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农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤 整理人：早熟组 赵凤利1、 准备试剂：1. 加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；2. 渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO412H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。1) . 500 mM MES (Sigma)：4.88 g溶于50ml dH2O，保存于42) . 20 mM Na3PO412H2O (BDH)：0.38 g 溶于50ml dH2O，保存于43) . 1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于 -20。2、 实验步骤：1. 将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28,200rpm；2. 取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；3. 1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；4. 重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；5. 取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值； 注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。6. 确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。7. 在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；8. 侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；9. 选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；10. 用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；11. 侵染前，用记号笔标记待转区域；12. 将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中13. 将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；14. 将侵染后的烟草放回培养室15. 2-3天后： 1). 亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察； 2). 启动子GUS活性：GUS
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