全内反射荧光显微镜TIRFM介绍.pdf

全内反射荧光显微镜系统全内反射荧光显微镜系统 Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) PDF created with pdfFactory Pro trial version PDF created with pdfFactory Pro trial version 全内反射是一项依赖于消逝波的技术。全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射：的光线几乎被完全反射： c= sin- 1(n2/n1) n1 n2 消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有典型的有效照明下渗透度只有50nm到到100nm 只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。被激发。远场分子不受激发。 TIRFM 原理原理 q 高折射率高折射率 低折射率低折射率 PDF created with pdfFactory Pro trial version PDF created with pdfFactory Pro trial version 荧光观察图像景深范围荧光观察图像景深范围 LSM 聚焦位置聚焦位置 CCD TIRFM PDF created with pdfFactory Pro trial version 棱镜型棱镜型TIRFM Vs 物镜型物镜型TIRFM 安装简单 高数值孔径物镜 安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制 可用于微分干涉观察DIC 高数值孔径物镜 可连接原子力显微镜AFM 可用于显微注射和膜片钳实验 OLYMPUSOLYMPUS PDF created with pdfFactory Pro trial version 物镜物镜物镜物镜 盖波片盖波片盖波片盖波片 激光激光激光激光 宽场荧光照明宽场荧光照明宽场荧光照明宽场荧光照明 全内反射照明的切全内反射照明的切换换 PDF created with pdfFactory Pro trial version 改变入改变入射激光角度射激光角度改变入改变入射激光角度射激光角度 物镜物镜物镜物镜 盖波片盖波片盖波片盖波片 激光激光激光激光 全内反射照明的切全内反射照明的切换换 PDF created with pdfFactory Pro trial version 物镜物镜物镜物镜 盖波片盖波片盖波片盖波片 激光激光激光激光 全内反射照明的切全内反射照明的切换换 PDF created with pdfFactory Pro trial version 全内反射照明的切换全内反射照明的切换 物镜物镜物镜物镜 盖波片盖波片盖波片盖波片 全内反射照明全内反射照明全内反射照明全内反射照明 激光激光激光激光 PDF created with pdfFactory Pro trial version 光路结构光路结构 光光纤纤光纤光纤 激光激光 物镜物镜 视视场光场光栏栏 微微分分尺尺 PDF created with pdfFactory Pro trial version 如何得到消逝波如何得到消逝波 対物 镜镜油油 （ （n01.52 for PLAPO60XOTIRFM） （ （n01.78 for APO100XOHR ） ） 盖波片盖波片 （ （n11.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n11.78 for APO100XOHR ） ） d C max D 标本标本折射率折射率 水水n=1.33 细胞细胞内内液液 n=1.38 消逝波消逝波 发发生条件生条件 n c (TIR angle) sinc = n2/ n1 n n1(Cover glass) n2(Medium) PDF created with pdfFactory Pro trial version 全内反射为何需要高数值孔径的物镜全内反射为何需要高数值孔径的物镜 n光束容易校准光束容易校准 0.21mm0.21mm0.04mm0.04mm 100 x100 x NA1.65NA1.65 100 x100 x NA1.4NA1.4 细胞细胞内内液液 (n=1.38) 水水 (n=1.33) n全内反射角度全内反射角度调节调节范围范围更大更大 n数值孔径越大数值孔径越大，分，分辨辨率率越越高高 n数值孔径大数值孔径大，有，有更多更多的激发光的激发光强强 可以用来产生可以用来产生全反射全反射 PDF created with pdfFactory Pro trial version PDF created with pdfFactory Pro trial version 全内反射的深度全内反射的深度 Evanescent wave 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 050100150200 Distance (nm) Relative Intensity E (1.65) E (1.45) PDF created with pdfFactory Pro trial version TIRFM 激光激光共共聚焦聚焦 优优 势势 实时动态实时动态图像，图像，速速度度快快 深度深度大约大约100nm 高高信噪比信噪比 单单分子荧光分子荧光信号探测信号探测 可得可得到到 Z 轴轴光光学学切片切片 可实现三维重构可实现三维重构 劣劣 势势 只能观察盖波片只能观察盖波片和细胞膜和细胞膜 表面表面 非实时动态非实时动态 信噪比没信噪比没有有 TIRFM 高高 TIRFM vs 激光激光共共聚焦聚焦 PDF created with pdfFactory Pro trial version 全内反射应用全内反射应用 细胞表面观察细胞表面观察 D. Axelrod Cell/Substrate Contact / W. Reichert 胞吞胞吞/胞吐现象胞吐现象 Exocytosis of single secretory granules in live cells using acridine orange / W. Almers 单分子荧光信号探测单分子荧光信号探测 Using NA1.65 Objective Lens/ Dr. Terakawa Myosin, Actin with Cy3 labeled ATP / T. Yanagida 钙离子通道实时监测钙离子通道实时监测 (w/ High Speed Camera) Using Ca- green / M. Morad PDF created with pdfFactory Pro trial version Dr. S. Simon, J. Schmoranzer / Rockefeller Univ. Dr. Axelrod / Univ. of Michigan PDF created with pdfFactory Pro trial version DiI染色的染色的Hela细胞细胞 TIRFM FLM PDF created with pdfFactory Pro trial version DiI染色的神经元染色的神经元 TIRFM FLM PDF created with pdfFactory Pro trial version S. Simon et. al/Rockefeller Univ. PDF created with pdfFactory Pro trial version 全内反射荧光显微镜的基本组成全内反射荧光显微镜的基本组成 高级研究级显微镜高级研究级显微镜 一一般般为为倒倒置置显微显微镜，镜，配配荧光照明荧光照明器、器、高高数值孔径数值孔径的物镜的物镜 TIRFM照明器照明器 通通过过光光纤纤接接入入激光，激光，并对并对激光激光入入射射方向进行控制方向进行控制，通通过过L型照明型照明器器实现实现 和和荧光照明荧光照明器器一一起从起从荧光荧光通道通道进进入显微入显微镜镜 激光器激光器 根据根据实实验验要要求选择求选择，可以可以接接入单入单激光激光器或者器或者多多激光激光系统系统 检测系统检测系统 应应选择选择高高灵敏灵敏度度制冷制冷CCD，要要求求CCD量量子效能高，能够子效能高，能够对极弱对极弱荧光荧光进行进行 捕捉捕捉，具具有上有上千倍千倍的的信号信号放放大大功功能，能，如如果果是是对对快速快速荧光荧光信号信号进行捕捉则进行捕捉则 还还需要需要高高速速CCD PDF created with pdfFactory Pro trial version 从紫外到近红外（从紫外到近红外（UVNIR）都提供更优异的透过性能）都提供更优异的透过性能 UIS2无限远光学校正系统无限远光学校正系统 PDF created with pdfFactory Pro trial version 荧光 全球首次引入离子镀膜技术荧光 全球首次引入离子镀膜技术 “最明亮的荧光显微镜”“最明亮的荧光显微镜” PDF created with pdfFactory Pro trial version 双层双层V型光路、多光口输出型光路、多光口输出IX2 最符合亚洲人操作习惯的亚洲人机 工学设计，和前端操作设计 内置多层光路 前置面板操作 PDF created with pdfFactory Pro trial version TIRFM专用高数值孔径物镜专用高数值孔径物镜 APO100XOHRPLAPO100XOTIRFM NA 1.65 (WD 0.1mm) NA 1.45 (WD 0.1mm) 数值孔径数值孔径1.65 工作距离工作距离0.1mm 数值孔径数值孔径1.45 工作距离工作距离0.1mm PLAPON60XOTIRFM NA 1.45 (WD 0.1- 0.16mm, Cover glass thickness 0.13- 0.19mm) 数值孔径数值孔径1.45 工作距离工作距离0.1- 0.16mm 可校正盖波片厚度可校正盖波片厚度0.13- 0.19mm 可校正温度的影响可校正温度的影响23- 37 PDF created with pdfFactory Pro trial version TIRFM和荧光照明器共用和荧光照明器共用 PDF created with pdfFactory Pro trial version UV 405 -440nm 新新的的半导体半导体激光激光器器: UV 405/440nm 半导体半导体激光激光器器 (应用应用于荧光分子于荧光分子漂白漂白和和CFP荧光图像荧光图像) VIS 458 -473 -488 -515 -543 -559 -635 nm 多谱线多谱线Ar 离子激光器和新的半导体激光器离子激光器和新的半导体激光器 多条激发光谱线可供选择多条激发光谱线可供选择 PDF created with pdfFactory Pro trial version 背感背感光光、高高量量子效率，子效率，90% 芯芯片片增益增益EMCCD，不，不放放大大读出读出噪噪音音 高高速速度，全度，全幅幅30fps，最最高高300fps以以上上 低低温制冷温制冷CCD Rolera- MGi 高高灵敏灵敏度度冷冷CCD - - -EMCCD EM CCD在在以以下下应用应用具具有有无无可比可比拟拟的的优势优势： 1。单单分子分子成成像：像：Single molecule imaging 2。全内反射：全内反射：Total internal reflection 3。转盘式转盘式共共聚焦：聚焦：Spinning Disk 5。Ca等等的的离离子子测测定定 6。快速时快速时间序列间序列的荧光的荧光3D成成像像 PDF created with pdfFactory Pro trial version CCD 获得增益的三种常用方法获得增益的三种常用方法 EM CCD ！ 1.后期电路放大（后期电路放大（Gain） 2.像增强器（像增强器（Intensified CCD） 3.芯芯片上片上放放大大技术（技术（On- Chip Multiplication Gain） PDF created with pdfFactory Pro trial version 世界第一家世界第一家TIRFM技术厂家技术厂家 世界最高分辨率物镜世界最高分辨率物镜NA=1.65 世界唯一世界唯一TRIFM+Confocal集成系统，结合了两者的优势集成系统，结合了两者的优势