目的基因到工程菌的构建.doc

目的基因到工程菌的构建1基因工程的诞生 1972年，美国斯坦福大学的学者首先在体外进行了DNA改造的研究，他们把SV40（一种猴病毒）的DNA分别切割，又将两者连接在一起，成功构建了第一个体外重组的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次在体外将重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。在这个的基础上，基因工程诞生了。SV40病毒第一个重组体的构建1.1 基因工程技术的三大理论基础一是20世纪40年代Avery等人通过肺炎球菌的转化实验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌。二是20世纪50年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA的半保留复制机理。三是20世纪60年代关于遗传信息中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按DNARNA蛋白质的方向进行传递的。 1.2 基因工程技术的三大技术基础三大基本技术问题：一是如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需的基因片段切割下来；二是如何将切割下来的DNA片段进行繁殖扩增；三是如何将所获得的基因片段重新连接。20世纪70年代，由Smith等人发现的核酸限制性内切酶、DNA连接酶和可以作为基因工程载体的细菌质粒的发现，解决了上述三大问题。1.2.1 限制性核酸内切酶 限制性内切酶不切割自身DNA是因为原核生物中不存在酶的识别序列或识别序列已经被修饰。1.2.2 DNA连接酶 作用实质：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起，形成重组DNA分子，其起作用时不需要模板。1.2.3 基因工程的载体-质粒 基因载体的作用是运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达。也就是说，离开染色体的外源DNA不能复制，而而插入复制子DNA的外源DNA可作为复制子的一部分在受体菌中进行复制，这种复制子 是外源基因的载体。此外，为满足其使命，还必须具备如下一些特性：能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，在其DNA插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性。易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。载体DNA序列中有适当的限制性内切酶位点，并位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。某些病毒载体在外源DNA插入后变成缺损性病毒株，只能在有辅助存在时才能进行正常增殖。具有能够观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择标志。1.3 基因工程的基本过程 1.4 基因工程的应用2目的基因的获取 基因工程订是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常我们把插入到载体内那个特定的片段基因称为“外源基因”，而将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段称为“目的基因”。 来源于真核细胞的产生基因工程药物的基因是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小的一部分，为其10-5 -10-7 ，即使多拷贝基因也只有其10-5，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。另外，真核基因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即便分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工系统，真核基因转录的mRNA也不能加工、拼接成为成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因，必须采用特殊方法分离目的基因。目的基因的获取大致可以分为三类：一是利用PCR技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；二是构建感兴趣的生物个体的基因组文库或者cDNA文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从文库中挑出含有目的基因的重组克隆；三是近年来发展的利用基因差异表达获取目的基因的技术。2.1 直接分离法（鸟枪法） 直接从生物细胞基因组中获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又称“散弹枪法”。其是将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。优点是速度快，简单易行，成本较低，并能获得与天然基因组DNA一样的有内含子的真核基因DNA片段。2.2 逆转录法（cDNA法） 逆转录法合成DNA是人工模拟自然界某些生物的反转录过程。主要用于分子量较大而又不知道其序列的基因，它以目的基因的mRNA为模板，以dNTP为底物，酶催化按53方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链（cDNA），它与RNA模板形成RNA与DNA的杂交体。随后又在反转录酶的作用下水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，由RNA指导的DNA合成过程完成。2.3 反转录-聚合酶链式反应法（PCR法） 该法是将mRNA经反转录全成cDNA的第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。常用于含其极微量mRNA的细胞。2.3.1 cDNA文库 cDNA文库是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。原理是将带poly（A）的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，再与原核载体连接。 cDNA文库的构建：2.3.1.1 cDNA第一链的合成利用反转录酶合成cDNA第一链 2.3.1.2 cDNA第二链的合成 自身引导合成法：单链cDNA的3端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链.此法存在的缺点是在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA 5端的地方的序列出现缺失和重排. 置换合成法：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链.此法的优点是：合成cDNA的效率高；直接利用第一链的反应产物，不需纯化；避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA。 引物-衔接头法 Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA 2.3.1.3双链cDNA分子的克隆 同聚物加尾法: 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3端都加上一个互补的同聚片段，通过退火使两个片段连接成重组质粒，再将重组质粒转化受体细胞. 接头-衔接头法 mRNA-cDNA克隆法 方法：在mRNA反转录合成cDNA第一链后，将 dA残基加到mRNA：cDNA杂交体上，然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细胞， 在宿主细胞内，mRNA被降解并代之以DNA.缺点：克隆的效率低（为双链cDNA克隆的1/10）2.3.1.4 cDNA文库的筛选和鉴定核酸杂交1）同源探针；至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.2）部分同源探针：探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.3）总cDNA探针：通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+ mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.4) cDNA扣除探针: 从第一种mRNA制备cDNA探针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交; 回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.特异性免疫学检测:在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测.cDNA克隆的同胞检测:将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的cDNA文库，对每组cDNA文库进行检测，当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测，直到获得阳性单克隆.cDNA克隆的确证:cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.2.3.2 基因组文库 基因组文库或简称基因文库，其是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。通过构建基因文库可以贮存和扩增特定生物基因工程组的全部或部分片段，同时又能够在需要时从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。 理想的基因组文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻从文库中筛选目标克隆的工作量。克隆片段大于研究基因的平均片段，以便于从同一克隆中获得完全的单一基因。含有相邻DNA片段的独立克隆间，部分序列重叠的大小合理，一方面利于基因文库各克隆建立叠连群，进行染色体步查；另一方面，又不重叠过多，使步查效率低下。克隆片段易于从载体分子上完整卸下且最好不带有任何载体序列。重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 基因组文库的构建： 细胞染色体大分子 DNA 的提取和大片段的制备； 载体 DNA 的制备； 载体与外源大片段连接； 体外包装及基因组 DNA 文库的扩增； 重组 DNA 的筛选和鉴定。 表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选 抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄 二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长 分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选 免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选 PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段2.3.3 cDNA文库和基因组文库的区别 时效性: cDNA 文库代表某一时期特定细胞或组织中mRAN，是转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是全部基因；而基因组文库包含该生物所有基因。序列组成不：cDNA 文库无间隔序列和调控区等非编码区；基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。两种文库均有应用，如何选择： 根据试验目的，在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特特异表达的基因时应用cDNA文库；在研究mRNA不存在的序列及基因组作图时必须构建基因组文库。2.4 化学合成法该方法有个先决条件就是必须已知其核苷酸顺序，或者已知其蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的核苷酸序列。用化学合成此基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成黏性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。常用于较小分子蛋白质或多肽的合成。2.5 物理化学方法 其原理是从几个方面来利用核酸DNA双螺旋之间存在着碱基G和C配对，T和A配对的这些特性，从而分离目的基因的目的。2.5.1 密谋梯度离心法 液体在离心时，其密度随转轴距离而增加。碱基GC配对的双链DNA片段密度较大，利用精密的密度梯度超离心技术可使切割适当片段的不同DNA按密度大小公布开来。进而通过与某种放射性标志的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。2.5.2单链酶法 碱基GC配对之间有三个氢键，比AT配对的稳定性高，当用加热或其他变性试剂处理DNA时，双链上AT配对较多的部位先变成单链，应用单链特异的S1核酸酶切除单链，殖民地经氯化铯超速离心，获得无单链切口的DNA。2.5.3 分子杂交法 单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，这就是分子杂交的原理。其既可以分离，也可以鉴别某一基因。3 基因与载体的连接（以质粒为例）3.1 质粒的提取 通过加入SDS（十二烷基硫酸钠）对宿主细胞进行裂解，使质粒DNA顺利溢出并与染色体DNA和蛋白质等分离。其中，微量碱变性法提取质粒具有简单快速、经济实惠优点，是当前分子生物学及基因工程研究工作中最常用的一种纯化质粒DNA的方法。当然，也可以采用试剂盒进行，目前，商品化产品很多，其基本原理大多是基于碱裂解法结合硅胶模等微型离心纯化柱。3.2 质粒载体的构建 天然质粒往往存在这样或那样的缺陷，不适合直接用作克隆载体，需要进行人工改造，这些改造主要有以下几方面：（1）选择合适的复制起始位点。为了使构建的质粒克隆载体能在受体细胞中进行有效复制，且获得足够数量的拷贝数，需要改变复制起始位点，一般选择组装松散型质粒复制起始位点。（2）加入合适的选择标记基因。为了便于重组子筛选，需要在质粒克隆载体上加入合适的标记基因，主要有lacZ和抗生素抗性基因，前者用于克隆子蓝、白斑筛选；当外源DNA片段插入到克隆位点后，可导致抗生素抗性基因失活。（3）增加或减少酶切位点。质粒载体利用限制性内切酶识别位点来作为外源DNA片段插入的克隆位点，这种位点必须是单一酶切位点，而且数量越多越便于多种类型末端的DNA插入。可通过删除天然质粒中的部分重复的限制性内切酶识别位点使之成为单一的酶切位点，可通过增加新的单一限制性内切酶位点在特定的部位组装一个含有多种单一限制性内切酶识别序列的多克隆位点（MCS）。（4）缩短长度。质粒转化受体细胞的效率同质粒DNA分子大小相关，小分子质量质粒转化效率较高。可通过切去质粒上不必要的片段，提高转化宿主细胞的效率，提高其外源DNA片段的装载量。3.3 目的基因与载体的连接用一定的限制性酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端；再用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，形成一个重组的DNA分子（重组质粒）。4 重组基因导入受体细胞构建工程菌 4.1 受体细胞的选择 常用的宿主细胞有如下几种：DH5a:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的b半乳糖苷酶氨基端实现a互补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高。JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌。JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌。MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体启动子质粒载体的宿主菌。4.2 重组质粒转化受体细胞 常用方法有转化法；转导法；转染法。5 筛选含有目的基因的受体细胞 原理：质粒上的抗生素的抗性基因 方法：利用选择培养基筛选 5.1 工程菌筛选方法5.1.1载体表型选择法载体表型选择法是根据载体分子所提供的表性特征，直接选择重组DNA分子的方法，主要包括：5.1.1.1抗药性标记插入失活选择法pBR322质粒是分子克隆中最常用的一种载体分子，编码有tetr ampr使带有该质粒的宿主细胞能在含有四环素或氨苄青霉素的培养基中生长。具体做法：将此转化菌先涂布在含有氨苄青霉素的平板上，并将存活的菌落原位影印到另一个含有四环素的夹板上，凡是在氨苄青霉素平板上生长，而在四环素夹板上不生长的菌落上就可能是已经获得了这种重组体质粒的转化子克隆。5.1.1.2-半乳糖苷酶显色反应选择法 除了抗生素抗性筛选之外， 质粒等载体上常用的另一种筛选标志是-半乳糖苷酶显色反应。当外源DNA插入到载体lacZ上，导致-半乳糖苷酶基因失活，可通过大肠杆菌转化子菌落再添加由X-gal-IPTG培养基中的着色变化直接观察出来。5.1.2 根据插入基因的表型选择法 其基本原理是：转化进来的外源DNA编码的蛋白，能够对大肠杆菌宿主菌株所具有突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化宿主细胞表现出外源基因编码的表型特征。这种筛选法受到一定的条件限制，他不但要求克隆的DNA片段必须大到可以包含一个完整的基因序列，而且还要求目标基因能够在大肠杆菌宿主细胞中实现功能表达。无疑，真核生物基因难以满足这些要求。其原因在于有许多真核基因是不能对大肠杆菌的突变发生抑制作用或起互补效应。此外，大多数的真核基因内部都存在着间隔序列，而大肠杆菌又不存在真核基因转录加工过程中所需要的剪辑机理，这样便阻碍了他们在大肠杆菌宿主细胞中实现基因产物的表