（参考幻灯片）泛素化final讲诉.ppt

THEUBIQUITINSYSTEM,1,泛素-蛋白酶体途径,真核生物细胞内蛋白质选择性降解的重要途径将蛋白共价连接上单个或多个范素分子催化范素化的酶有：泛素活化酶（E1），泛素结合酶（E2），泛素蛋白质连接酶（E3）由26S蛋白酶体识别和降解,2,Enzymaticreactionsoftheubiquitinsystem,3,经泛素-蛋白酶体途径降解的细胞蛋白：,细胞表面受体信号传导蛋白转录因子细胞周期调控的相关蛋白,故泛素-蛋白酶体系统参与细胞内多种代谢过程,包括细胞表面受体的下调、细胞内信号转导、转录以及细胞周期的调控，并与细胞凋亡、免疫应答以及细胞的一些生理功能和病理状态有着密切的联系。,4,2004年10月6日，瑞典皇家科学院宣布，将2004年诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙切哈诺沃、阿夫拉姆赫什科和美国科学家欧文罗斯(从左至右)，以表彰他们发现了泛素调节的蛋白质降解。,5,FunctionallyrelevantfeaturesoftheUbstructure.Thesevenlysineresiduesareshowninredandlabeled,whiletheL8I44V70hydrophobicpatchisshowningoldball-and-stick,泛素,泛素是于1975年发现的一种在真核生物细胞内高度保守的多肽，由76个氨基酸组成，分子量约85kD。泛素分子紧密折叠成球形，5股混合的R片层形成一个腔样结构，内部对角线位置有1个a螺旋。这个结构称为泛素折叠。,6,FunctionallyrelevantfeaturesoftheUbstructure.Thesevenlysineresiduesareshowninredandlabeled,whiletheL8I44V70hydrophobicpatchisshowningoldball-and-stick,泛素,这个小蛋白含有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出特殊的稳定性，能够防止在结合和靶向性降解循环中变性失活，从而保证泛素循环的运行。从泛素折叠中突出来的是具有一定变形性的C末端延伸部分，这个末端第76位含有一个泛素化必须的甘氨酸。泛素与其它蛋白都是通过C-未端第76位甘氨酸来连接的。,7,拥有暴露出来的双甘氨酸残基成熟的SUMO，C-末端甘氨酸通过硫酯键与E1激活酶的半胱氨酸残基相连。Ubc9是目前发现的唯一一种E2结合酶，它可以直接识别底物，从而最终将SUMO通过异肽键偶联到底物蛋白的赖氨酸残基上。,SUMO化修饰异常与许多人类重大疾病密切相关，如过表达Ubc9促进乳腺癌细胞的生长及肿瘤的发生；在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠-直肠癌和脑癌细胞中SUMO连接酶E3(PIAS3)都存在不同程度的表达上调。,8,9,多聚泛素分子的连接,10,FunctionallyrelevantfeaturesoftheUbstructure.Thesevenlysineresiduesareshowninredandlabeled,whiletheL8I44V70hydrophobicpatchisshowningoldball-and-stick,泛素分子间不同的连接方式产生作用不同的信号,泛素分子中的7个赖氨酸残基：K6K11K27K29K33K48K63,11,12,13,14,15,El可以水解ATP,与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素,在真核生物中，这个激活反应由两步构成:ATP和泛素起始形成泛素-腺苷酸中间物并释放PPi泛素-腺苷酸中间物与E1半胱氨酸残基发生反应形成E1-Ub硫酯键,16,E1,仅有单一的E1，对靶蛋白无特异性大约1100个氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸残基E1有2个亚型Ela和Elb，是由同一个mRNA在不同的起始位点翻译而成的，存在于细胞浆和细胞核中,17,级联反应的第二步是泛素分子在E2s(泛素结合酶或Ubcs)催化经过转硫醇反应从E1半胱氨酸残基转移给E2s活化的半胱氨酸位点。,E2s都含有一个保守的大约150个氨基酸的核心结构域，在结构域的中央是决定E2s活性的Cys残基，位于蛋白表面浅的裂隙内,结构可能与E3s的识别、E2s自身的活性以及底物识别有关。部分E2对底物蛋白的作用是有特异性的，如参与DNA修复的Ubc2/Rad6这种特异性可能来自于E2s与特异性的E3s之间的相互作用,18,E3s(泛素连接酶),底物识别（bindsdirectlyorindirectly）和催化泛素转移(directlyorindirectly,fromathiolesterintermediate)决定泛素化途径的底物的多样性和选择性,PossiblemechanismsofubiquitintransferbydifferenttypesofE3enzymes.,19,E3s的分类,不同类型的E3s之间没有同源性，目前发现有四种类型的E3：N-endruleE3hect(homologoustoE6-APC-terminus)domainfamilyCyclosomeoranaphasepromotingcomplex(APC)Phosphoprotein-ubiquitinligasecomplex,20,N-endruleE3,E3：大约200KD,识别并有特殊的结合N端序列由碱性氨基酸或疏水氨基酸组成的蛋白的位点;一些没有符合N端规则的N端氨基酸序列的蛋白底物，如没折叠的蛋白和N-乙酰化蛋白，可以结合在E3假定的“body”位点。,E3：识别并结合N端氨基酸不带电、小侧链的蛋白。,21,HECT(homologoustoE6-APC-terminus)domainfamily,含有HECT结构域的E3s。其C-末端含有一段大约350个氨基酸的区域与E6-AP(E6-associatedprotein)的C-末端同源。HECTE3s催化转硫醇反应将E2s中的泛素转移给HECT结构域内的保守的半胱氨酸残基。HECT结构域的缺失不影响底物的结合，高度可变的N末端结构域负责对特异底物的识别和结合。,22,Cyclosomeoranaphasepromotingcomplex(APC)特异性地为含有destructionbox的细胞周期蛋白进行泛素化修饰。,Phosphoprotein-ubiquitinligasecomplex磷酸化底物后是使泛素连接复合体更易对底物进行泛素化。,23,泛素化降解的信号,许多短周期蛋白通过磷酸化修饰作为进入泛素化降解途径的信号。,24,含PEST元件（富含Pro、Glu、Ser、Thr和S/TP序列，Cdk和其他磷酸化酶的作用位点）N-end-rule-systemDestructionBox已知的含该结构的细胞周期调节蛋白的泛素连接都由APC来催化,通过研究短周期蛋白的结构，总结出以下规律：,25,26s蛋白酶体,降解泛素化底物的一个ATP依赖型蛋白水解复合体。,26S蛋白酶体,20S核心蛋白酶(CP)670kD，蛋白酶解发生的场所,19S调节颗粒(RP)900kD，识别并结合聚泛素化底物，打开折叠再把它们转运到核心颗粒,26,20S核心蛋白酶(CP),4个7聚体蛋白环层（1-71-71-71-7）,环含有胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰样肽水解活性。两个环1、2、5六个亚基在它们的氨基端分别产生一个活性蛋白酶位点。,环两个亚基的氨基末端封住蛋白水解腔隙的入口，通过移去并重排氨基端残基来控制底物进入和产物排出。,27,19S调节颗粒(RP),盖子由8个亚基组成（Rpn3、5、6、7、9、12、8、11）。Rpnll亚基作为蛋白酶体中最保守的非ATP酶，是一个类似金属蛋白酶的蛋白，具有去泛素化活性。,19SRP由一个圆筒状基部(Base)和一个盖子(Lid)组成,基部连在CP的外表面，其中有6个ATP酶，这些ATP酶的功能很可能就是拆开底物，并调控底物进入蛋白酶体的过程。,28,除了19S调节颗粒外，还存在另一种调节颗粒，即11S颗粒；11S调节颗粒可以以类似于19S颗粒的方式与核心颗粒结合；11S颗粒可能在降解外源肽（如病毒感染后产生的肽段）上发挥作用。,19S调节颗粒,11S调节颗粒,29,蛋白酶体抑制剂及其应用,最初的蛋白酶体抑制剂是钙蛋白酶抑制剂I和II的派生物，它们不可逆地共价修饰具有催化活性的亚基中的苏氨酸。此类抑制剂特异性的不高，高浓度时抑制钙蛋白酶。相比之下，实验室中最常用的抑制剂为链霉菌属代谢物乳胞素则表现为蛋白酶体的特异性抑制剂。,蛋白酶体抑制剂应用于肿瘤，自体免疫疾病，艾滋病，哮喘等的治疗。另外，带有荧光基团的抑制剂也已经被开发应用于特异性标记组装好的蛋白酶体上的活性位点,30,去泛素化酶（DUBs）,泛素羧端水解酶（UCHs）水解去除和泛素C端连接的小肽。泛素特异性加工酶（UBPs）参与去除和解聚蛋白质上的多聚泛素链，从而防止多聚素在蛋白酶体的聚集。,去泛素化酶通过去除和解聚多聚泛素化链促进蛋白的降解；某些情况下，移除泛素分子又会使蛋白稳定，避免一些泛素化修饰不完全或错误修饰的蛋白进入泛素化降解途径。以此，去泛素化酶参与调节多种生