分子生物学考试重点总结 Peptide bond.doc

1：Peptide bond：肽键是由一个氨基酸的a-羧基与另一个氨基酸的a-氨基脱水缩合而形成的化学键。2：Motif：超二级结构，也叫基序或模序，是基本二级结构元件的组合，某些蛋白质分子中，可见一个或多个具有二级结构的肽段，在空间结构上相互接近，形成一个二级结构的聚集体。3：Domain：结构域是介于二级三级结构之间的一个层次，是多肽链的独立折叠单位。4：Zinc Finger：锌指结构是存在于许多结合DNA的转录因子蛋白中，每一个大约30个AA组成的重复序列中都在相同位置上含有2个Cys和2个His，与一个Zn2+形成配位键。5：Protein denaturation and renaturation：蛋白质的变性是在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。6：Molecular chaperone：分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，能识别肽链的非天然构象，通过与疏水肽段结合和释放作用（消耗ATP),消除蛋白质不正确的叠折，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。7：Cell adhension molecule:细胞粘附分子是参与细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间相互作用的分子。 细胞粘附指细胞间的粘附，是细胞间信息交流的一种形式。而信息交流的可溶递质称细胞粘附分。CAM是一类独立的分子结构，是通过识别与其粘附的特异性受体而发生相互间的粘附现象。8：prion protein：朊病毒蛋白可引起一种人和动物神经退行性病变即疯牛病。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。9：western blotting：免疫印迹是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。10：Proteome：蛋白质组指由基因组表达的所有蛋白质。11：Signal peptide：信号肽指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移的N-末端的氨基酸序列。12：Allosteric enzyme：别构酶：所谓别构调节就是指一些特定的小分子化合物与酶分子上的调节亚基或部位结合时，可诱导和影响催化亚基或部位空间结构改变，使其催化活性增高或降低。这类可受调节的酶称为别构酶，这种调节作用称为别构调节。13：Ribozyme:核酶是具有高效，特异催化作用的核酸，其作用主要参与核酸的剪接。14：Isozyme：同工酶指同一种属中不同基因或等位基因编码的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂交体，其理化性质、生物学性质不同，而能催化相同反应的酶。15：CDKs：周期蛋白依赖性蛋白激酶是一组(Ser/Thr)蛋白激酶，它们各自在细胞周期内特定的时间激活，通过对相应底物的磷酸化，驱使细胞完成细胞周期。16：Cyclin：细胞周期蛋白是一类伴随细胞周期的不同阶段表达、累积和降解的蛋白质因子。17：Death receptor：在细胞表面存在着一类能结合胞间凋亡刺激分子，并将信号传至胞内引起细胞凋亡的受体，称为死亡受体。18：Oncogene：癌基因是这样的一类基因，转导其表达产物进入真核细胞后能使细胞如同肿瘤细胞一样永生化.19：Caspase: 胱天蛋白酶：这类酶都以无活性的酶原形式合成并存储在细胞中。N-端为一个序列、长度特异的原结构域，是caspase的活性调节结构域，其后是一个大亚基和一个小亚基序。20：Differintiation: 细胞分化是指在个体发育中，由相同的前体细胞经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生各不相同的细胞类群的过程。21：Stem cell：干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。1：蛋白质结构与功能的关系。答：蛋白质结构决定功能。一级结构决定高级结构，高级结构决定生物学活性。多肽链中氨基酸序列决定了肽链的折叠和卷曲方式。蛋白质在刚合成时需分子伴侣蛋白结合疏水氨基酸，诱导其正确折叠。部分氨基酸在蛋白质空间结构中处于关键位置。2：蛋白质合成后如何定位。答：定位于不同部位的蛋白分子带有不同的结构信号线粒体蛋白的定位：线粒体中多数蛋白是在胞浆中合成后转运到线粒体中的。蛋白以“前体蛋白”形式合成，N-端一般带有一段不完全相同但含有共同模体的基质导入序列。进入膜间质的前体蛋白上述信号肽后还有一段“膜间质导入序列”，定位后被切除。插入外膜的前体蛋白还有“停止转运和外膜定位序列”，定位后仍保留。基本过程：前体蛋白合成释放，结合分子伴侣转运过线粒体外膜跨过内膜切除信号序列折叠成具有生物学功能的三维结构。核蛋白的定位：将被运输到细胞核中的蛋白质都含有一个“核定位信号。核蛋白通过核孔复合体进入细胞核中。输入因子结合目标蛋白和输入因子。三元复合物通过核孔，进入核（ATP）。Ran-GTP结合输入因子，目标蛋白解离。Ran-GTP在GTPase作用下水解成Ran-GDP，输入因子解离。输入因子，Ran-GDP回到胞浆中。分泌蛋白的定位：分泌蛋白的合成起始于游离核糖体，其N-端信号序列结合“信号识别颗粒”（SRP），再与内质网（ER）SRP受体结合。进入ER后完成合成，切除信号肽，折叠，分泌。膜蛋白的插入与定位：重组DNA技术表明，膜蛋白的拓扑定位主要决定于肽链上的“拓扑序列”：跨膜信号序列，停止转运序列， 膜锚定序列。许多蛋白质是通过一个共价连接的糖基磷脂酰肌醇而锚定在细胞膜上。过氧物酶体蛋白的定位：过氧物酶体中的蛋白质（主要是蛋白酶）都是在胞浆中合成折叠后进入的。信号肽分别是C-末端SKL序列和N-末端 PTS1R，PTS2R。3：蛋白质泛素化降解答：泛素可以共价结合底物蛋白，使其进入胞浆中“蛋白酶复合体”降解途径，该途径可以分两个阶段：（1）目标蛋白内部的一个Lys被一串泛素修饰。（2）被修饰的蛋白进入蛋白酶复合体空腔中被降解。泛素分子连接到底物蛋白上主要是由三种酶催化进行的. E1激活泛素，E2(Cys)接过活化的泛素.E3识别底物蛋白N-端去稳定残基，再与E2结合.泛素被转到底物蛋白上（Lys）.带有泛素的底物蛋白被转移到26S蛋白酶复合体中.底物蛋白被水解.4：酶的催化机制。答：一般酸碱催化：活性中心的基团可以酸碱解离，提供或接受质子亲核或亲电催化亲核：带负电荷的催化基团，催化带正电的底物原子团亲电：带正电荷的催化基团，催化带负电的底物原子团邻近效应和定向排列：将局部底物浓度提高(酶表面)，增加有效碰撞(对应反应基团位置)。：诱导契合：酶、底物分子具有“柔性”结构/构象，相互作用时相互诱导、相互变形而相互适应。使底物常处于过渡态，受催化的化学键较活泼，易受攻击。5：真核细胞周期调控的主要分子机制。答：G1-Cyclin：主要是Cyclin D（Cyclin D1、D2 和D3 ），是细胞周期运行的起始因子, 又是生长因子的感受器。与Cdk4/6结合，有助于细胞通过G1晚期检测点；降解S期Cdk复合物抑制因子，活化S期Cdk复合物。：G1/S-Cyclin：CyclinE表达始于G1 中期, 峰值位于G1/ S 交界处, CyclinE 的合成受E2F 和Myc 共同激活,当CyclinD 与CDK4/ CDK6 结合后, 使RB 蛋白磷酸化, 释放转录因子E2F, 诱导CyclinE 和CDK2 的表达，细胞越过G1/ S 转折点。：S-Cyclin：当细胞进入S 期, CyclinE 水平急剧下降, CDK2 与Cyclin A 结合,为DNA复制所必需，并在下一个时相发挥生物学功能。：M-Cyclin：主要是Cyclin B,与Cdk1结合，其复合物称促有丝分裂因子，主要是磷酸化特异的结构蛋白和调控蛋白，驱动M期进程。6：维持胚胎干细胞多能性的分子机制。答：（一）外部信号：含有生存必须的代谢物及营养物质的培养基不足以维持胚胎干细胞处于未分化状态。饲养细胞可分泌某种因子，维持胚胎干细胞不分化-白血病抑制因子（LIF） 。LIF属于白细胞介素6（IL-6）家族，可介导相反的细胞进程：抑制胚胎干细胞的分化，诱导M1白血病细胞的分化。（二）不依赖于LIF的信号：缺乏内源性LIF的胚胎干细胞，在缺乏外源性LIF后，仍能产生支持胚胎干细胞处于未分化状态的活性-胚胎干细胞更新因子（ESRF）。ESRF在无LIF情况下可保持胚胎干细胞具有发育多能性一周。ESRF并不激活STST3，表明介导细胞多能性的信号通路不止一条。（三）多能性的内部决定因子：Oct-3（Oct-4）：干细胞表型维持需要Oct-3的DNA结合能力。胚胎干细胞Oct-3的表达在特定水平才能保持其多能状态。7：以caspase为中心的细胞凋亡信号转导通路.答：在不同的细胞凋亡因素刺激下，caspase在细胞内可以通过多种不同的途径被活化，然后切割并激活下游的caspase分子，介导细胞凋亡。关于caspase的激活（1）由死亡受体介导的“诱导接近”模型：如caspase-8，在上游分子的作用下寡聚化，然后紧密结合的caspase-8分子之间可以发生切割，释放p18和p10至胞浆，并装配成活性蛋白酶。这种起始活性蛋白酶将进一步激活下游的效应蛋白酶caspase-3, -6, -7，或另一分子起始蛋白酶caspase-9。（2） caspase-9的活化通常需要线粒体的参与。Caspase-9在线粒体释放的细胞色素C和dATP存在下，通过与Apaf-1的CARD结合成一个复合体而得以活化，然后再去激活下游分子，包括caspase-3以及可能随后被激活的caspase-2, -6, -8, -10, 诱导细胞凋亡。对于其中一些底物的认识提示，caspase可能通过以下几种机制参与凋亡。caspase对ICAD/DFF45的剪切：细胞凋亡时，caspase剪切ICAD使其失活，CAD从而游离并进入细胞核，降解DNA。caspase对核板的降解作用：细胞凋亡过程中，caspase在单一位点剪切核纤层蛋白，导致核板塌陷和染色质浓缩。Caspase剪切的还有肌动蛋白，Fak和核分裂相关蛋白等。剪切核效应蛋白：Caspase可能作用于DNA修复、mRNA拼接和DNA修复相关蛋白，使其活性丧失或失调。细胞凋亡启动时，PARP被剪切，导致其氨基端的两个结合DNA的锌指结构与羧基端的催化结构域分离，进而丧失其正常功能。 8：细胞凋亡检测方法及其原理.答：细胞形态学的评价:普通光镜、荧光显微镜观察,分别对细胞核、质染色，计算凋亡细胞数目。电子显微镜观察：凋亡细胞膜表面变化. 细胞膜及核膜完整性的检测：（1）拒染实验：台盼蓝、碘化丙啶（PI）、EB等为膜不通透染料，可使坏死细胞或凋亡后期继发性坏死细胞核着色，而活细胞或凋亡细胞不着色。（2）浓染实验：Hoechst 33342、33258等为膜通透性染料，可之凋亡细胞着色浓密，区别正常细胞和凋亡细胞。（3）双重染色：采用对正常细胞膜和凋亡细胞跨膜通透性不同的两种染料同时染色来区别。正常细胞AO染色呈绿色；凋亡细胞AO阳性，EB阳性红染。（4）Annexin V的检测：一种通过检测细胞膜结构的改变来区分活细胞、凋亡或坏死细胞的方法。凋亡细胞膜磷脂不对称，膜内磷脂酰丝氨酸外翻，与连接素（Annexin）V有较强的亲和力。线粒体等细胞器膜完整性的检测：通过检测线粒体跨膜电位的改变，来检测线粒体膜完整性。一些带有正电荷、并具有膜通透性和亲脂性的荧光染料均能被活细胞摄取并堆积在线粒体中。当凋亡发生后，线粒体跨膜电位降低，染料减少，可借助流式细胞仪检测。DNA断裂的检测：（1）DNA ladder：细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 180-200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱。(2)DNA凋亡峰的检测: 应用DNA特异性荧光染料染色后，在流式细胞仪进行的细胞周期分析中，凋亡细胞常以亚二倍体形式出现 .(3)TUNE技术:细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测。9：线粒体释放的凋亡诱导因子。答：细胞色素C：被释放至胞质的Cyt C在ATP或dATP的辅助下可特异性结合胞浆接头蛋白Apaf-1并促进Apaf-1寡聚化，Apaf-1借其N-端CARD直接募集多个caspase-9分子，形成“apotosome”,变构并活化caspase-9.活化caspase-9再激活下游分子，包括caspase-3及可能随后被激活的caspase-2, -6, -8, -10。Cyt C还是线粒体呼吸链的重要组成成分，Cyt C的耗竭可能导致呼吸链中电子传递的破坏使ATP生成受阻和ROS产生，进而诱导细胞坏死。Smac: Smac从