丙肝病毒分子分型方法.ppt

HCV分子分型方法,陈长荣ID:21620101152367,丙肝病毒HCV,1975年,英国Lancet杂志首次使用非甲非乙型肝炎这个名词1989年,HCVcDNA克隆成功,并正式命名HCV1991年国际病毒命名委员会(ICTV)将HCV归为病毒科丙型肝炎病毒属,HCV全球分布情况,HCV基因,其基因组为单股正链RNA,易变异。全长9.6kb341b的5非编码区(5NTR,NCR,UTR)27b的3非编码区(3NRT)。在病毒复制中,氨基酸有三个蛋白(C、E1、E2/NS1)羧基端有4个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5),HCV基因分型分类系统,不同的研究者建立并使用各自的HCV分类系统主要的命名系统有:Chan系统、Simmonds系统、Okamoto分类系统、Kanazawa命名系统第二届HCV与相关病毒国际讨论会议上,制定了统一的命名系统-Simmonds系统,目前认为主要有6种HCV基因型及不同亚型,以阿拉伯数字表示HCV基因型,以小写的英文字母表示基因的亚型(如1a、2b、3c等)。,HCV基因型分布,北美:1,3,2南美:1,2,3欧洲:1,3,2非洲:2,1,3,4,5,6亚洲:2,1,3,4,6中东:4中国：1b，2，6,HCV基因分型区域的选择,最准确的方法就是对基因组的某个区进行PCR扩增、测序及进化树分析,选择的区有NS5、Core、E1和5UTR通常建立在5UTR,因为该区是HCVRNA诊断实验的常用区域,基因分型的分子学方法,（1）测序法：测全长或片段金标准费时费力不适于临床,（2）基因型特异性引物PCR法,Okamoto等首先采用分型的效果仍比较差需使用7对引物,OkamotoHetal.JGenVirol.(1992)TypinghepatitisCvirusbypolymerasechainreactionwithtype-specificprimers:applicationtoclinicalsurveysandtracinginfectioussources.,(3)型特异性探针杂交(LIPA),将生物素或荧光素标记型特异性探针固化相化在膜或芯片与RT-PCR扩增的病毒产物进行杂交是建立在5非编码区基础上有5%10%的1a、1b型不能鉴别,也不能区别2a和2c型。,StuyverL，WyseauA，MaertensG，etal.SecondgeneradonlineprobeassayforhepatimCvirusgenotypingJjourhalofClinicalMicrobiology，1996；34：2259,HCVgenotypesinNorthernItaly:asurveyof1368histologicallyprovenchronichepatitisCpatients,(4)限制性片段长度多态性分析(RFLP)法:,用能识别特定酶切位点的限制性内切酶将PCR扩增的片段切割成不同长度的片段该方法常用的酶为HaeIII、RsaI、MvaI、HinfI、ScrfI该方法检测基因型的精确度为97不能区分所有的HCV基因亚型也不能识别在泰国和越南发现的变异基因型，,DavidsonF,SimmondsP,FergusonJC,etal.SurveyofmajorgenotypesandsubtypesofhepatitisCvirususingRFLPofsequencesamplifiedfromthe5non-codingregion.JGenVirol,1995,76:1197-1204.,(5)遗传发育关系进化树,对一定区域的样本测序结束后可将序列互相比较分析样本间序列的进化距离,画出该区域内HCV流行的关系进化树,观察HCV在区域内的分子流行情况及特点,（6）特异引物错配延伸法(PSMEA)：,利用taq酶在引物3末端发生错配时无法继续延伸借助荧光测量仪检出错配峰出现的频率达到分型目的该方法成为检测混合HCV基因型感染的方法比直接测序灵敏度高20倍,AntonishynNA,AstVM,McDonaldRR.etal.RapidgenotypingofhepatitisCvirusbyprimer-specificextensionanalysisJ.ClinMicrobio,l2005,43:5158-5563.,（7）异源分子迁移率法（HMA）：,用已知不同型的HCV参比DNA与未知基因型的HCV的DNA分子混合、变性、退火,形成同源、异源分子,这些分子在PAGE中迁移率不同,并同异源DNA中不同碱基的数目成比例,来鉴定基因型王林,徐东平,张灵霞.丙型肝炎病毒基因型分型及临床意义J.肝脏2006,12:416-417.,（8）COMA基因分型法：,原理是基于长异源双链的解链特性不同用已知的序列顺序的参考DNA捕获液相中未知的DNA两者形成异源双链杂交体，由这个杂交体的两条单链间解链曲线的差异可以推断出其序列差异,GenotypingHIV-1andHCVstrainsbyacombinatorialDNAmeltingassay(COMA).KostrikisLGetal.MolMed.(1998),（9）Taqman探针实时PCR测试法,这一方法用到了Taqman探针(针对5UTR)结合荧光实时PCR,MLindh，HarmounCGenotypingofhepatitisCvirusbyTaqmanrealtimePCIKJournalofClinicalVirology，2005；34：