质谱发展历史-基础知识.ppt

第一章简介,一.质谱的发展历史1906年J.JThomson在实验中发现带电荷离子在电磁场中的运动轨迹与它的质荷比(m/z)有关,并于1912年制造出第一台质谱仪.1946年发明飞行时间质量分析器(Time-of-flightAnalyzer)1953-1958年出现四极杆质量分析器(Quadrupole)1956年GC-MS开始联用1959年质谱首次用于peptidesequencing1965年离子共振质谱出现1968年电喷雾离子源ElectrosprayIonization1973年LC-MS1974年FouriertransformioncyclotorresonanceMS1987-1988年Matrise_assistedlaserdesorptionionization1996年电喷雾离子源开始用于生物大分子的研究,什么是质谱仪?,质谱仪是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子.测定分子量进行成分和结构分析.离子的生成方式有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化)主要组成部分:1.进样部分2.离子源3.质量过滤器(分析器)4.离子检测器,离子源,质量过滤/分析器,检测器,进样部分样品板LC或GC,EI源FAB源MALDI源ESI源,QuadruopoleIontrapTime-of-flight,电子倍增器闪烁计数器,第二章质谱仪的组成,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,第一节进样部分,要求：大气压下的样品要进入高真空的质谱仪，而不影响仪器的真空度。方式：进样板进样进样头进样毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱）,第二节离子源,A:EI源ElectronIonization是1980年以前的主要离子化方式,只能用于远远小于生物有机分子的小分子(400Da以下)的检测,样品需经过汽化(通常热解吸附)进入电离区,与电子流撞击.电子流传递部分能量(多小于6ev)形成离子及部分碎片.,EI的优缺点,优点1.级的灵敏度2.有达10万个化合物的数据库可快速检索3.可根据碎片方式鉴定未知物4.从碎片离子判定结构,缺点1.质量范围小2.有可能汽化前发生解离3.碎片过多有时看不到分子离子,FBI快速原子/离子轰击离子源FastAtom/IonBombardment,使用高能量的氙原子Cs+离子或甘油-NH4+集团喷射样品靶上的样品和基质表面,基质是溶解样品的非挥发性溶剂,样品从基质中解吸附并汽化,离子化.基质的作用是溶解样品;吸收大部分能量,有助于样品离子化并保护样品不被高能量撞击破坏.,FBI优缺点,优点1、质量数可以做到7000Da。2、快速。3、软电离方式，碎片离子少。4、容易引入阳离子形成M+Na,M+K型的正离子。5、分辨率高。基质可作为参照离子进行精确质量测定。6、大质量的甘油团形成多电荷可测生物大分子。,缺点1、质量数高时灵敏度下降严重。2、灵敏度比MALDI,ESI低。3、碎片少，结构信息少。4、基质多峰，干扰结果分析。5、样品必须能溶于基质。6、非极性物质难以离子化。,C:MALDI激光解吸附离子源Matrix-AssistedlaserDesorption/Ionization,MALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。1、使用基质，但基质为固体。2、MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。,常用基质,1、氰基4羟基肉桂酸CCA多肽2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸SA蛋白3、龙胆酸（2,5二羟基苯甲酸DHB聚合物4、吡啶甲酸PA5、3羟基吡啶甲酸3HPAMALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析,常用基质结构,DHB,SA,CCA,MALDI的优缺点,优点1、质量数可达300,000Da。2、attomole至femtomole级灵敏度。3、软电离方式，无或极少碎片离子。4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。5、适于分析复杂混合物。,缺点1、分辨率低。2、1000Da以下基质峰干扰。3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。5、不能分析非共价键相互作用。6、定量时需要内校准。7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。8、对各种赋形剂的容忍度低（如含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。,SamplesubmissionInsolution,asconcentratedaspossible,volume10-20ulMinimumConcentration10pmol/microliterUse200ulPCR-styleeppendorftubes,ThesampleshouldNOTcontainanyAzideSDSBrij35TrisbaseCHAPSTritonX-100,TreducedTritonX-100DMSOTweenDMFZwittergentGlycerolanyotherdetergentPhosphatebuffersSaltsandbuffers100mM,ThefollowingcomponentsareACCEPTABLEAceticorformicacidAcetonitrile,ethanolGuanidine/HCl4MHexafluoroisopropanolupto40%MethanolSodiumchloride10mMUrea1M,D:ESI离子源ElectrosprayIonization,4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。一般分析物分子量2000Da带多电荷,NANO-ESI喷雾照片,ESI特点,1、ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。,电荷数和质量数的计算,已知mj=(m+nj)/njmk=(m+nk)/nknj=nk+1推算出nj=(mk-1)/(mk-mj)nk=(mj-1)/(mk-mj)m=mjnj-nj=mknk-nk,m/z,相对丰度,mj,mk,ESI优缺点,优点1、质量数可达70，000Da2、灵敏度高达femtomole级。3、软电离，可观察生物分子非共价反应。4、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。5、没有基质干扰。6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。7、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。8、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。9、特别适于测多肽的修饰。10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。,缺点1、耐盐能力低。2、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。3、样品需先气化，混合物不适用。4、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。5、定量时需内校准。,E:其他离子化方式,阳离子化:以非共价键结合的方式向中性分子加上正电荷。尤其适合质子化不稳定的的分子，质子化是共价键结合，电荷从质子向分子发生转移，这以过程会造成分子的不稳定，使分子裂解。阳离子化没有这一缺点，常用在ESI离子方式中，糖类非常适合这一电离方式，一般多加Na+.阴离子化:分子失去一个质子，带上正电荷，这种离子化方式适合酸性物质，如酚类、羧酸和磺酸。,第三章质量分析器（过滤器）,第一节：质量分析器的主要指标A、质量范围（/）所能测量的质荷比范围M+nHB、灵敏度一定浓度样品产生响应时，最低的浓度值。,n,D、分辨率质谱分辨不同质荷比离子的能力分辨率R=M/a=M/(MM)ba公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比b公式定义为相邻的相交10的两个峰MM按a式计算的分辨率约为b式计算的两倍。,不同分辨率谱图效果,E：分子量的表述方式,1、单同位素质量monoisotopicmass最轻的稳定同位素的质量（也有说自然界中丰度最大的同位素的质量）。只有高分辨率的质量分析器才能分离出单同位素峰。,2、化学平均分子量M根据同位素质量及丰度计算出平均质量，所有元素的平均质量给出分子的平均质量。3、最高峰质量即未分辨开质谱峰最高处的质量数。表述方式要看分子量及分辨率而定，当m/z高时单同位素峰已不是丰度最大的峰，m/z8000时与最高峰质量趋于一至。,第二节质量分析器的种类,A、四极杆质量分析器QuadrupoleAnalyzerA、B极性相反，加上一个直流电压DC，叠加一个射频电场RF，扫描时固定RF频率，DC：RF保持比率不变，数值递增，使m/z小到大的离子依次通过，取得一张完整的质谱图。,DC+RF,四极杆质量分析器的优点,四极杆质量分析器通常与EI、ESI源联接1、能容忍相对低的真空度（约10 x10Torr）2、m/z可达3000，ESI离子源产生的多电荷生物分子离子m/z正好多在3000以内。3、开销低廉。,B、离子阱质量分析器,三维的四极杆，RF加在环形电极上。,环形电极,离子阱质量分析器,三维的四极杆，RF加在环形电极上。,C、飞行时间质量分析器Time-of-FlightAnalyzer,离子的E=UZ=mv飞行时间t=,t=const,L,v,m,z,反射飞行时间质量分析器(RETOF-MS),Uref,TOF对真空度的要求非常高10TorrMALDI源一般同时联接Time-of-FlightAnalyzer和RETOF,D、傅立叶回旋共振质量分析器fourierTransform-IonCyclotronResonance,质量精度最高，达0。001,几种质量分析器的比较,第三节：质量分析器的串联,目的：碰撞诱导产生碎片离子，进行结构解析Collision-induceddissociation(CID)Ionsourceiondaughteriongranddaughterion,选择离子,MS,CID,MS/MS,CID,MS/MS/MS,空间串联质谱仪,A、串联四极杆（三级四极杆）triple-QuadrupoleAnalyzerQ为过滤单元Q为碰撞单元Q为分析单元,几种检测方式,1、MS方式：所有离子通过QQQ到达检测器。2、MS/MS方式：Q作为分析器选择母离子(前体离子），Q作为碰撞室产生子离子，子离子由Q分析。3、MS方式：,三级四极杆的几种扫描模式,1、子离子扫描模式：即MS/MS。2、前体离子扫描模式：Q依次将所有离子输入Q碰撞解离，Q设定一个特定子离子值，只检测此特定子离子，Q与Q联接，当检测器检测到子离子时，质谱仪记录的是Q中的子离子值，质谱图显示的是所有产生相同子离子的母离子。3、中性丢失扫描：Q扫描与Q有一特定质量差异的子离子，谱图显示的是所有特定中性分子丢失的母离子。,B、三级四极杆飞行时间质谱仪Quadrupoletimeofflight,C、飞行时间飞行时间质谱仪Time-of-flight/time-of-flight,时间串联质谱仪,A、离子阱质谱仪：,B、傅立叶回旋共振质谱仪Fouriertransform-ioncyclotronresonance,离子进入共振腔后，通过调控RF，选择特定的母离子留在腔内，再引入惰性碰撞气体碰撞,产生碎片,并检测碎片离子，这一过程不断重复至MS。,几种串联质谱优缺点对比,第四章检测器,一、电子倍增检测器：真空度低，表面易污染，寿命一般12年。,二、光电转换倍增器（闪烁计数器）,电子发射撞击荧光屏，荧光屏发射光子由光子放大器检测。光子放大器密封在容器中，光子可穿过密封玻璃，避免表面污染，寿命为5年。,三、HED(High-EnergyDynodeDetector),在离子倍增器前加一个加速静电场，离子加速后产生更多的二级电子引发电子雪崩，灵敏度更高。,四、FT-MS,FT-MS本身就是一个检测器，因为离子诱导产生的可检测电流与m/z有关。,第五章、质谱在生物学中的应用,一、肽质量指纹谱鉴定蛋白。二、串联质谱鉴定蛋白技术,ThenomenclatureofthecommonpeptidefragmentionsdevelopedbyRoepstorffandFohlman,Theproposedmechanismofformationofbandy-typeions,三、肽序列标签技术,通过测部分氨基酸序列，结合此序列前后的离子质量和肽段母离子质量进行数据库检索，称为肽序列标签技术。,四、O标记从头测序技术,蛋白酶解时，酶解液中H2O和H2O各占50，酶解后肽段的羧基端上的羟基氧O/O丰度比1：1，使Y型离子系列的M+2/M同位素峰的丰度高于正常未标记O的离子的同位素丰度比。,18,18,16,18,16,18,五、磷酸化蛋白质的鉴定,A：MA结合磷酸酶水解,磷酸化蛋白,MS,蛋白酶水解,MS,磷酸酶脱HPO3,MS,通过比较几级质谱图，比较质量数少80Da或80倍数的肽段。,B、串联质谱进行母离子、中性丢失扫描，分析含HPO3的肽段产生的特征离子，直接从混合肽段中找出磷酸化肽段。,C、PRD-MALDI-MS用源后衰变技术寻找质量数少80Da或98Da的肽段来判断磷酸肽。,D、用IMAC技术分离/富集磷酸肽对比前后质谱变化寻找磷酸肽。IMACimmobilizedmetalaffinity固相金属亲和色谱。IMAC对磷酸肽有高选择结合能力，富集后用高PH或磷酸盐洗脱后测质谱。,E、磷酸化位点的确定,找到磷酸肽后，串联质谱子离子扫描模式对磷酸肽进行序列分析。,F、磷酸化定量分析,1、N稳定同位素标记法：,N培养基,14,15,N培养基,14,2、同位素亲和标记法,细胞池1,细胞池2,混合,消除氘,消除氢,亲和纯化,酶解,MS,磷酸肽或磷酸化蛋白在缄性环境下发生消除，同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应，亲核试剂一种为氘原子、一种为氢原子，再接上一个亲和标签（如生物素biotin），混合酶解，提取含biotin的肽段进行MS检测。,六、糖基化蛋白的鉴定,A、用糖甙内切酶切断糖链与蛋白链间的糖甘键，将反应前后的质谱图比较，可知糖链的平均质量。,B、糖基化位点的确定,先用蛋白酶酶解成含糖链和不含糖链的肽段，获得其肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶切除糖链，其肽质量指纹谱将发生变化，含糖肽段发生丢失位移，通过网上数据库检索其序列，找到位点。,C、用凝集素直接提取含糖肽段，再结合质谱技术分析,凝集素对含糖肽段有专一亲和性,七、质谱在蛋白质组学中的应用,A、稳定同位素代谢标记技术。前面已介绍B、同位素亲和标签技术,ICAT,专一与Cys共价结合,优缺点,优点1、兼容分析任何条件下的体液、细胞、组织中的绝大部分蛋白。2、烷化反应在盐、去垢剂/稳定剂（如SDS、尿素盐酸胍等）存在下都可进行。3、只分析含Cys残基的肽段，降低分析复杂性。,缺点ICAT本身分子量较大（500Da左右）增加数据检索复杂性。无法分析不含Cys的蛋白。,Why2DLC/MS?,可鉴定极端具有pI、疏水性、分子量的蛋白质适合膜蛋白重复性好容易自动化上样量大高灵敏度（溶液酶切）可根据样品灵活配置（但最后一维一般为RP）,ThenwhySCX/RP/MS?,SCX和RP的分离原理是互补的SCX按荷电情况，PR按疏水性流动相是兼容的pH3，ACN/water/saltSCX流动相中的盐可以在RP时有效去除Trypticpeptides在SCX柱上可以有效保留Trypticpeptides在SCX条件下是稳定的,SeparationpowerPeakcapacities,2DE500-10,000proteinspotsAffinityChromatography2IonexchangeChromatography10proteinlevelGelfiltration10ReversedPhaseChromatography50IonExchangeChromatography25ReversedPhaseChromatography100peptidelevel2DLC(IEX/RPC)2,500LinearITMSn18,000mph*,*measurementsperhour,(7)SampleConsiderationsforLC/MS样品的要求,TheAnalyteMustHaveIonizableGroupsAminesCarboxylicAcidsKetones,AldehydesForBestSensitivity,WorkatapHWheretheAnalyteisIonizedNeutraltobasicpH(7-9)foracidsAcidicpH(3-4)forbases,SampleConsiderationsforLC/MS,PositiveIonModeAnalyte=(M+H)+NegativeIonModeAnalyte=(M-H)BasicCompoundSensitiveinPositiveIonModeAcidicCompoundSensitiveinNegativeIonMode,Gel,Gelspot,Proteolyticpeptides,MixtureofProteins,Digestion,Proteolyticpeptides,Digestion,LC,ProteinIdentificationWorkflows,PeakFinding,Peaklist,SearchofaSequenceCollection,IdentifiedandProteins,ProteinCandidates,SignificanceTesting,ProteinFunction?,SequenceSimilaritySearch,RPC,IEX,RPCtrap,RPCtrap,on-lineelutionbysaltplugstotrapcolumn,IEX,off-linegradientelutionwith“classical”fractioncollection,RPC,2DLC的三种配置形式,IEX,RPC,in-lineMudPIT,on-line2D-LC,优点全自动样品体积可根据后续RPC调整在线脱盐、浓缩自由选择缓冲盐,缺点SCX峰容量有限ACN浓度在IEX和RPC得一致两相分离都没能在最佳状态下进行,off-lineSCXwithfractioncollection,优点两维分离都有可能在最佳状态下进行，得到最好分辨率和峰容量可自由选择缓冲体系样品体积可根据后续RPC调整速度快（只需一个SCX操作）SCX馏份可留待以后分析(ESI和MALDI均可）,缺点自动化程度低,ThesecretbehindsensitivityReducingcolumndimensions,75mI.D.columnsand200nl/minarethestandardtoday,75mI.D.columnsand200nl/minarethestandardtoday,DatadependentMS/MS,基本原则先做一次全扫描（fullMS)，记录个丰度最高的离子然后依次对这X个离子进行CID,做MS/MS(fullMS2)然后再做全扫描,下一个datadependentMS/MS开始Dynamicexclusion某个离子在做了一定次数（比如2次）的MS/MS后，将在一定时间内（比如3min）不再作为侯选离子。,碎片离子的命名,Residuename(A-Z)monoisotopicmassaveragemassA71.0371171.0788B114.53493114.59625C103.00919103.1388D115.02694115.0886E129.04259129.1155F147.06841147.1766G57.0214657.0520H137.05891137.1412I113.08406113.1595J0.00.0K128.09496128.1742L113.08406113.1595M131.04049131.1925N114.04293114.1039O0.00.0P97.0527697.1167Q128.05858128.1308R156.10111156.1876S87.0320387.0782T101.04768101.1051U150.95364150.034V99.0684199.1326W186.07931186.2133X111.0111.0Y163.06333163.1760Z128.55059128.62315,氨基酸残基质量,ESI-MS/MSvsMALDI-MS/MSwhyLTQ/LCQtypeinstrumentsopopularinproteomics?,主要特点1能做高通量、复杂体系的蛋白质鉴定，通量约为每小时鉴定100200个蛋白。2动态范围宽，能在混有大量高丰度蛋白的体系中，鉴定出痕量的低丰度蛋白。3如数据库中检索不到结果，可自动进行denovo的测序。4集成ICAT或其它同位素标记的蛋白定量方法。5能测定多种翻译后修饰（如：磷酸化、糖基化等）的个数和位点。6能够测定寡核苷酸序列。7能够解析蛋白的一些共价和非共价的相互作用。8能够表征药物、天然产物等的结构，推测其断裂机理，进行药物代谢研究。9对化合物进行精确定量分析。10灵敏度高达fmol级，分辨率高，可进行超高分辨扫描。,Whynanospray,提高灵敏度,ProtocolforaKeratin-FreeEnvironment,1)Performasmuchworkaspossibleinabiologicalsafetycabinet(