桑国俊 牛胚胎移植技术研究与应用

1,牛胚胎移植技术研究与应用,甘肃省畜牧兽医研究所桑国俊研究员,2,主要内容,一、胚胎移植技术基本概念二、胚胎移植技术的研究史三、胚胎移植技术技术要点四、胚胎移植技术的应用及产业化,3,一、胚胎移植技术基本概念,1、胚胎（embryo）2、胚胎移植（embryotransfer,ET）,4,胚胎有性繁殖的动物均有两个特殊的生殖细胞，即雄性生殖细胞（精子）和雌性生殖细胞（卵子）。精子和卵子在一定的条件下相遇，并互相融为一体，称为受精。受精卵通过细胞分裂从单细胞生命逐渐发育为多细胞的小生命，叫做囊胚。从单细胞期的受精卵到多细胞的囊胚期小生命叫做胚胎或者早期胚胎,5,早期胚发生过程简图,精子卵子受精卵（合子）2-细胞期胚4-细胞期胚8-细胞期胚16-细胞期胚桑椹胚囊胚,6,胚胎移植也称受精卵移植。是指将一头雌性动物（供体）的受精卵或早期胚胎移植到另一头雌性动物（受体）体内，使之继续发育为与供体动物具有相同基因型后代的技术过程还可以表述为利用家畜超数排卵技术、同期发情技术、人工受精技术、胚胎采集、胚胎培养和鉴定技术，以借腹怀胎的形式快速纯繁和扩群优秀高产畜禽、频危和珍惜动物的一项新的家畜繁殖技术,7,胚胎移植的意义,1、充分发挥优良母畜的繁殖潜力，提高繁殖效率2、加速品种改良，扩大良种畜群3、引进良种家畜的有效途径4、遗传资源保存上的应用5、诱发肉用畜怀双胎，提高生产效率6、作为研究手段促进相关学科发展7、防疫需要和克服不孕,8,胚胎移植技术的效益分析,据不完全统计，全世界目前年产胚胎移植牛超过35万头。美国、法国等发达国家每年参加后裔测定的青年公牛的80%来自胚胎移植所产的后代根据农业部科技司推荐的方法计算，平均每头胚胎移植后代比土种牛增加的直接经济效益为3.5万元。现在全国年产犊牛约5000万头，按照每年胚胎移植牛个百分点计算，年总经济效益将高达175亿元，市场潜力巨大,9,二、胚胎移植技术的研究史,时间主要成果发表人1890家兔胚胎移植获得成功Heape.W(命普)英1934绵羊胚移获得成功Warwick,B1949山羊胚移获得成功Warwick,B1951猪的胚移获得成功Kvansnikii,A1961绵羊国际间移植获得成功1964牛的非手术移植获得成功杉江佶等1971世界第一个胚移公司成立AlbetaLivestockTrasplantsLtd1972牛冻胚移植获得成功Wilmut,I&Rowson,I1979绵羊分割胚移植成功Willadsen,S1981牛分割胚移植成功Willadsen,S1982牛体外受精卵移植成功Brackett,B1984山羊体外受精卵移植成功花田章，旭日干,时间主要成果发表人1890家兔胚胎移植获得成功Heape.W(命普)英1934绵羊胚移获得成功Warwick,B1949山羊胚移获得成功Warwick,B1951猪的胚移获得成功Kvansnikii,A1961绵羊国际间移植获得成功1964牛的非手术移植获得成功杉江佶等1971世界第一个胚移公司成立AlbetaLivestockTrasplantsLtd1972牛冻胚移植获得成功Wilmut,I&Rowson,I1979绵羊分割胚移植成功Willadsen,S1981牛分割胚移植成功Willadsen,S1982牛体外受精卵移植成功Brackett,B1984山羊体外受精卵移植成功花田章，旭日干,10,中国胚胎工程研究,60年代鱼类、两栖类的细胞核移植(童第周)70-80年代ET兔(1973)、绵羊（1974）、奶牛（1978）、山羊（1980）、小鼠（1980）、马（1982）、猪70年代末-80年代初胚胎冷冻兔（1979）、奶牛（1981）、绵羊（1982）、山羊（1982）80年代嵌合动物小鼠（1982）、兔（1988）、山羊（1993）80年代胚胎分割小鼠（1986）、奶牛（1987）、山羊（1987西农）、绵羊（1987）、兔（1990）80年代末体外受精试管婴儿（1986）、试管动物小鼠（1987）、兔（1990）、牛（1989）、绵羊（1989）、山羊（1991）90年代细胞核移植山羊（1990），兔（1991）、牛（1995）、猪（1995）、小鼠（1996）90年代连续细胞核移植1993年，中科院发育所获得第二代核移植山羊。19921996年，西农大得到第1代至第5代核移植山羊。1995年，西北农大将滋养层细胞作为供体细胞，获得山羊,11,甘肃省胚胎移植概况,1985年前后，日本人在张掖临泽实施了奶牛胚胎移植，但未推广19972005年，甘肃省畜牧兽医研究所、甘肃省家畜繁育中心、平凉地区畜牧兽医工作站在平凉地区实施了肉牛、奶牛的胚胎移植1997？2005年，甘肃农业大学等单位开展了大量的牛羊胚移技术研究与应用工作,12,三、胚胎移植技术要点,1.供体和受体的选择2.胚胎生产3.胚胎质量评价4.胚胎保存5.受体牛的同期发情处理6.胚胎移植7.妊娠牛的管理,13,胚胎移植过程示意图,14,超数排卵,发情输精（配种）,胚胎回收,发情,胚胎移植,妊娠,正常繁殖或2个月之后再次进行超排处理,优秀供体母牛,受体母牛,IVF胚胎,15,1.供体、受体的选择,供体的选择常规的胚移首先需要选择理想的良种家畜品种作为供胚动物。以牛的胚移为例，在供体牛品种确定之后，首先应根据个体档案选择那些遗传性能优良和稳定的健康母牛作为候选牛。然后再根据营养状况、繁殖力、发情周期、年龄、对超排的反应及自然排卵正常与否等指标来进一步选择最理想的供体群，然后重新建立严格的供体档案，并根据在胚移过程中的实际情况重新评价或淘汰个别供体。供体由胚胎生产方实施受体的选择原则上是选择那些生产性低，数量多，健康无病，发情周期正常的适龄母牛作为移植受体。受体牛的状况对移植效果影响很大。见下表,16,受体牛的选择标准,1应有两个以上正常的发情周期2无繁殖机能疾病、炎性分泌物3无传染病（特别是布氏杆菌病）4身体健康，膘情在7成以上（按5级膘情分级，应为3-4级）5牛龄为26岁，体型较大，能承担妊娠和分娩工作6经产牛分娩在60d天以上，第一次发情一般不移植7产犊性能和泌乳性能良好，情性温顺8人工授精两次或胚胎移植两次不孕者不使用9无流产史，上胎无难产、助产情况，子宫弹性厚薄正常10黄体达到A、B级11青年牛达到16月龄以上，体重达到成年母牛体重的75%12品种供体的生产性能非常突出，受体可不受生产性能的制约,17,2.胚胎生产,体内受精胚超数排卵处理授精处理受精卵(胚)的回收(手术、非手术)体外受精胚屠宰牛卵巢的采集or活体采卵卵母细胞的成熟培养成熟卵的授精处理受精卵的发育培养,18,常用超排处理方法根据供体动物本身的血清激素水平的变化而设计，不同动物、不同个体和不同药物的处理方法不尽相同。牛通常在发情后第914天内进行处理1PMSG-HCG处理法2PGF2-PMSG(FSH)处理法3FSH-LH-PGF2处理法（最常用）,19,各国超排处理一览表,20,发情期激素水平和变化规律,21,比较典型的超数排卵日程安排,备注：宁波400-600iu；中动9-12mg；加拿大300-400mg,22,供体牛、羊的超排激素剂量减量注射,23,非手术采卵牛非手术采卵目前已发展为一项成熟的实用技术。1973年日本的杉江首先试制成功了牛非手术采卵的专用设备即非手术采卵器(金属三套管)，后经过改进和简化，成为目前普遍采用聚氯乙烯制作的带有球囊的双通路导管牛非手术采卵是一项技术性较强的操作过程，必须由经过严格培训的专业人员操作，在采卵过程中必须注意以下几点1)供体牛的选择、管理和超排2)采卵时间的确定(发情第7、8天)3)采卵器具和冲卵液的准备(见附表)4)冲卵前准备(保定、麻醉、清洗、灭菌和器具安装)5)冲卵(冲卵液的灌流和胚胎回收)6)冲卵后供体牛的处理(宫得康、PG)7)检胚和受精卵的质量检查注意点：熟练、无菌、保温,24,牛胚胎的基本发育阶段,移植胚胎与发情后生殖道周期相吻合,25,冲胚示意图,26,27,28,29,CL(CorpusLuteum),TheCLtakestheplaceofthefollicleProducesthehormoneprogesterone,30,附表牛非手术采卵用器具和药品试剂,采卵器内芯子宫采卵器(16-24号多孔式采卵器)粘液去除器及宫颈扩张器(选用)乳胶输液管及其控制系统注射器：打气(20ml)、输入输出液体尾椎麻醉(10ml)酒精棉剪毛剪麻醉药(静松林or2%普鲁卡因)量筒(500ml)回收卵过滤器塑料手套(无菌),31,附表PBS冲卵液的配方（g/l）,NaCl8.00KCl0.20CaCl20.10KH2PO40.20MgCl26H2O0.10Na2HPO41.15丙酮酸钠0.036葡萄糖1.00牛血清蛋白(BSA)3.00青霉素100iu/ml链霉素100g/ml双蒸水1000ml,32,3胚胎质量评价,采集到的胚胎必须经过可用性测定，才能用于移植或冷冻保存常用的方法有形态学鉴别法(根据胚胎形态，发育阶段)、短期培养法、荧光物质代谢法(利用二乙酰荧光素FDA)和死细胞荧光法(利用二味基苯吲哚)等,33,1-cell,2-cell,8-cell,Morula,Blastocyst,InnerCellMass(ICM),Blastocoel,Trophectoderm(TE),(A),(B),(C),(D),(E),34,牛胚胎发育特征,35,根据常规的形态学鉴别法可以把胚胎分为三级A级(优良)胚胎轮廓清晰、颜色均匀、细胞密度良好、不见细胞外突和水泡等B级(一般)胚胎轮廓清晰、颜色均匀、细胞密度良好、有突起细胞和水泡等，细胞变形率10-20%C级(较差)轮廓不清、颜色发黑、细胞数减少、外突细胞较多、变形率30-50%通常鲜胚移植时，A级和B级胚均可采用，用于冷冻保存时，通常只选择A级胚，因为质量较差的胚胎抗冻性较差，因此不宜用于冷冻保存,36,4.胚胎保存,短期保存活体保存体外37保存低温(010)保存长期保存(冷冻保存，供参考)常规冷冻保存快速冷冻保存玻璃化冷冻保存,37,常规的程序降冷冻方法以1-1.5M的甘油、乙二醇等小分子量的渗透性低温保护剂对胚胎进行平衡，脱水，然后装入细管内，程序冷冻仪按1-2/min的速率降温，在-7左右进行植冰(自动或人工)，然后继续以0.3-0.6/min的速率降温至-2535投入液氮(-196)长期保存。目前采用在此法基础上建立的一步冷冻法解冻按照冷冻程序逆向解冻，一步法可象细管冻精一样直接解冻后应用,38,快速冷冻方法采用2-4M的甘油或乙二醇和0.250.5M的蔗糖或乳糖为防冻剂，平衡0.530min即置于液氮蒸气中快速降温2min，然后投入液氮解冻按照冷冻程序逆向解冻玻璃化冷冻方法它是利用高浓度的混合防冻剂的骤冷时形成一种非冰晶体的玻璃化状态,使胚胎免受损伤的方法。这种方法只须将装有胚胎的细管从室温直接投入液氮即可（冷冻液10%EG；0.5mol/l蔗糖PBS液；EFS30液）解冻按照冷冻程序逆向解冻,39,牛胚胎的冷冻保存技术,40,液体配制,50ml12.5%蔗糖液的配制6.25g蔗糖+PBS45ml+5mlFCS+PN50iu+SM0.05mg50ml10%乙二醇的配制45mlPBS液+5mlEG，用0.22m25cm过滤器过滤后冷藏备用。5ml/瓶，-20EFS30液的配制1.59g聚蔗糖0.865g蔗糖+1.5ml乙二醇+3.5mlPBS液依次定溶至5ml,41,5.受体牛的同步发情处理,自然发情药物诱导发情药物诱导发情是指以生殖激素(性激素)在雌性动物性周期中作用为理论依据，应用某些激素和激素类物质人为的干预雌性动生殖生理过程，从而使其按着人们预定的计划和时间发情的技术过程,42,目前的处理方法抑制卵泡发育(孕酮处理)抑制黄体形成(用前列腺素PGF2处理)促卵泡成熟(用促性腺激素PMSG、hCG、FSH和LH处理),43,同期发情处理方法,同期化处理之前对受体牛进行直肠触摸，检查卵巢是否处于活动状态。处于活动状态的牛方可进行同期化发情处理。常用前列腺素法药品氯前列烯醇（PG）：0.2mg/2ml/支剂量经产牛0.30.4mg/次、育成牛0.20.3mg/次方法二次注射法（肌注）第一次注射：在黄体期任意一天第二次注射：在第一次注射后11天。第二次注射后2496h观察发情。受体牛发情之日计为0d，68d内进行胚胎移植,44,6.胚胎移植,以牛非手术移植为例，介绍移胚过程及要点选择同期发情处理后发情正常的受体牛,进行尾根麻醉移植前进行黄体检查，确认黄体，并记录移卵器具的灭菌、消毒移胚:将桑椹胚、囊胚和扩张囊胚分别移到同步发情第6、7、8天的母牛子宫角内。在整个过程中一定要注意无菌操作，缩短时间。胚胎污染或暴露时间过长均会明显降低受胚率移卵牛的管理和妊娠诊断,45,胚胎的装管和装枪,将优质胚胎装入0.25ml的细管，用细管需经过紫外线或气体消毒。细管在装管前须用培养液冲洗1-3次，注意不要弄湿棉塞。装管前要根据移植枪的规格将细管用消毒剪剪掉一截（日式移植器，法式不剪），然后再把细管插在1ml注射器or乳胶管吸球上，从中吸取胚胎。将装有胚胎的细管装人移值枪中，移值枪套有消毒过的塑料外鞘（日式or法式），再套上一层塑料套膜，防止移植枪在通过阴道时受到污染。当移植枪进入子宫颈外口后，将塑料套膜拉破。,46,黄体的检查,A检查黄体要在移植前或前一天实施B用力触摸黄体将引起黄体发生退化，因此要轻巧C当黄体形状不良有大卵泡存在时，或子宫收缩过紧张时，不予移植D根据黄体的形态、大小（用食指判定）和弹性等综合判定定级。见下图ABCD,47,影响牛胚胎移植妊娠率的因素,影响胚胎受胎率的主要因素胚胎质量和胚移时间的同期性受体牛的健康状况和发情同期程度操作人员的熟练程序及无菌操作程度详见下表,48,1胚胎因素,胚胎发育阶段对应期胚胎质量A、B级体内胚与体外胚20-70%、10-30鲜胚与冻胚冻胚复苏率70%胚胎死亡（2540%）染色体异常、自身免疫、感染性流产、营养不良、内分泌失良、年龄、环境,49,2.受体因素,品种年龄（胎次）饲养方式舍饲、栓系、散养营养、饲养管理高、中、低发情方式自然、同期发情掌握程度准确、供受体同期程度+1-1d黄体机能A、B级正常情期1822天子宫状态良无任何疾病,50,3.技术因素,移植人员的技术水平移植位置黄体侧、大弯部通过宫颈的难易程度子宫损伤程度损伤、穿孔防止污染未脱膜、粘液移植所用时间,51,四、胚胎移植技术的应用及产业化,胚移技术出现100年来，其学术意义和应用价值随着时间的推移越来越受到人们的重视。尤其是60年代以后，这一技术的发展尤为迅速原因有如下几方面,52,1、促进家畜的育种与改良,如果说AI的出现使公畜的繁殖潜力得到了最大限度地发挥，那么胚移技术的出现是提高母畜繁殖潜力的一次革命。这一技术可以使一头良种母畜比平时多排几倍至几十倍的卵子，受精后可以形成大量的胚胎，把这些胚胎移植给普通的受体母畜，就可以在短时间获得大批良种后代。美国人曾经用这种方法在两年内从一头良种奶牛得到了200头良种后代，而用传统的育种方法，这是绝对不可能的利用胚移技术不仅可以加速育种速度，而且可以促进特定家畜和动物品种的繁殖增产。例如原西德的研究人员曾将东印度的野牛胚胎移植给普通奶牛，使奶牛产出了小野牛；美国将斑马胚胎移植给普通马，生出小斑马。这意味着人们可以利用胚移技术来拯救那些频临灭绝的动物,53,2.引进良种家畜的有效途径,胚移技术和体外受精技术的结合，使世界范围内的家畜良种引进过程大为简便易行。常规的活畜引进不仅费用高，而且检疫手续非