凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量.doc

实验 凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量一、实验目的与要求：1. 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。 2. 掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。二、实验原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，用硼酸吸收。吸收氨后的硼酸再以标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。 2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4 = (NH4)2 SO4 + 6CO2 + 12SO2 + 16H2O(NH4)2 SO4 + 2NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O2NH3 + 4H3BO3 = (NH4)2 B4O7 + 5H2O(NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O = 2NH4Cl + 4H3BO3三、样品： 面粉四、仪器与试剂仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、 微量滴定管、 加热套1000W试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。1. 消化试剂：浓H2SO4 硫酸铜(固体) 硫酸钾(固体)2. 2%硼酸(H3BO3)溶液: 10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。二组配500ml3. 40%NaOH溶液4. 0.0100mol/L盐酸标准溶液5. 混合指示剂: 临用时，把溶解于95乙醇的0.l溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95乙醇的0.l甲基红溶液2毫升混合而成(比例5：1)(公用) 五、测定方法1、 样品消化：准确称取面粉1.01.2g左右于定量滤纸上，包好，塞入干燥的定氮烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5g CuSO4、6g K2SO4及25mL浓硫酸，加数粒玻璃珠，轻轻摇匀后，用电炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30分钟。 为了加快消化速度，待泡沫消失后，可添加双氧水，每次加4-5ml。注意，每次添加双氧水时，就从热源上取下定氮瓶，待消化液冷却至70-80后，方可加入30%浓度的双氧水。取5060mL蒸馏水，徐徐加入烧瓶中，以释放潜热，待样品冷至室温，移入250mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用。 同时做一空白消化（空白消化只加试剂，不加样品）。2、蒸馏与吸收： 组装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处， 加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸(呈黄色)，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 将所有的夹子打开。取下样品加入口的磨口塞，从样品加入口加入50mL的蒸馏水，再插回塞好，产生蒸汽后，使蒸汽进入反应室，蒸馏洗涤10分钟。然后排出废水。马上从进样口加入蒸馏水约20mL，再次洗涤反应室，待水排出，反复操作3次，洗涤完毕。 量取25mL2%硼酸置于250mL锥形瓶内，并加入 2滴混合指示剂，然后将此吸收液置于冷凝管下端插入到液面以下。 将全部夹子打开，用移液管准确吸取10.0ml样品消化稀释液（或空白液），从样品加入口流入反应室内，用少量水(10ml)洗涤加入口，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，使反应室内的样液呈碱性，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防止氨的逸出。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。从第一滴馏出液滴下开始计时，蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面,再蒸馏1分钟，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，洗液流入吸收液内，取下接收瓶。（6）反复洗涤反应室后，再作样品平行测定。测定完毕，打开全部夹子，停止加热，待冷却后拆除装置并洗涤干净。3滴定：用0.0100mol/L HCl滴定吸收液至变为紫红色为终点，记下消耗的HCl体积。平行实验进行数次 。同时吸取 10.0mL 试剂空白消化液按上述操作做试剂空白试验。注意 ：定氮仪在使用前或每次平行实验后，应用蒸馏水及蒸汽洗涤干净方可进行样品测定的蒸馏操作。洗净的标志：吸收液不变颜色四、计算： 公式自己推导。蛋白质% = C HCl标准溶液的浓度，mol/L； V1 滴定样品吸收液消耗的HCl标准溶液的体积，mL； V2 滴定样品空白液消耗的HCl标准溶液的体积，mL； m 面粉的质量， g；0.01401氮的毫摩尔质量； F 小麦粉的蛋白质含量换算系数为5.70。说明：参见书中P222六、注意事项：（1）所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。（2）消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。（3）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23mL 后再继续加热消化。（4）蒸馏装置不能漏气。（5）蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。（6）硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。（7）蒸馏完毕后，应先将冷凝