SRSIM超高分辨率显微镜系统操作手册20页.doc

SR-SIM超分辨率结构照明镜显微镜系统操作手册SR-SIM原理：结构照明是一个宽视场技术，其中，受栅格图案的衍射级的干扰，产生通过在拍摄图像的同时叠加在样品上，栅格图案被捕获的每个图像组在步骤之间的移动或旋转。高频信息用反傅里叶算法处理之后，可以从原始数据中提取以产生一个重建的图像，横向分辨率大约提高两倍，衍射限制范围在150和300纳米之间的轴向分辨率。SR-SIM超高分辨率显微镜开机步骤：2.打开前部绿色电源1.将UPS后部电源往上扳 5.打开载物台电源4.打开显微镜电源6.打开汞灯开关3.打开两个拖线板电源7.打开电脑 注意：所有带三角警示标记的保育器开口都要关紧，避免激光照射！Zeiss SR-SIM镜头配有10X/dry、63X/1.46Oil、63X/1.57Oil、100X/1.57OilELYRA S.1 软件基本操作流程1. SR-SIM Workflow-Acqisition（图像获取）1) 目镜找视野4.观察完毕后点击Oculars offline1.选择Locate选项卡2.选择Oculars online3.选择BF（明场）或者Fset77（荧光）Fset77为双色滤片，能同时观察488nm，561nm2) 图像获取2.选择需要的rotation ，一般选5次1.选择需要的图像分辨率 10.温度提示为红色时，仪器不能使用。等仪器降至相应温度方可使用9.如有多通道可通过点击加号增加通道，每个通道重复步骤1-88.选择相应的伪彩4. EMCCD增益(EMCCD Gain)为40，并在此基础上调节3. 曝光时间为100ms，并在此基础上调节2.通常设置激光强度为2，并在此基础上调节1.选择相应的激发波长注意：通常405nm的激光需设置较高的参数！6.在勾选所需要的激光波长之后，系统会自动选择最佳的光栅（基于所选择的物镜和激发光）使用者仍可以手动改变所需的光栅5. 点击SIM选项卡7. 手动选择所需的滤片（系统不会自动选择）10.点击Continuous进行预览并调节参数11.点击Snap进行单张图片活图3) 获取三维图像1.选择Center6.选择需要的张数，一般为10-21张5.点击Smallest数值4.点击Interval2.将图像调节至焦平面，点击Center3.点击向下箭头7.点击Start Experiment开始获图2.SR-SIM Workflow Processing（图像处理） 1.点击Processing2.选择Structured Illumination,点击右边的小三角，以展开条目.选择Structured Illumination 3.选择需要处理的SIM图像4.点击Select7.点击Apply6.选择SR-SIM+Wild field5.点击Automatic3.最亮点投影4.点击Apply3.点击Select1.点击Maximum intensity projection2.点击需要处理的图像此时得到的图片为不同z轴上最亮点的投影。 Zeiss ELYRA S1 通道校正（Channel Alignment）操作流程1. Acquire：使用200nm荧光小球获取SIM图像2. Process：SIM图像处理3. Process：Channel Alignment通道校正4. Use：使用校正结果样品为具有四种荧光通道、200nm直径的标准荧光小球。有以下两个样片：样品编号所匹配的物镜0000-1783-45563X/1.4 Oil，100X/1.46 Oil0000-1788-601100X/1.57 Oil注意：物镜及样片需要仔细清洗！在实验前。需将样品放置在开启的系统中稳定30分钟至60分钟。需使用与物镜折射率相匹配的镜油。具体操作流程见下图：1. Acquire SIM Image 获取SIM图像使用200nm的荧光小球6.EMCCD Gain：30-504.激光强度：488nm，561nm：2-5%;405nm，642nm：4-10%5.Exposure time：100ms3. 建议案顺序依次设置642-561-488-4052.选择5 rotation1.选择需要的物镜12. z-stack选择slice为21张11.点击Smallest数值9.点击Center8.点击Interval7.选择Center10.点击向下箭头3. 选择先前拍摄的SIM原始图像1.选择Processing选卡2.生成SIM图像7.点击Apply6.选择SR-SIM5.选择Automatic模式4. 点击Select2.选择Structure Illumination3.通道校正1. 选择Processing选卡2. 选择Channel Alignment6.点击Apply5.选择校正模式Affine4. 点击Select3. 选择先前拍摄的SIM图像注意：在校正完成之后，请立即保存结果！4如何保存校正表格点击Apply后出现下列表格 注意：出现表格后立即保存，系统不会自动保存！如何使用校正结果2.选择要处理的图片，点击Select4.取消Fit前面的钩3.选择Affine1.选择Pr