感染性疾病的分子诊断

分子诊断的临床应用,应用篇,1,整体水平,细胞水平,分子水平,2,分子诊断学(moleculardiagnostics)，利用分子生物学技术研究机体外源和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而为疾病的防治提供分子水平信息。用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。上世纪70年代人们开始在实验室进行研究，80年代以来，基因检测在许多国家已成为常规检验项目，主要用于感染性和遗传性疾病等的诊断。,3,第十四章感染性疾病的分子诊断,4,KeyPointsMoleculardiagnosisofinfectiondiseasemeanstoestimateadiseasethroughdetectingtheexistenceofgeneofpathogeniesdirectly,whichisarelativelysimple,rapid,specificandsensitivestrategyofdiagnosis.,5,Therearetwomainkindsofmoleculartechniqueswhichareusedtomoleculardiagnosisofinfectiondisease,amplifyingDNAprobesignalsandamplifyingtargetDNAfragment.,6,3.Associatedwithconventionaldiagnosismethods,moleculardiagnosiscanbeusedtodiagnoseinfectiondiseaseinducedbyvirus,bacteria,leptospira(螺旋体),chlamydia(衣原体),mycoplasma(支原体)andrickettsia(立克次体),etc.,7,4.Comparedwithotherconventionaldiagnosismethods,moleculardiagnosishasmanyadvantagesinearlydiagnosinginfectiondisease,identifyingthegenotypeofpathogenies,detectingdrugresistancegene,epidemiologicinvestigatingandsupplyingreliableevidenceforclinicaldiagnosisandtreatment.,8,第一节总论,9,1.诊断策略,感染性疾病的分子诊断主要是针对侵入人体内的病原体基因进行检测。不同的病原体有各自的种属特异的基因。一般性检出策略通过探针或扩增技术直接检出病原微生物的DNA/RNA，判断有无感染或何种感染。完整检出策略思路：诊断分型亚型耐药性检测,10,2.常用的诊断方法,信号放大检测技术方法不涉及靶分子扩增，采用多酶、多探针或二者结合等方式增加探针标记物的浓度从而使信号得到放大，提高检测的灵敏度。如：液相杂交、杂交捕获及支链DNA（bDNA）等特点美国FDA批准的商业试剂盒感染因素少，无扩增所产生的污染稳定性、重复性和特异性都较高，结果准确放大倍数少，灵敏度较低,11,2.常用的诊断方法,靶分子扩增技术检测方法即方法中包含靶分子（DNA、RNA或探针）的扩增过程的技术。如PCR及衍生的扩增技术、链替代的扩增方法（SDA）、转录依赖扩增系统（TAS）、依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）、连接酶链反应（LCR）特点我国所售的商业试剂盒简便、快速、灵敏度高存在扩增所带来的污染问题,12,3.诊断标本的处理,标本的选择标本量及抗凝剂标本的传送、保存标本的预处理,13,3.诊断标本的处理,标本的选择与传统一样，标本的选择要符合疾病的发病机制，能反映病程的状态。由于检测方法的高灵敏性，可适当考虑标本采集的便利性和通用性。由于核酸样本的稳定性，可选用福尔马林及石蜡包埋固定的组织标本。核酸的选择对疾病的判断也很重要。什么时候用DNA？什么时候用mRNA?,见表14-1-1,14,3.诊断标本的处理,标本量及抗凝剂少量标本：100ul-500ul不等，至多1ml。不同的检测方法，所需的标本量不一样。抗凝剂：EDTA、柠檬酸、草酸盐、肝素。肝素对转录酶和聚合酶有抑制作用，因此，基于PCR的检测方法一般不用肝素抗凝。,15,3.诊断标本的处理,标本的传送、保存根据标本的种类和检测目的，建立合理的运送体系。保证核酸完整性，防止标本相互间的交叉污染。,16,3.诊断标本的处理,标本的预处理核酸的提取(DNA提取、RNA提取)扩增抑制物的去除危险病原体的灭活,17,4.诊断结果的解释,阴性结果：阳性结果：定性检测结果：疾病状况的判断：,解释应包括病原体的生物学、病理学特征、实验技术的优点及局限性。,18,4.诊断结果的解释,阴性结果解释检查质控是否正常。检查检测灵敏度、核酸提取量及扩增效率是否正常。引起假阴性的因素：样品量不足、标本类型不恰当、收集时间不符合要求、运输过程中样本降解。,19,4.诊断结果的解释,阳性结果解释检测质控是否正常。注意检测的特异性和可能受到的污染等情况。产生假阳性的因素：引物探针的特异性、样本在采集、运送和处理等不同环节中的交叉污染问题。,20,4.诊断结果的解释,定性检测结果解释考虑定性检测的局限性考虑特定情况下，核酸样本的稳定性和不易降解性。,21,4.诊断结果的解释,疾病状况的判断病原体存在与患病之间的相关关系为正确判断疾病应：选择具有代表性的标本，采用具有说服力的检测方法，建立适量的临界值。,22,5.临床应用及评价,弥补血清学检测技术的缺陷检测不能培养或生长缓慢的病原微生物通过病原体的定量检测监测疾病微生物耐药性的检测细菌分型及流行病学的调查,23,第二节病毒的基因检测,24,病毒,核衣壳（nucleocapsid）,包膜（envelope）刺突（spike）,核酸（nucleicacid）DNAorRNA,衣壳（capsid）衣壳粒,25,检测病毒的方法,血清学检测病毒分离鉴定（诊断的金标准）PCR技术（检出率最高）,26,乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）,全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因中国：50%70%的人受过感染，8%10%是HBV携带者,世界其它地区,亚太地区75%,75%的长期慢性携带者来自亚太地区,HBV的形态特征,DNA病毒双链（非环状）DNA不等长正链（2/3）负链,28,肝炎病毒基因的检测(hepatitisBvirus,HBV),乙肝病毒基因组中有4个ORF，分别称为S、C、P和X。S区编码HBV的包膜蛋白，C区编码含HBeAg和HBcAg的多肽，P区编码依赖RNA的DNA聚合酶。必须经过逆转录复制过程，该病毒编码的RNA-DNApolymerase缺乏校正功能导致变异率较高,29,30,HBV在肝细胞内的复制,A(n),mRNA,cccDNA,HBsAg包膜,负链DNA,包裹后的前基因mRNA,传染性HBV病毒颗粒,传染性HBV病毒颗粒,部分双链DNA,逆转录酶,DNA聚合酶,肝细胞,31,急性感染时期HBV的标志物,HBV检测窗口期血清学（HBsAg）：56天PCR：33天缩短23天（平均6-15天）,32,HBV基因分型,HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亚洲人群E型主要存在于西非F型仅见于中南美洲的土著人G型和H型很少见不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的D型,33,HBV分子诊断方法,HBVDNA检测（PCR）PCR引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。PCR引物常根据其S、C、P和X基因中的高度保守序列来设计。,部分常用的引物序列,1样本处理（样本处理区）2核酸扩增2.1试剂配置（PCR前准备区）2.2加样（样本处理区）2.3PCR扩增（检测区）,HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）,35,YMDD突变检测方法,1.基因测序法2.荧光定量PCR方法基本原理确定探针特定的TM值来区分是否突变常用方法覆盖突变位点荧光双探针杂交,YIDDYMDDYVDD,46.9154.6450.74,36,HBV的分子诊断的临床应用,早期诊断监测治疗效果（病毒拷贝数）判断病情耐药检测,37,肝炎病毒基因的检测,临床价值主要体现在：病情评估血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。疗效预测治疗前病毒核酸载量越高，疗效越差；载量越低，机体清除病毒的可能性越大。,38,预后判断病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。垂直传播途径感染者，预后较差。反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸水平经常波动者更易发展为肝硬化。,39,病毒分型和耐药检测各个编码区段存在着大量有意义的自然变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异株，从而导致HBV感染的不同血清学和临床表现。检测HBV的变异株对了解疾病机制、药物耐受和指导用药有一定的价值。,40,humanimmunodeficiencyvirus（HIV）,全国累计报告HIV感染者地理分布,截至2005年12月底,HIV在宿主细胞中的复制,Step1:BindingStep2:ReverseTranscriptionStep3:IntegrationStep4:ReplicationStep5:TranslationStep6:ViralAssembly,第一节病毒的基因检测,靶细胞：CD4+T细胞,HIV基因组,基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同其正链RNA分子大小为HIV-19.3kb有3组共8个基因HIV-29.7kb有3组共9个基因5端有帽子结构，3端有poly(A)结构,第一节病毒的基因检测,HIV基因组,第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序（longterminalrepeats）gag（groupofantigen)基因：编码核心蛋白pol（polymerase）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶env（envelop）基因：编码包膜蛋白LTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性第二组：参与基因表达的调节基因tat（trans-actingtranscriptionalgene）rev（regulatorofexpressionofviralprotein）nef（negativeregulatorfactor）第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因vif（viralinfectivityfactor）vpu（viralproteinU）vpr（viralproteinR）,第一节病毒的基因检测,HIV基因组遗传变异率高,高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异，是基因组的保守区域HIV疫苗研发难度大,第一节病毒的基因检测,HIV-1感染后病毒标志物的变化,第一节病毒的基因检测,窗口期：检测抗体2-12周检测p24抗原2-3周检测RNA11天,HIV检测,HIV抗体检测（窗口期测p24抗原，可辅助诊断）初筛试验：酶联免疫吸附试验（ELISA）试纸（金标试纸，双抗原夹心法）最短在感染6天之后就可以检测到确认试验：免疫印迹（Westernblot,WB）HIVRNA测定（RT-PCR）,第一节病毒的基因检测,HIV病毒载量（HIVRNA定量）,主要有三种技术：RT-PCR（最低检测限为50copies/ml）bDNA（最低检测限为50copies/ml）NASBA（最低检测限为20copies/ml）NASBA（nucleicacidsequence-basedamplification）基于核酸等温扩增技术PCR检测前病毒DNA，对出生48h内婴儿的检测敏感性为38%，出生14d婴儿的检测敏感性可为93%,第一节病毒的基因检测,第三节病原菌的基因检测,50,结合分歧杆菌的基因检测,结核分歧杆菌MTb，俗称结核杆菌TB，是结核病的致病菌。带病菌的痰液是TB主要的传染源。MTbH37Rv基因组结构：环状双链DNA，共4411529kb，富含重复序列尤其是插入序列、多基因的家族序列及重复的管家基因序列。,51,TB分子诊断方法1,临床标本处理：标本：痰、胸腹腔积液、血清、尿液、脑脊液处理：液化剂去除粘蛋白，若带血则用红细胞裂解液去除血红蛋白，提取DNA,52,TB分子诊断方法2,常用的是靶分子扩增方法：直接PCR法、SDA法、LCR法扩增片段：抗原蛋白编码基因-165bp、MBP64-240bp、IS6110-123bp、IS986-245bp、16SDNA-584bpTB的种属鉴定：以16SrRNA为靶基因美国FDA：Amplicor检测和MTD检测,53,TB分子诊断方法3,耐药性检测耐药性分子基础：利福平是抗结核治疗的关键药物。耐药的分子基础是RNA聚合酶的突变，主要集中在rpoB基因的81bp区域。耐药性鉴定：PCR-SSCP法和点突变的检测法,54,分子诊断技术在很大程度上改变了感染性疾病的诊断方法,适用于检测不能或不易培养、生长缓慢的病原微生物，如结核分枝杆菌、苍白螺旋体、病毒等；通过检测细菌