分子生物学常用技术.ppt

第二十二章,常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication,第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology,核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。,一、分子杂交与印迹技术的原理,复性,RNA,DNA,（一）印迹技术（二）探针技术,探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,（二）RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,WesternBlotting方法一,直接法：优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,WesternBlotting方法二,间接法：优点：1.信号放大，2.灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择4.免疫特异性不受标记影响5.可选择不同的Marker缺点：1.有交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化,Y,Y,SuperSignal底物与二抗HRP反应发光,5,SuperSignal,HRP标记二抗与一抗蛋白复合物结合,4,2,漂洗和封闭,1,电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上,3,一抗与蛋白结合(小鼠单抗或兔多抗),间接WesternBlotting操作流程:,其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip),第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction,5,Primer1,5,Primer2,5,5,TemplateDNA,一、基本工作原理,目录,目录,模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+,二、PCR体系基本组成成分,三、PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析,四、PCR的主要用途,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术,实时PCR技术原理,目录,三、DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序结果举例,目录,基因文库GeneLibrary,第四节,基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary),基因文库(genelibrary),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,基因组DNA文库,目录,第六节遗传修饰动物模型的建立及应用,TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel,转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)目的基因的受体动物,一、转基因技术,目录,核转移技术即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。,二、核转移技术,基因剔除技术也称基因靶向(genetargeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。,三、基因剔除技术,四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用,建立动物模型单基因决定疾病模型基因剔除获得性突变(gain-of-functionmutation)多基因决定疾病模型,第七节生物芯片技术,BiologicalChipTechnology,DNA芯片(DNAchip)cDNA芯片(cDNAchip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。,一、基因芯片,基因芯片(genechip),目录,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片(proteinchip),第八节蛋白质相互作用研究技术,ResearchTechnologyofInteractionofProtein,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,蛋白质之间相互作用研究的重要性,酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等,常用