高效液相色谱法

第八章 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节 概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。高效液相色谱法按固定相不同可分为液液色谱法和液固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液液色谱）和吸附色谱法（液固色谱）等。目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）是最常使用的化学键合相。根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。中国药典中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。一、 高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传质阻力小，分离效率高。早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备，液膜厚度df大，这和GC一样，会大大降低色谱柱的柱效。现代HPLC填料大多采用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。高效固定相会带来什么新问题呢？使用高效填料带来两个新问题：一是柱流动阻力大大增大，因此需要采用高压泵输液；二是表面能很大，要采用专业的装柱技术。高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。高效液相色谱的原理与经典液相色谱相同，但是它采用了高效色谱柱、高压输液泵和高灵敏度检测器。因此，高效液相色谱的分离效率、分析速度和灵敏度大大提高。定量准确，达到可与GC相媲美的分离分析性能。特别是结合计算机技术，HPLC已成为高度自动化和智能化的现代分析仪器。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长，例如柱长170，柱内径0.9，流动相速度303/h，约需20多小时才能分离出20种氨氨基酸；而用高效液相色谱法，只需1小时之内就完成。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送，色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料（几微米至几十微米）填充而成，均匀、规则的固定相，传质阻力小，分离效率高。柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或100几十万），同时柱后连有高灵敏度的检测器，使分析灵敏度比经典色谱有较大提高。例如，用紫外检测器最小检测限可达到10-9g，而荧光检测器则可达到10-11g。虽然气相色谱法是一种很好的分离、分析方法，它具有分析速度快、分离效能好和灵敏度高等优点。但是气相色谱仅能分析在操作温度下能汽化而不分解的物质。据估计，在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物约占15，加上制成衍生物的化合物，也不过20左右。由于大量有机物、离子型化合物易受热分解或失活物质不能用GC分析，因此需要发展HPLC。对于高沸点化合物；难挥发及热不稳定的化合物、离子型化合物及高聚物等，很难用气相色谱法分析。为解决这个问题，70年代初发展了高效液相色谱。由于高效液相色谱法具有以上特点，它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大（大于400）的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物，而这些物质占化合物总数的75-80%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐类的分离和分析。但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面，目前还不如气相色谱法。此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。二、高效液相色谱法与气相色谱法比较HPLC的保留值等色谱分析有关术语以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率方程H=A+B/u + Cu式中：纵向扩散项（分子扩散项）B/u对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。气相色谱（GC）的流动相流速u增大时，板高H显著增大（即柱效显著降低），而液相色谱（LC）的流速增大时，板高增大不显著（即柱效降低不显著）。这说明高效液相色谱也有很高的分离效能。HPLC可分离分析高极性、高分子量和离子型的各种物质 。柱效很高，每米可达3万块以上，一般用20 - 25cm长的柱子，由于固定相的不断改进，最短的只有3cm ，理论板数可达3000-4000，能满足一般分析的需要，而且具有很高的分析速度。柱子短，对压力要求就低。过去高压，现在追求高精度、高稳定性，一般在室温下操作，样品不需预处理，操作方便，容易掌握。液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：（一） 应用范围不同液相色谱非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的7080%。（二） 流动相不同气相色谱的流动相载气是色谱惰性的永久性气体，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相是各种低沸点有机溶剂及水溶液。也参与样品分子相互作用，因此液相色谱流动相的作用比气相色谱大。气相色谱的载气仅数种，其性质差别也不大，对分离效果影响也不大。而液相色谱的流动相种类多，性质差别也大，对分离效果影响显着。因对于LC来说，流动相的选择很重要，为提高选择性增加了一个因素。液相色谱也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。（三） 液相色谱分离类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。液相色谱能完成难度较高的分离工作。就其分离机理的不同，高效液相色谱可分为液固吸附色谱、液液分配色谱、 离子交换色谱和凝胶渗透色谱等多种类型。液固色谱的色谱柱内填充固体吸附剂，由于不同组分具有不同的吸附能力，因此，流动相带着被测组分经过色谱柱时，各组分被分开。液液色谱的流动相和固定相都是液体。作为固定相的液体涂在惰性担体上，流动相与固定液不互溶。当带有被测组分的流动相进入色谱柱时，组分在两相间很快达分配平衡，由于各组分在两相间分配系数不同而彼此分离。以非极性溶液作流动相，极性物质作固定相的液液色谱叫正相色谱；极性溶液作流动相，非极性物质作固定相的液液色谱叫反相色谱。离子交换色谱的色谱柱内填充离子交换树脂，依靠样品离子交换能力的差别实现分离。而凝胶色谱是按试样中分子大小的不同来进行分离的。在上述四类色谱中，应用最广泛的是液液色谱。液相色谱作为分析时选择余地大，而气相色谱达不到。（四） 气相色谱一般都在较高的温度下进行分离分析，而液相色谱通常在室温条件下操作。（五） 柱外效应:由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，HPLC的柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。（六） 制备:液相色谱不仅可用于分离分析，还可用于制备纯样品。液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备样品。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。（七） 检测器等:液相色谱尚缺乏高灵敏度、通用型的检测器，液相色谱柱子昂贵，要消耗大量溶剂，液相色谱仪器比较复杂，操作严格。价格也较气相色谱仪昂贵，主是因为采用了高压泵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。表8-1 HPLC与GC的比较HPLCGC进样方式样品制成溶液样品需加热气化流动相流动相可分为离子型、极性、非极性、溶液，可与被分析样品发生相互作用，能改变分离的选择性。是气体，不与被分析样品发生相互作用。固定相分离类型多，如吸附色谱、分配色谱、 离子交换色谱、排阻色谱、亲和色谱等，可供选择的固定相种类繁多。分离类型有吸附色谱、分配色谱，可供选择的固定相种类较多。检测器通用型检测器：UVD，PDAD，FID，ECD选择性检测器：ELSD，RID通用型检测器：TCD，FID选择性检测器：ECD，FPD，NPD应用范围可分析高沸点，高分子有机化合物；离子型无机化合物；热不稳定，具有生物活性的生物分子。可分析低分子量、低沸点有机化合物；永久性气体；配合裂解技术可分析高聚物。三、高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要分离类型有液固色谱法（吸附色谱法）；液液分配色谱法；化学键合相色谱法；离子交换色谱法；凝胶色谱法（体积排阻色谱法）。其他色谱类型有：亲合色谱法（affinity chromatography(AC)）；手性色谱法（chiral chromatography(CC)）；胶束色谱法（micellar chromatography(MC)）；电色谱法（electrochromatography(EC)）。第二节 高效液相色谱基本理论高效液相色谱的基本理论和定性定量分析方法与气相色谱基本相同。在气相色谱法中表达分离过程的许多基本关系式，绝大部分适用于高效液相色谱法。一、 保留值基本关系式tR=tR+tM (8-1)保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间，不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间，因此保留时间是色谱分析法的重要参数。保留时间由物质在色谱中的分配系数决定： tR=tM (1+KVs/VM)= tM (1+K/)= tM (1+k) (8-2)=VM/Vs (8-3)k=K/= (tR-tM)/ tM (8-4)(8-1)式中tR表示某物质的保留时间，tM是色谱系统的死时间，即流动相进入色谱柱到流出色谱柱的时间，这个时间由色谱柱的孔隙、流动相的流速等因素决定。(8-2)式中K为分配系数，Vs、Vm 表示固定相和流动相的体积，为相比率。k为溶质在色谱柱中分离后的容量因子。k是决定组分保留的关键数值，在HPLC中，测k值不像GC中那么容易，因为要找到一种完全不被保留的组分来测死时间是非常困难的，现在常用的方法是：在吸附色谱中，使用比流动相极性更弱的溶剂作为样品；在分配色谱中，使用重水（D2O）作为样品。总之，在液相色谱中死时间的测定是一个既重要，又没有完全解决的问题。 (8-5)(8-5)式中为分离因子，表示在相同的条件下，两个相邻组分的调整保留值之比，表征了色谱柱分离的选项择性。二、 柱效基本关系式理论板数 (8-6)理论板高 (8-7)有效板数 (8-8)有效板高 (8-9)基于热力学的塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。根据流出曲线方程人们定义色谱柱的理论塔板高度为单位柱长度的色谱峰方差：H=L/u =2 理论塔板高度H越低，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。决定理论塔板高度的因素有：固定相的材质、色谱柱的填充物的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。 塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。如塔板理论认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有径向扩散，这些都是不符合色谱柱实际情况的，因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱效，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。三、相邻组分分离度的基本关系式 (8-10)分离度还可表示为 (8-11)理论板数可表示为 (8-12)保留时间可表示为 (8-13) (8-14)式中，u为流动相平均线速度，表示流动相沿色谱柱轴向移动的平均线速度，单位为cm/s。式(8-14)表明，tR是分离度R、相邻组分的分离因子、组分的容量因子k、色谱柱的理论板高H和流动相平均线速度U等因素的函数。其中K和与色谱过程的热力学因素相关；H和u与色谱过程的动力学因素相关。分离度R既与热力学因素相关，也与动力学因素相关。由此也可看出保留时间tR是色谱分析中表征在一定的色谱柱上，溶质在分离过程分离特性的重要参数，式(8-14)也是讨论高效液相色谱分离操作条件优化的关键方程式。四、高效液相色谱的速率理论传质阻力本质上是由达到分配平衡的速率带来的影响。实际体系中，组分分子在固定相和流动相之间达到平衡需要进行分子的吸附、脱附、溶解、扩散等过程，这种过程称为传质过程，阻碍这种过程的因素叫做传质阻抗。在理想状态中，色谱柱的传质阻抗为零，则组分分子流动相和固定相之间会迅速达到平衡。在实际体系中传质阻抗不为零，这导致色谱峰展宽，柱效下降。 在气相色谱中Van Deemter方程形式为： H = A +B/ u + C u (8-15)其中H为塔板数，A为涡流扩散系数，B为纵向扩散系数，C为传质阻抗系数，u为流动相流速。在高效液相色谱中，在液体流动相驱动下实现各个组分的分离，此过程与气相色谱法相似，Van Deemter方程也一样，但液体与气体流动相在影响色谱峰扩展上有明显差别。如表8-2所示，液体扩散系数比气体约小104倍，黏度比气体大100倍，密度比气体大1000倍。表8-2 液体与气体流动相的差别性质/流动相液体气体扩散系数D(CS)10-510-1密度(gmL)110-3黏度(mPa.s)110-2雷诺数Re10010雷诺数Re是流体在管道内，内摩擦流动的一项重要指标。Re=v.d./其中：v介质线速；d管道内径；介质密度；介质黏度。层流：Re2320；湍流：Re2320影响分离的主要因素有流动相的流速、性质和极性。因为流动相液体的黏度比气体要大一百倍，密度是气体的一千倍，故降低传质阻力是提高LC柱效主要途径。气相色谱法中流动相与固定相之间的相互作用可忽略不计，而在液相色谱法中流动相与固定相之间的相互作用是不能忽略的。（一） 影响色谱峰形扩展的各种因素影响谱带展宽主要由涡流扩散、分子扩散和传质三部分组成，但是，由于流动相物理性质的差别很大。每一种扩散对板高的贡献，在GC和HPLC中是不同的。由于溶质在液谱中扩散系数比在GC中小104，加上液相色谱柱填料的颗粒度一般小于10m，所以，涡流扩散、分子扩散对板高的贡献，相对GC是较小的，相对来说，传质的影响大些。与GC不同，HPLC有其特点，因而其速率理论的表述方式也有区别：(8-16) (8-16)式中各项分别为：涡流扩散项、分子扩散项、传质阻力项（固定相、流动流动相和滞留流动相）。表达如下：1涡流扩散项 A=2dp是不均匀因子，表达了色谱柱填充的均匀程度，当固定相为40-50m时，值为1-2。dp为固定相的粒径。固定相小粒度、均匀，匀浆高压填充，可以降低A。2分子扩散项(可以忽略) (8-17)分子扩散是也称为纵向扩散。由于浓度梯度的存在，而产生的浓差扩散。(8-17)式中: 为柱中填料间的弯曲因子，0.6；DM为溶质在液体流动相中的扩散系数，DM10-5 CS 由于DM很小，因此B/U0，因此，在不考虑分析速度时，可用更低的线速度。这也是当样品注入呈现出点进样时，存在无限直径效应的原因。3传质阻力项C u 图8-1 固定液的传质阻力引起的峰形扩展图8-1表示固定液液膜厚度为df时样品流出色谱柱时的峰形。溶解在固定液表面的溶质分子到达峰的前沿；溶解在固定液内部的溶质分子到达峰的后尾。液膜厚度为df大时会引起色谱峰形的明显扩展。传质阻力项C u包括：固定相的传质阻力项Hs；流动相移动时的传质阻力项HMM；流动相滞留时的传质阻力项HSM。C u = HS + HMM + HSM (8-18)（1）固定相的传质阻力项HS：对液液色谱 (8-19)(8-19)式中：df为固定液液膜(或薄壳)厚度，q为构型因子(对均匀液膜或薄壳材料q=2/3、对大孔固定相q=1/2、对球形非多孔固定相q=1/30)。对液固色谱 (8-20)(8-20)式中：td为样品分子被吸附在固定相表面的平均停留时间。（2）流动相移动时的传质阻力项HMM (8-21)式中：为色谱柱填充因子，对柱子短、内径粗的柱子数值较小。（3）流动相滞留时的传质阻力项HSM即静态流动相传质阻抗，是由于部分流动相在固定相微孔内的滞留引起，静态流动相传质阻抗系数CSM (8-22)式中：为孔洞中滞留流动相在总流动相中占的百分数；0为颗粒内部孔洞的弯曲因子。 (二) Van Deemter方程的表达及图示在高效液相色谱中，对液液分配色谱，Van Deemter方程的完整表达形式为 (8-23)可简化为H = A +B/ u + C u 图8-2 HPLC与GC的H-u曲线比较(三) 方程讨论H对U作图，可绘出与气相色谱相似的曲线，但液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图8-2所示。在HPLC中，由于使用固定相与流动相与GC 不同，H-u曲线的最低点远低于GC。HPLC中，流动相粘度远远高于气相色谱，纵向扩散对峰型的影响很小，由低的Hmin值可看出，HPLC色谱柱要比GC填充柱有更高的柱效。由低的Uopt值可看出H-u曲线具有平稳的斜率，表明采用高的液体流动相流速时，色谱柱效无明显的损失，这也是HPLC的快速分离的基础。在U等于或稍大于Uopt时，速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，而只有两项，因而Van Deemter方程的形式为： H A + C u从Van Deemter方程的完整表达式(8-23)看出，HPLC的实验条件应该是：小粒度、均匀的球形化学键合相；低粘度流动相，流速不宜过快；柱温适当。 涡流扩散、流型效应和停滞流动相慢传质均与dp有关，小的dp有利于提高柱效。高效固定相的重要特征是颗粒细小。固定相的慢传质与df有关，减少df有利于提高柱效。键合相色谱有效降低df，柱效进一步提高。五、影响分离的因素(一) 色谱填充性能1液相色谱填充性能参数(1) 总孔率 (8-24)(8-24)式中T指色谱柱横截面上可供流动相通过的孔隙率，F为流动相体积流流速，cm3/s；为柱内径的半径cm ；tM为柱的死时间；L为柱长cm；V为色谱柱的空体积。(2) 柱填充压力降 (8-25)(8-25)式中，为流动相的黏度，MPas；k0为色谱柱的比渗透系数；dp为固定相颗粒直径，m；为色谱柱对流路的阻抗因子，表征色谱柱对流动相阻力的大小，与色谱柱所用的固定相性质和填充方法密切相关。Pi、P0为色谱柱的入口压力和出口压力，MPa。(3) 柱渗透率 (8-26)(8-26)式中 K0等于1/，柱渗透率KP表示流动相通过柱子的难易程度。在高效液相色谱法中，由于液体流动相黏度大于气体流动相，而且固定相颗粒又小，为保证柱子在较低压力下正常操作，总希望柱的渗透率大。液相色谱柱分离性能的优劣，是由固定相粒度、柱长、由柱内径和填充状况决定的柱压降这三个参数度决定的。这三个参数度也决定了样品组分的保留时间： (8-27)综上所述，保留时间不仅与色谱过程的热力学因素k有关，还直接与决定柱效与分离度的柱性能参数T、P、Kp及流动相的黏度有关，这些参数都是影响色谱分离过程动力学的重要因素。2固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般都是购买商品柱，很少自行制备。(二) 流动相及流动相的极性液相色谱中，改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接因素。液相色谱不可能通过增加柱温来改善传质。因此大多是恒温分析。1流动相选择在液相色谱中显得特别重要，流动相可显著改变组分分离状况，液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。2亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。3若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱柱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。(三) 流速流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。(四) 高效液相色谱的进样问题液相色谱的进样系统，由于其柱压力高，不可能采用直接进样法，只能用进样阀进样。相对来说，进样方法较为简单，但两个效应是不可忽视的。1壁效应采用通常进样方式时，样品和流动相一起加到柱入口。样品到达柱中心，不是呈一个浓度高度集中的规则的“点”，而是以不均匀的辐射方式分散在整个柱子的入口处。一部分样品很快到达柱壁区域。在柱壁区的谱带展宽尤为严重，且峰形不对称，甚至发生畸变，柱效明显下降。这种现象称为壁效应。 图8-3 壁效应 图8-3 无限直径效应 2无限直径效应为消除壁效应，可采用点进样（或称中心进样）技术，将样品导入柱头中心，而流动相直接穿过整个柱入口截面。这种进样方式把一个尖细的样品脉冲送到柱中心，在此样品脉冲向出口移动时，始终保持它的完整性，不接触柱壁。只要柱径足够大，加之组分在液体流动相中的径向展宽（从圆心沿半径向圆周的扩散）相当慢，使组分在扩散到管壁之前就已流出柱子。这种柱子称为“无限直径”柱。 第三节 高效液相色谱仪(HPLC Instrument) 图8-4 HPLC的基本装置典型的高效液相色谱仪是由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和色谱数据处理系统（色谱工作站）五个基本部分和相关辅助部件构成。高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成，贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。进样系统常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（LOAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。色谱柱由柱管和填充剂组成。柱管大多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅胶（C8柱）、氨基或氰基键合硅胶等。常使用ODS柱,由于ODS属于非极性固定相，在分离分析时一般使用极性流动相，所以属反相色谱法，洗脱时极性大的组分先出峰，极性小的组分后出峰。流动相常用甲醇-水或乙腈水为溶剂系统，流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作,脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。检测器主要使用紫外检测器（UVD），UVD可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型，以可变波长紫外检测器应用最广泛。检测器由光源、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，由流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分进入流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。图8-5 HPLC的流程 图8-6 HPLC的结构一、液相色谱仪高压输液系统输液系统由贮液罐、过滤器、梯度洗脱装置、高压输液泵、脱气装置等组成。高压泵是高效液相色谱仪最重要的部件之一。由于高效液相色谱仪所用色谱柱直径细，固定相粒度小，流动相阻力大，因此，必须借助于高压泵使流动相以较快的速度流过色谱这。高压泵需要满足以下条件：能提供150450kg/cm2的压强；流速稳定，流量可以调节；耐腐蚀。目前所用的高压泵有机械泵和气动放大泵两种。梯度淋洗装置可以将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序连续改变组成，以达到提高分离效果，缩短分离时间的目的。梯度淋洗的作用与气相色谱中的程序升温装置类似。（一）贮液罐贮液罐为不锈钢、玻璃或氟塑料制成的容器，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。贮液罐可以是一个普通的溶剂瓶，也可以是一个专门设计的储液器。储液器往往和泵通过管路构成循环系统以便除去溶剂中的气体。现多数使用溶剂瓶，一般采用耐腐蚀的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。（二）高压输液泵气相色谱由高压钢瓶直接提供动力，高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，是流动相的动力源。高压输液泵功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。液相色谱为了获得高柱效，所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压输液泵。1.对高压输液泵的要求（1）能在高压下连续工作，一般要求耐压4050MPacm2，能在824 h连续工作。（2）输出流量范围宽：分析型填充柱在0.1-10mL/min内连续调节，制备型填充柱要求在100mL以上。（3）输出流量稳定，要求无脉冲，流量精度和重复性为0.5%左右。（4）耐腐蚀，能适合各种有机溶剂、水和缓冲溶液。（5）密封性好。泵体易于清洗和维修。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。2泵的类型高压输液泵主要有恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵。恒流泵又称机械泵，主要有机械注射泵与机械往复泵两类。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定，其流量与流动相粘度和色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指输出压力恒定，但其流量随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差。如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。恒压泵和恒流泵各有优缺点。（1）恒压泵A：气动泵直接式，简单，但高压气体可溶解于溶剂中，当溶剂进入检测器时会放出气体影响检测。 图8-7 气动泵B：气动放大泵泵出口压力在系统中是恒定的，流速由柱的阻力决定。压力由两活塞的面积比决定。操作简便，流量范围大，但流速取决于溶剂粘度和柱渗透性。液缸大不便清洗。流量有波动。图8-8 气动放大泵特点：高压、无脉动、成本低，用空气压缩机或气体钢瓶低压驱动，操作成本低。缺点是更换溶剂困难。（2）恒流泵恒流泵有往复泵和螺旋柱塞泵，这类泵输出流量恒定，柱压力由柱的阻力决定。A：螺旋注射泵步进马达控制活塞移动，同时控制流量。至限位开关时停泵后退活塞、吸液，然后继续。压力大（可达60 MPa），无脉冲。但清洗不便，精密而价高。图8-9 螺旋注射泵B：往复柱塞泵 图8-10 往复柱塞泵往复柱塞泵由偏心轮带动活塞往复移动，恒流输出，并通过改变电机转速调节流量。体积小清洗方便，特别适用于梯度淋洗。往复柱塞泵有明显脉冲，需采取增加脉冲阻尼器、改变凸轮形状、加电子线路保护、用多头泵系统(并联串联)等措施。往复柱塞泵目前应用较多。往复柱塞泵特点是单位时间输出的液体流量由单位时间柱塞往复的次数决定，因此，流量恒定，与系统阻力无关，可以连续不断的输送液体，更换溶剂方便，可用于梯度洗脱，主要缺点是有脉动。C：多头柱塞泵并联双柱泵少用一组单向阀。用两相差180度的凸轮推动两交替工作的柱塞。流量稳定。图8-11 多头柱塞泵D：往复隔膜泵柱室间用不锈钢薄膜隔开而使活塞不与流动相接触，靠油压迫钢膜而输出。流量稳定，单形成高压慢。 图8-12 往复隔膜泵（三） 输液体统的辅助装置1过滤器：除掉机械杂质及固体颗粒。由于液相色谱柱、进样器等都很精密，微小的机械杂质将导致这些部件的损害，而不能正常工作，同时机械杂质在柱头的积累还影响柱子的使用，因此，溶剂需要过滤。 图8-13 过滤器的结构2混合器：体积不宜大。3脉动阻尼器：种类多，都有一定容积和弹性。4压力测量装置：电子压力控制器流量5流量测量装置：电子流量计6脱气装置：除掉溶于流动相中的各类气体，以保证柱效能。可采用通氮脱气、超声波脱气、自动脱气机脱气等。（四）梯度洗脱装置在液相色谱中，当样品组成复杂时，有时会出现先出的峰分不开，后面的峰保留值又太大的现象，这时，可以采用梯度洗脱来调整混合溶剂的组成，改变溶剂强度或选择性。梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类：1外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。2内梯度装置（又称高压梯度），先将两种溶剂分别用泵增压后，再由泵按程序压入混合室，混合，再注入色谱柱。图8-14 梯度洗脱装置示意图梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过流动相的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。流动相A、洗脱时，若样品中各成分容量因子k相差大，则大的峰宽而低且分析时间长。流动相B、是溶解力强。洗脱时，各成分很快出来，则k(12)小的峰达不到分离。AB 若将A、B流动相的组成随时间改变，则即分离好，又缩短分析时间。当我们需要混合三种流动相时，可利用电磁阀的功能将吸液分划成ABC三部分，划分比一定，组分送液时是一定时，相当于GC中恒温分析。在梯度送液时，划分比则按所设定的程度时时刻刻都在变化，相当于GC中程序升温。二、液相色谱仪进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约540 cm），因此柱外效应较突出。柱外效应是指色谱柱外因素引起的峰展宽，包括进样系统，连接管，检测器中存在的死体积。柱外展宽可分为柱前和柱后展宽，进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。在液相色谱中，进样方式有隔膜式注射进样器进样，高压进样阀进样，自动进样装置等。（一）隔膜式注射进样器隔膜式注射进样器有硅橡胶隔膜，在原理上与气相色谱法完全一致。用微量注射器进样的优点可柱头进样，减小死体积，充分发挥柱的效能，简单便宜。缺点是高压进样时漏液会产生误差，隔垫使用次数有限，进样量小，重复性差。（二）进样阀方式六通阀进样目前，广泛采用多通路进样阀，它可以承受很高的压力，由于进样量是由进样定量管决定的，因此，可以获得好的重复性，更换不同体积的进样定量管，可调整进样量。进样时，样品中不应混入机械杂质，溶解样品的溶剂最好与使用的流动相相同，以防止溶剂变化出现不溶物而堵塞柱子。一般高效液相色谱流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，六通阀结构如图所示，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（LOAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，由高压泵输送的流动相将样品送人色谱柱中。样品定量管的容积是固定的，因此进样重复性好。缺点是不能注入小体积样品（1.2L）,改变注入量时要更换定量管。 图8-15 旋转式六通阀进样装置三、液相色谱仪分离系统(一) 色谱柱分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。进行色谱分离的首要工作是选择性能良好的色谱柱，即选择在确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。 色谱柱的选择应考虑：固定相类型的选择, 主要取决于样品分离模式； 柱填料的结构, 主要指颗粒的形状大小、均匀性、比表面、平均孔径和孔容等； 柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度；色谱柱的牌号/厂商。（一）色谱柱多为直形，内部充满微粒固定相。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱可分为分析柱；制备柱；分析柱的保护柱。1柱材料及规格色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多,它是由内部抛光的不锈钢管制成。一般色谱柱长540cm，内径为16 mm，柱效达500010000块/m理论塔板数。凝胶色谱柱内径312mm。，制备往内径较大，可达25mm 以上。2柱的填料固定液涂在担体上而成。担体有两类：一类是表面多孔型担体；另一类是全多孔型担体。近年来又出现了全多孔型微粒担体,这种担体粒度为510m，是由10 nm级的硅胶微粒堆积而成，又叫堆积硅珠。由于颗粒小，所以柱效高，是目前最广泛使用的一种担体。3保护柱一般在分离柱前有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱一样，安装在分析柱前。其作用是收集、阻断来自进样器的机械和化学杂质，以保护和延长分析柱的使用寿命。一只1cm长的保护柱就能提供充分的保护作用。若选用较长的保护柱，虽可降低污染物进入色谱柱，但会引起谱带扩张。因此选择保护柱的原则是在满足分离要求的前提下，尽可能选择对分离样品保留低的短保护柱。保护柱也可装填和分析柱不同的填料，如较粗颗粒的硅胶（1015m）。保护柱装填的填料较少，价格较低，为消耗品，通常分析50100次样品，柱压力呈增大趋向时就是需要更换保护柱的信号。目前市场上供应的结构新颖的可更换芯式设计保护柱，是由保护套和可更换式保护芯，两部分组成。(二) 柱连接方式柱出、入口的连接管的死体积越小越好,一般常用窄孔(内径0.13mm)的厚壁(1.52.0mm)不锈钢管,以减少柱外死体积. (三) 柱温控制在高效液相色谱分析中，柱温一般为室温或接近室温。适当提高柱温可改善传质，提高柱效，缩短分析时间。因此，在分析时可以采用带有恒温加热系统的金属夹套来保持色谱柱的温度。温度可以在室温到60之间调节。对凝胶渗透色谱仪，其柱温可从室温至150实现精确控制。四、液相色谱仪检测系统 检测器实际上是一种换能装置，它将流动相中组分含量的变化，转变成可测量的电信号(通常是电压)，然后输入记录器。从原理分析，任何一种分析鉴定方法都可能用作色谱检测器。理想的检测器应该是灵敏度高、线性范围大、对所有待测组分相同响应。高效液相色谱的检测器很多，光学(紫外, 荧光, 折光检测器)；电化学(极谱、电导、库仑、离子选择电极)等。对检测器要求是高灵敏度；低噪声；大的线性范围；对所有化合物都响应。与GC一样。用得最多的是UV 检测器，常用于有双键的芳香族化合物检测，有UV吸收就可用UV检测器。因为UV对甲醇，水无吸收，所以甲醇，水可用作流动相。检测器噪声一般由于电引起。(一) 检测器分类1按性质或应用范围分类有总体性能检测器和溶质性能检测器。总体性能检测器，是响应值取决于流出物(含样品与流动相)某些物理性质的总的变化的检测器。属于这类检测器的有示差折光、电导等检测器,GC中的热导检测器也属于这类检测器。溶质性能检测器是响应值取决于流动相中溶质的物理或化学特性的检测器。属于这类检测器较多，有紫外检测器、荧光检测器、化学发光检测器、安培检测器、手性检测器等。因为溶质性能检测器仅对被测定物质有较大响应，而流动相没有响应或响应很小，所以检测灵敏度高，受操作条件变化和外界环境影响小，并且可用于梯度洗脱操作。但与总体性能检测器相比，应用范围受到限制。总体性能检测器和溶质性能检测器的划分也不是绝对的，例如紫外-可见检测器常用作溶质性能检测器，但在间接光度离子色谱法中则成为总体性能检测器。2按测量信号性质分类有浓度型检测器和质量型检测器。浓度型检测器的响应值正比于溶质在流动相中的浓度，测量的是流动相中溶质浓度的瞬间变化，大部分液相色谱检测器属这一类检测器。当样品量一定时，检测器瞬间响应，峰高响应值与流动相流速无关；峰面积响应值与流动相流速成反比，峰面积与流速乘积为常数。质量型检测器的响应值正比于单位时间内通过检测器的物质的质量，峰面积与流动相流速无关，峰高响应值与流速成正比。例如库仑检测器就是质量型检测器。3按测量原理分类有热学性质检测器、光学性质检测器、电学及电化学性质检测器等。光学性质检测器是根据被测物质对光的吸收、发射和散射等性质进行检测的。有较多的液相色谱检测器属这一类检测器，例如紫外-可见检测器、示差折光检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器、化学发光检测器、手性检测器等。电学及电化学性质检测器是根据被测物质的电化学性质进行检测的，常用的有安培检测器、电导检测器、库仑检测器、介电常数检测器、极谱检测器等。该类检测器通常驻将色谱流出液作为化学电池的一个组成部分，通过测量电池的某种参数(如电流、电阻、电量等)进行检出和测定。性质进行检测的。利用热学原理进行检测的热学性质检测器有光声、热透镜和光热偏转检测器等，分别利用了光声光谱和光热光谱等技术。激光检测器的应用使灵敏度得到较大的提