 使 DNA 重组质体形成 supercoiled form， 再进一步转形进入主要菌体中， 以进行功能的侦测(Christiaens et al., 1992； Hols et al., 1994；Sibakov et al., 1991；Slos et al., 1998)。本试验依此原则，选用实验室 先前构筑完成之重组载体 pAmy vecter。此载体中包含有 E. coli 之 replication region (ori +)及乳酸杆菌来源之 replication region(Rep C)， 可供进行讯号序列之筛 选。 2. 载体筛选基因(selection marker)： 在探针载体中必须嵌插一段筛选基因，协助筛选出转型成功之菌落。本试验 所应用的探针载体，即包含有红霉素抗药性基因(erythromycin resistant gene)作为 筛选基因。 3. 报导基因(reporter gene)： 在探针载体中置入一段蛋白质的基因序列， 可以方便侦测其前方所嵌入的基 因片段是否具有功能性，此段蛋白基因序列即为所谓的报导基因 。目前较常 被使用作为报导基因的有 phoa、-amylase gene、TEM -lactamasegene 及 -glucuronidase gene (gus A)等(Virolle et al., 1988；Sibakov et al., 1991；Platteeuw et al., 1994；Poquet et al., 1998)，其中又以 -amylase gene 最为常见。报导基因 的选择，攸关探针载体的优劣。本试验是利用 -amylase gene 作为实验探针载体 之报导基因。 第五節 第六節 第七節 两阶段多套式聚合酶连锁反应(2-step multiplex polymerase chain reaction) 多套式 PCR，是在单一试管中加入不同目标 DNA 分子的专一性引子，经行 PCR 反应，同时获得大小不同的 PCR 产物。可于单一试管中进行不同病毒、细菌和 螺旋体等 DNA 的侦测(Soumet et al., 1999)，作为诊断与分析的依据，排除 PCR 检定常见之伪阳性或伪阴性。 本试验所采用的 2-step multiplex PCR， 是参照 Song (2000)等人所述，采用两组不同专一性引子进行两阶段的 PCR 反应，使 DNA 产 物之专一性提高，鉴别出基因序列相近的不同乳酸杆菌。 第二节 野鼠洛德乳酸杆菌的鉴定 一、革兰氏染色镜检 先于载玻片上滴加少许无菌水，以接种环钓取少许菌落布于上，加数滴结晶 紫染色 1 分钟，进行水洗；加数滴 iodine solution 固定染剂 2 分钟，以酒精褪染 30 秒，加数滴 safranin 染色 1 分钟，进行水洗后静置风干。利用光学显微镜放大 1000 倍，以油镜观察。菌落呈蓝紫色者为阳性，呈现桃红色者为阴性。 二、催化酶试验(catalase test) 挑取单一菌落，接种于 MRS 培养基中，于 37厌氧增菌 16 小时，将菌液涂抹 于载玻片上，滴加 3过氧化氢(H2O2)，产生大量气泡者为阳性反应，无气泡者 为阴性。 三、菌株生化特性的鉴定 利用 bioMrieux公司所生产之商品化套组 API 50 CHL(cat. NO.50410、 50300)，进行上述实验所分离之乳酸杆菌的生化特性测定。挑取单一菌落接种于 MRS(deMan-Rogosa-Sharpe；Difco)固体培养基上，以 37、厌氧培养 24 小时。 用无菌棉花棒刮取的菌落，置入 2 ml 无菌蒸馏水混合均匀。以玻璃吸管吸取菌 液滴入含有 5 ml 无菌蒸馏水玻璃试管中，调制成混浊度为 McFarland2 之菌， 并记取完成制备之滴数(n)。吸取原始菌液 2n 滴，滴入 API 50 CHL 培养液中， 混合均匀后即为试验用菌液。将试验菌液依序滴入 API 生化试验盘中，避免气 泡产生，盖上试验盘后培养于 37，分别于 12、24、48 小时记录结果。最后结 果送交代理厂商进行判读。 四、16S-23SrRNA 保留区的确认 1. 引子(primer)的设计 参照 Song 等人(2000)所述，利用特异性引子进行 two-step multiplex polymerase chain reaction(聚合酶连锁反应；PCR)，以鉴别洛德乳酸杆菌菌株。所 用之特异性引子序列如表 3-1。 表 3-1 供鉴定洛德乳酸杆菌菌株之引子序列(Song et al., 2000) Primer name Oligonucleotide sequence code(5-3) Tm 值值 LR check1f AAACCgAgAACACCgCgTT 54.5 LR check1r CCTCTTCgCTCgCCgCTACT 58.4 LR check2f CAgACAATCTTTgATTgTTTAg 49.3 LR check2r gCTTgTTggTTTgggCTCTTC 55.3 2. two-step multiplex PCR 用无菌牙签尖端从 MRS 固体培养基上沾取厌氧培养 12-16 小时的菌落，悬 浮于 DDW 中作为模版(template)， 分别将 LR check1f、 LR check1r 及 LR check2f、 LR check2r 两对引子加入不同两管中进行反应。反应总体积为 25 l，反应管中 依序加入： D.D.W 15 l 10PCR buffer 2 l 10dDTP mix(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 2m) 4 l Primer (forward & reverse) 各加 1 l Template 1 l Taq DNA polymerase(5U/l) 1 l 3. 琼脂凝胶电泳(agarose gel electrophoresis) 取 1 l 保存 PCR 产物与 6dye buffer(0.25bromopheno blue，0.25xylene cyanol FF，30glycerol)混合均匀后，注入 1agarose gel(agarose I；ameresco) 孔洞中，于装满 1TAE(Tris-acetate-EDTA；40mM Tris-acetate，1 mM EDTA)缓 冲液的 mini-gel 电泳槽(Mupid)中，以 100 V 电压进行电泳分析，并加入适当之 DNA 分子量标志(DNA marker)以辅助判读 DNA 样品。电泳结束后，将胶体转置 于含有 0.5 g/ml EtBr(ethidium bromide)水溶液中染色 10 分钟，继以清水浸泡 3 分钟退染后，于紫外光灯箱上，确定 DNA 产物分子量大小，与发表文献进行比 对。 三、菌株的保存 各菌株确认无误之后进行保存。钓取单一菌落加入 3 ml MRS 培养基中，于 37 行厌氧培养，隔夜抽取 0.5 ml 菌液与 3.5 ml 含有 25甘油之 LCMG 培养基混合 均匀，于-70中保存。 三、筛选启动子-讯号序列载体的制备 1.筛选用载体(screening vector)的来源 本试验所选用之表现分泌载体，是本实验室先前已构筑完成，包含有多重选 殖区(multiple cloning site, MCS；from pBluescriptSK phagemid, Startagene)、抗 药性筛选基因(erm80；from Lactobacillus reuteri)、ColE1 replication origin、rep32 replication origin(from Lactobacillus reuteri)，及淀粉酶报导基因(-amylase gene； from Bacillus licheniformis)的 pAmy vector， 属于大肠杆菌与乳酸杆菌间的穿梭表 现载体，可作为筛选启动子-讯号序列之用(林, 1999)。 2.制备筛选用载体 DNA 选取含有 pAmy vector 之 E. coli TG1(New England Biolabs, Maniatis et al., 1989)，用 5 ml 含有 160g/ml erythromycin 的 LB 培养基，于 37中行震荡隔夜 培养。隔日以 Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System(Viogene)进行质体的萃 取。方法如下：将培养完成之菌液以 12000 rpm、1 分钟离心，去尽上清液，加 入 4、250l MX1 buffer 打散菌块成悬浮液后，加入 250l MX2 buffer 上下混 匀 6 次，于室温中静置 5 分钟，加入 3501 MX3 buffer 充分混合后，于室温中进 行 12000 rpm、 10 分钟离心； 取上清液转置 Mini-MTM Column 中， 以 12000 rpm、 1 分钟离心，倒弃下层液，加入 500l WF buffer，以 12000 rpm、1 分钟离心，倒 弃下层液，加入 700l WS buffer，以 12000 rpm、1 分钟离心，倒弃下层液，以 12000 rpm、3 分钟离心，去尽残余的液体后，将 column 转置于新的微量离心管 中，加入预热之无菌去离子水，于室温中静置 2 分钟后进行离心，所得之下层液 即含有 pAmy vector 质体，可于 4保存备用。 四、构筑含不同启动子-讯号序列及 -amylase 基因的重组载体 1.PCR 产物的纯化 利用QIAquickGel Extraction Kit将PCR所得产物自agarose gel中回收纯化， 作为构筑质体之用。 其方法是： 于 agarose gel 电泳结束后， 以波长 260 nm 之 UV 确认 DNA 片段之位置及大小，用刀片切取目标 DNA 所在的胶体，转置微量离 心管中秤重。加入等同 3 倍胶体体积之 QG buffer，以加热器加热至 55，使胶 体完全溶解(约需 7-10 分钟)。胶体溶解完全后，加入 1 倍胶体体积量之 isopropanol (当 DNA 片段大于 500 bp 或小于 4 kb 时，可省略此步骤)。之后将 Buffer QG 与 DNA 的混和液转置 QIAqucik spin column 中，以转速 10000 rpm 离 心 1 分钟，丢弃滤液，再次将空 column 离心 2 分钟，以避免酒精残留。之后将 column 离心 1 分钟，丢弃滤液；加入 750 l elution buffer 静置 1 分钟，最后以 12000 rpm 离心 1 分钟，收集滤液并保存于-20中备用。 2.限制酵素(restriction endonuclease)之切割 将上述纯化过之各组重组载体核酸片段，以适当限制酶作用进行切割，反应 方式如下： 重组载体核酸片段 7 l 10 reaction buffer 2 l 适当切割酵素 2 l D.D.W. 9 l 总反应体积为 20 l，于 37水浴中作用 2-3 小时后，用 agarose gel 进行电泳， 将酵素切割后的线状 DNA 自胶体切下，并依前述之 QIAquickGel Extraction Kit 方法进行纯化。 3.接合作用(ligation) 取约 100 g 的纯化基因与 300 g 的载体 DNA 混合后，加入 1 l T4 DNA ligase (Protech)及 2 l 10ligation buffer，于 16水浴中作用 16-20 小时，进行 DNA 接合。 4.制备转型用(transformation)胜任细胞(competent cell) 本试验以 calcium chloride (CaCl2)方制备 E. coli TG1 为胜任细胞。其步骤如 下：挑取 E. coli TG1 单一菌落，接种至 3 ml LB broth，于 37、250 rpm 震荡隔 夜培养。以 1接种量吸取菌液加入 1 ml LB broth，于 37、125 rpm 震荡培养 1 小时(OD420=0.45-0.55)， 经低温离心沈淀菌块后， 去尽上清液。 加入 150 l、 100 mM MgSO4，温如冲散菌块后，以 4、8000g 离心 5 分钟，去尽上清液。加入 200 l、100 mM CaCl2温如冲散菌块，悬浮菌体，置于冰浴中备用。 5.转型作用 取 200 l 胜任细胞与 20l 接合完成的重组质体(DNA 量小于 5胜任细胞量 为佳)均匀混合，冰浴 30 分钟，再以 42、90 秒进行热休克(heat shock)转型后， 迅速冰浴 2 分钟，随即加入 800 l 回温之 LB 培养基，于 37、200 rpm 震荡培 养 1 小时。之后以 6000 rpm、2 分钟离心，抽弃 800 l 上清液，再以 200 l LB medium 悬浮菌块，继以玻棒涂布菌液于含有 160 g/ml erythromycin 之 LB 培养 基上，并置于 37中培养 12-16 小时。 6.重组质体之筛选(screening) 挑选转型作用后，在培养基形成之白色单一菌落，接种至 3 ml 含 160g/ml erythromycin 之 LB 培养基中，于 37中震荡隔夜培养，收集菌块并依前述质体 抽取方式萃取重组载体，用琼脂胶电泳确认是否有质体存在。 7.重组质体崁入片段之鉴定 取部分重组载体，用原来的限制酵素进行切割作用后，以琼脂凝胶电泳分析 DNA 片段大小是否与崁入 DNA 相符。另外取 1 l 之 DNA 滤液做为模版，使用 原来的引子进行 PCR 反应确认。初步确定重组质体无误，将重组质体送交中兴 大学生科中心进行核酸定序，比对核酸序列与文献发表者是否相符。 二、电孔(electroporation)转型重组载体至洛德乳酸杆菌 1.制备电孔用胜任细胞 本试验以 L. reuteri DSM 20016 作为电孔转形的胜任细胞， 原因为本菌不含质 体且对 erythromycin 非常敏感。 其实验步骤如下： 首先由-70钓取菌种至 LCMG agar plate，以 37厌氧培养。待菌落生成后，钓取单一菌落至 3 ml MRS 培养基 中，于 37厌氧隔夜培养。隔日取 1 ml 菌液加入 9 ml MRS broth 中，于 37厌 氧培养 2 小时， 使 OD595达 0.7-0.8。 以 4、 5000 rpm 离心 15 分钟(JA20 raffinose electropoporation buffer；1 mM Hepes、0.5 M raffinose、1 mM MgCl2，pH 7.0)充 分悬浮菌体，洗去培养基，之后进行 4、5000 rpm 离心 15 分钟，收集菌体。 加入 85l 预冷之 HER buffer 悬浮菌体，置于水浴中备用。 2.电孔转型 挑选具有分泌 starch 功能之 E. coli TG1 菌株，依前述方述，用 Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System (Viogene)抽取质体，作为电孔转型用之质体 DNA。取制备完成之胜任细胞 85 l，加入 15 l 约 20g 的质体 DNA，混如均匀 后小心注入预冷的 0.1 cm 电击管(cuvette)，避免气泡产生。冰浴 3 分钟后，将电 击管置入电击器(Gene Pulser, Bio-Rad)， 以电压1250伏特、 电容25F及电阻400 之条件进行电击，电击之 constant time 最好于 3 至 5 msec，以达最佳电孔效率。 电击后即刻加入1 ml含诱导量erythromycin (0.1g/ml)的MRS medium， 置于37 中培养 2 小时，以利 erm80 基因表现。之后加入含抑制量 erythromycin (10g/ml) 的 4 ml MRS medium， 置于 37厌氧培养，并于 48 小时内判定。如有细菌生长， 即表示细菌已具有抗红霉素的能力，并以表 3-2、表 3-3 中所列的各组特异性引 子进行 PCR 反后，确认菌株中的重组质体是否正确。 三、重组载体在洛德乳酸杆菌的 -amylase 活性分析 挑取确认含有重组质体的 L. reuteri DSM 20016 之单一菌落，接种至含 1 starch、 10g/ml erythromycin 的 LCMG agar plate 上， 于 37中厌氧培养 48 小时。 侦测在L. reuteri DSM 20016菌体中的重组质体， 是否具有分泌-amylase的能力， 可分解培养基中的 strach，形成透明分解环，并利用碘液染色排除伪阳性反应。 五、植酸酶重组载体的蛋白质胶体电泳分析 1.蛋白质样品的制备 挑取 E. coli BL21 (DE3)转型株单一菌落，接种至 1.5 ml、含 30g/ml kanamycin 的 LB 培养基中，于 37中震荡隔夜培养。隔日以 8000 rpm、4离 心 15 分钟后收取菌体，加入 150 l 之 2sample buffer，以 200l 之 pipet 充分混 和后，于 95煮沸 5 分钟。完成后即刻将样品转置 4冰浴 2 分钟。于室温中以 12000 rpm、3 分钟离心，取上清液进行蛋白质胶体电泳分析。 2.Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamine gel eclectroporesis (SDS-PAGE) 本试验利用 Mini-PROTEAN电泳槽(Bio-Rad)进行蛋白质胶体电泳分析 (SDS-PAGE)分析。方法如下：首先将制备完成之 12分离胶(separating gel；见 附录)注入组装完成的两片玻璃间，上方覆盖水层，于室温中静置 30 分钟。待胶 体凝固，注入 5固型胶(stacking gel；见附录)，小心置入齿梳(comb)，静置 20 分钟待胶体凝固，取出齿梳，以滤纸清除孔洞中的气泡。加入与待测蛋白质等量 的 2 倍 sample buffer，于 95煮沸 5 分钟后冰浴 2 分钟，再进行 10000g、1 分 钟离心。电泳槽架置完成后，加入 running buffer(见附录)，注入蛋白质样品。以 固定电压(stacking gel-65V，separating gel-110V)进行电泳。电泳完成后，取下胶 体，以 Comassie blue-R250 染色 1 小时后，以脱色液 destain buffer(见附录)进 行脱色 30 分钟后，再转置于脱色液 destain buffer (见附录)中进行隔夜脱色， 于隔日取出胶片风干保存观察。比对分子量标志，分析其分子量大小。 六、重组植酸酶蛋白的西方墨渍法分析(Western blot) 本试验使用 Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell (Bio-Rad)进行西方 墨渍法分析。所使用的一次抗体为：HisTag monoclonal Ab (Novagen)。二次 抗体为：Alkaline phosphatase conjugated goat anti-mouse IgG (Sigma)。将电泳完 成之 SDS-PAGE 取下， 剔除 stacking gel， 与裁切成略大于胶片的 6 张 Whatman 3 mm 厚滤纸及以甲醇浸泡过之 PolyScreen PVDF transfer membrane (MENTM Life Science Product, Inc)依序迭齐，先以 transfer buffer (见附录)浸湿，迭上海绵垫并 排除气泡，置入转渍夹组装进 buffer tank，倒入 transfer buffer，并放入含冰块的 Bio-Ice cooling unit，移至 4冰箱，以 100 伏特电压进行 1 小时电泳，使胶片上 的蛋白质转印到 PVDF membrane 上。将转印完成的 PVDF membrane 置于 10 ml blocking buffer(TBS 含 5 skim milk)中， 于 4冰箱中作用隔夜； 第二天用 20 ml TBST(TBS 含 0.05 Tween-20)清洗 3 次，每次 5 分钟；加入以 dilution buffer(TBST 含 0.5 skim milk)稀释 2000 倍的一次抗血清， 于室温感作 2 小时； 用 TBST 清先 3 次， 每次 5 分钟； 加入用 dilution buffer 稀释 2000 位的二次抗体， 室温作用40分钟； 用TBST清洗3次， 每次5分钟， 最后用TBST(20 mM Tris-HCl， 140 mM NaCl，pH 7.5)清洗 5 分钟，避免清洁剂残留。加入 1-StapTM NBT/BCIP(Pierce)呈色剂，于室温中反应，直至 PVDF membrane 呈现适当颜色， 即加入蒸馏水终止反应，烘干 membrane 后即可保存。 第八节、构筑含不同启动子-讯号序列及植酸酶基因的重组载体 一.菌株的来源 随机挑选前述分离的野鼠洛德乳酸杆菌菌株 2 株及洛德乳酸杆菌标准株 DSM20016 作为宿主细胞进行测试。 二.植酸酶重组载体的来源 采用 3 个不同分泌表现载体，包括前述试验结果中，分泌功能最佳的讯号序 列-nlp 表现分泌载体(pESV-nlp)，及本实验室吴志铭学长所构筑之重组载体 pESV-201 vector、pESV-203 vector。此 3 个载体均包含有多重选殖区(multiple cloning site；MCS；from pBluescript Startagene)、抗药性筛选基因(erm80；from Lactobacillus reuteria)、Co1E1 replication origin、rep32 replication origin(form Lactobacillus reuteri)， 为大肠杆菌及乳