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文档简介

实验基本技术,分子生物学部分,存在问题,1.基本的实验技能2.实验习惯3.责任感和安全性,态度决定一切!,核酸纯化技术离心分离技术凝胶电泳技术核酸定量技术分子杂交技术序列分析技术,一核酸纯化技术,原理,1.核酸混合物成分:结构类-细胞碎片，细胞器，其他大分子-DNA，RNA，Protein，糖类，脂类等小分子-氨基酸，小分子糖类和脂类，水，无机物等2.关键:DNA，RNAProtein3.方案：Protein变性苯酚：强变性25氯仿：弱变性24异戊醇：消泡1,4.苯酚的处理：重蒸-饱和-pH重蒸：去除醌类氧化物饱和：防止核酸损耗pH：pH7.0-8.0-核酸最适合方法：蒸馏（183）-收集（棕色瓶）-饱和与调pH（Tris-HClpH8.0）-0.1%8羟基喹啉-4或-20保存,方法,样品+等体积饱和苯酚10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡离心（12000*g）取上清,核酸相Protein变性相有机相,二离心技术,原理,离心力：F=2rmRCF=F/G=2r/g=（2*rpm）2r/g=1.119*10-5(rpm)2r浮力密度：K=m-mp0/p沉降阻力：f*(dx/dt)RCF=k+f*(dx/dt)差速离心密度梯度离心,操作,离心机分类：普通6000rpm高速20000-25000rpm超速30000-80000rpm平衡温度-离心力-转速转头：角转，平转，垂直转,三凝胶电泳技术,原理,等电点：DNApI=6.0-7.0琼脂糖-PAG：支持介质U=V/E=（d/t）/（v/l）=Q/(6r),电泳影响因素,1.DNA物理性质质粒：CCLOC线形：10M正比1/m2.介质性质10U=10U0-KrT分离范围：agrose：100bp-60kbPAG：5-500bp3.电压：5v/cm4.缓冲液：TAE，TBE，TPE,四核酸定量技术,原理,A=10（1/T）=abc浓度：稀溶液（A-0.05-1.0）+b=1cmDNA：1OD260=0.05ug/ulRNA：1OD260=0.04ug/uldsDNA：1OD260=0.033ug/ul纯度：OD260/OD280=1.6-1.8,五分子杂交技术,六序列分析技术,作业,1.市售苯酚为什么要饱和与重蒸？2.离心操作应该注意哪些问题？3.如果要分离470bp和5kbDNA应该选择什么凝胶？4.在核DNA定量时，取10uLDNA待测液，用TEbuffer稀释到100uL后，加入到0.5cm的石英比色皿中。OD260测定为0.21，问DNA待测液的浓度是多少？5.简述DNA序列分析的基本原理。
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