GB∕T38163-2019常见过敏蛋白的测定液相色谱-串联质谱法

书 书 书犐 犆犛 犃 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?犌犅犜 ?犇犲 狋 犲 狉犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犪 犾 犾 犲 狉 犵 犲 狀 犻 犮狆 狉 狅 狋 犲 犻 狀犔犆 犕犛犕犛犿犲 狋 犺 狅 犱 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由全国生化检测标准化技术委员会（ ）提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心、辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：陈颖、古淑青、邓晓军、张九凯、郑秋月、王娉、黄文胜、韩建勋。犌犅犜 常见过敏蛋白的测定液相色谱串联质谱法范围本标准规定了固态食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁和核桃过敏蛋白的液相色谱串联质谱检测方法。本标准适用于含小麦粉、燕麦粉、腰果、可可粉等固态食品基质中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁和核桃过敏蛋白的液相色谱串联质谱测定和确证。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法术语和定义、缩略语 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 特征肽犮 犺 犪 狉 犪 犮 狋 犲 狉 犻 狊 狋 犻 犮狆 犲 狆 狋 犻 犱 犲唯一在靶蛋白的胰蛋白酶消化产物中发现、其氨基酸序列具有专属性的多肽。 食物过敏犳 狅 狅 犱犪 犾 犾 犲 狉 犵 狔免疫机制介导的食物免疫反应不良反应，即食物蛋白引起的异常或过强的免疫反应。注：免疫反应可由 或非 介导。表现为一疾病群，症状累及皮肤、呼吸、消化、心血管等系统。 过敏原犪 犾 犾 犲 狉 犵 犲 狀能够引起机体免疫系统异常反应的成分。 过敏蛋白犪 犾 犾 犲 狉 犵 犲 狀狆 狉 狅 狋 犲 犻 狀能够引起机体免疫系统异常反应的成分中的蛋白质。 肽狆 犲 狆 狋 犻 犱 犲两个或两个以上的氨基酸脱水缩合形成的有机化合物。 胰蛋白酶狋 狉 狔 狆 狊 犻 狀从动物胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，特犌犅犜 异性较强。 缩略语下列缩略语适用于本文件。：二硫苏糖醇（ ）：碘代乙酰胺（ ） ：液相色谱串联质谱法（ ）：多反应监测（ ） ：三羟甲基氨基甲烷 （ ） 原理利用质谱技术结合蛋白质组学软件挖掘能够鉴别区分目标食品过敏原特征肽段。通过构建的特征肽段的质谱信息，对被测样品蛋白酶解后的多肽混合物进行定向监测，实现对食品过敏原的定性检测。质谱中特征肽段的响应峰面积与过敏原的含量呈线性关系，将质谱响应峰面积与过敏原含量建立标准曲线，以肽段的谱峰面积代表过敏原的实际量，通过标准曲线计算得到被测食品过敏原含量。主要试剂除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合 规定的一级水。 碳酸氢铵（） 。 二硫苏糖醇（ ，） 。 碘代乙酰胺（ ，） 。 三羟甲基氨基甲烷（ ， ） 。 盐酸。 磷酸。 乙酸（） ：色谱纯。 甲酸（） ：色谱纯。 乙腈（） ：色谱纯。 碳酸氢铵溶液（ ） ：称取 碳酸氢铵，用水溶解后定容至 。 碳酸氢铵溶液（ ） ：称取 碳酸氢铵，用水溶解后定容至 。 二硫苏糖醇（ ） ：称取 二硫苏糖醇，用 碳酸氢铵溶液溶解后定容至 。冷藏可保存一个月。 碘代乙酰胺溶液（ ） ：称取 碘代乙酰胺，用 碳酸氢铵溶液溶解后定容至 。避光冷藏保存一个月。 溶液（ ） ：称取 ，溶解于 水中，用 盐酸调节至 ，用水定容至 。 考马斯亮蓝试剂：称取 考马斯亮蓝 溶于 乙醇，加入 的磷酸，用蒸馏水补充至 。 甲酸的水溶液（ ，体积分数） ：准确移取 甲酸，用水定容至 。 甲酸的乙腈溶液（ ，体积分数） ：准确移取 甲酸，用乙腈定容至 。 胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶（活力大于 蛋白质） ，用 乙酸溶液溶解。溶液于 可保存个月。犌犅犜 主要仪器设备 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子（ ）源的三重四级杆质谱仪。 分析天平：感量为 、 、 。 恒温水浴锅。 离心机：转速不低于 犵。 超滤离心管（ 截止膜） 。 注射器和 水系滤膜（聚醚砜滤膜） 。 涡旋混匀仪。 计：测量精度为 。 微量移液器： ， ， ， 。 组织研磨器。 具塞离心管。 旋转蒸发仪。 分光光度计。 试样制备 标准工作液制备 过敏原标准品：榛子、核桃、杏仁、大豆、花生、全脂奶粉和全蛋粉，或等效商业化标准品。 食品基质标准品：小麦粉（饼干基质） 、腰果（坚果基质） 、燕麦粉（早餐谷物基质） 、可可粉（巧克力基质） （以上基质均无 中提到的种过敏原） ，或等效商业化标准品。 样品制备：称取每种过敏原标准品和食品基质标准品 ，采用粉碎机粉碎后，再将其研磨成细粉状，过 目筛，装入洁净盛样容器内，密封并标明标记，备用。 标准储备液：分别准确称取（ ） （精确至 ）过敏原标准品和食品基质（种过敏原分别配制种基质） ，充分混匀后加入 溶液，定容至 。震荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅 加热振荡提取。提取液以 犵高速离心 ，上清液过低蛋白质吸附的 聚醚砜滤膜后，用 方法（考马斯亮蓝法）测定提取液中总蛋白的浓度，总蛋白浓度在 以上视为有效提取，储备液置于 冰箱内保存备用。 系列标准溶液：准确移取适量的标准储备液，用含不同基质的 溶液配制成最终浓度为含全脂奶粉总蛋白 、 、 、 、 （相当于过敏原质量分数 、 、 、 、 、 、 ） ，花生、榛子、杏仁、大豆、鸡蛋、核桃总蛋白 、 、 、 （相当于过敏原质量分数 、 、 、 、 、 、 ）的系列标准工作溶液。 试样保存试样与蛋白提取液均在 冰箱保存。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。犌犅犜 分析步骤 蛋白提取与纯化称取混合均匀的试样约（ ）（精确至 ） ，于 具塞塑料离心管中，加入 溶液，振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅 加热振荡提取。提取液以 犵高速离心 ，取上清液过低蛋白质吸附的 聚醚砜滤膜，用 法（考马斯亮蓝法）测定提取液中总蛋白的浓度。准确移取上述蛋白粗提液 加入超滤离心管（ ）中，以 犵高速离心 ，超滤去除小分子杂质；向超滤离心管中加入 的碳酸氢铵，润洗超滤膜，以 犵高速离心 至膜上完全无液体残留，重复次。准确移取 碳酸氢铵溶液复溶膜上的截留蛋白，涡旋超滤离心管。 烷基化与酶解移取 碳酸氢铵溶液、 二硫苏糖醇溶液加入上述超滤管样品溶液中，混匀后置 下恒温水浴 ；冷却至室温，加入 碘代乙酰胺溶液，暗处静置 。 犵高速离心 至膜上干燥无液体残留。移取 的碳酸氢铵溶液 至超滤离心膜上，涡旋后 犵高速离心 ，超滤去除反应剩余碘代乙酰胺等杂质，离心至膜上无液体残留，弃掉收集管中的废液，并加入超纯水清洗。在超滤膜上加入 的碳酸氢铵溶液，并加入胰蛋白酶乙酸溶液，充分混匀后置于 恒温水浴中酶解。将超滤管进行 犵高速离心 ，至膜上干燥无液体残留，加入 的碳酸氢铵溶液，涡旋后 犵高速离心 ，重复次。合并收集管中的膜上酶切肽段，放入真空旋转蒸发仪中离心旋干。准确移取流动相甲酸水溶液（ ，体积分数） 复溶干燥后的肽段，涡旋后 犵高速离心 。移取上清液 于进样瓶中，供液相色谱串联质谱仪检测。 仪器参考条件 液相色谱条件：）色谱柱： 柱， （内径） ，填料粒径 ，孔径 （ ?）或性能相当者；）柱温： ；）流动相：体积分数为 的甲酸水溶液，：体积分数为 的甲酸乙腈溶液，梯度洗脱见表；）流速： ；）进样量： 。表梯度洗脱程序时间 流动相流动相 犌犅犜 表（续）时间 流动相流动相 质谱条件（不同品牌、型号质谱仪可做相应调整） ：）电离方式：电喷雾电离，正离子；）扫描方式：多反应监测（ ） ；）雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，参考质谱条件参见附录中表 ；）电喷雾电压： ；）离子源温度： ；）雾化器压力： （ ） ；）气帘气压力： （ ） 。 空白试验样品前处理时，除不加试样外，均按以上操作步骤进行。 定性测定在相同使用条件下，按照液相色谱串联质谱条件测定全脂奶粉、花生、榛子、杏仁、大豆、鸡蛋、核桃的标准工作溶液，同时测定样品溶液。定性时样品中待测物质的保留时间，与基质标准溶液的保留时间偏差在 之内；且样品中所选择的肽段定性离子均出现（附录中表 ） ，各组分定性离子的相对丰度与标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表液相色谱串联质谱法定性离子相对丰度的最大允许偏差相对丰度 允许的相对偏差 定量测定对标准工作溶液进样，每种过敏原选择一种丰度较高、线性关系较好的肽段，外标法通过标准曲线进行定量，平行测定次。标准工作液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。标准品提取离子色谱图（ ）参见附录中图 图 。结果计算和表述以定量离子的响应峰面积对相应的过敏原含量作图，试样中过敏原的含量按标准曲线所得结果计犌犅犜 算得到。各基质中各过敏原的含量按照式（）进行计算：犡犢犅犃（）式中：犡 过敏原的含量，单位为毫克每千克（ ） ；犢 定量离子对的响应峰面积；犅 标准曲线的截距；犃 标准曲线的斜率。 精密度在重复性条件下，获得的三次独立测定结果差值的绝对值，不得超过其算术平均值的 。 检出限、定量限和回收率 检出限和定量限本方法牛奶过敏原的检出限为 ，定量限为 ；鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁、核桃的检出限为 ，定量限为 。不同基质中的定量标准曲线及线性范围参见附录中表 。 回收率不同基质中添加浓度水平各待测过敏原的回收率范围参见附录中表 。犌犅犜 附录犃（资料性附录）过敏蛋白特征肽段及其主要参考质谱参数 种过敏蛋白特征肽段及其主要参考质谱参数参见表 。表犃 种过敏蛋白特征肽段及其主要参考质谱参数过敏原过敏蛋白特征肽段母离子犿狕子离子犿狕保留时间 去簇电压碰撞能量牛奶 （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） 鸡蛋 （） （） （） （） 大豆 （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） 花生 （） （） （） （） （） （） （） （） 榛子 （） （） （） （） 杏仁 （） （） （） （） （） （） （） （） 核桃 （） （） （） （） 定性时，每种过敏原的所有特征肽段同时出现视为“检出” 。为定量离子对。犌犅犜 附录犅（资料性附录）不同过敏原特征肽段定性检测提取离子色谱（犡 犐 犆）图犅 牛奶四种主要过敏原特征肽段定性检测犡 犐 犆图（见图 图 ）图犅 犛 犮 犪 狊 犲 犻 狀蛋白定性检测犡 犐 犆图图犅 犛 犮 犪 狊 犲 犻 狀蛋白定性检测犡 犐 犆图图犅 犮 犪 狊 犲 犻 狀蛋白定性检测犡 犐 犆图犌犅犜 图犅 （续）图犅 犮 犪 狊 犲 犻 狀蛋白定性检测犡 犐 犆图犌犅犜 犅 大豆三种主要过敏原特征肽段定性检测犡 犐 犆图（见图 图 ）图犅 犌 犾 狔 犮 犻 狀 犻 狀犌蛋白定性检测犡 犐 犆图图犅 犮 狅 狀 犵 犾 狔 犮 犻 狀 犻 狀 犮 犺 犪 犻 狀蛋白定性检测犡 犐 犆图图犅 犮 狅 狀 犵 犾 狔 犮 犻 狀 犻 狀 犮 犺 犪 犻 狀蛋白定性检测犡 犐 犆图 犌犅犜 犅 花生两种主要过敏原特征肽段定性检测犡 犐 犆图（见图 图 ）图犅 犃狉 犪犺蛋白定性检测犡 犐 犆图图犅 犃狉 犪犺蛋白定性检测犡 犐 犆图犅 榛子主要过敏原特征肽段定性检测犡 犐 犆图（见图 ）图犅 犆狅 狉犪蛋白定性检测犡 犐 犆图 犌犅犜 犅 杏仁两种主要过敏原特征肽段定性检测犡 犐 犆图（见图 图 ）图犅 犘 狉 狌犱 狌蛋白定性检测犡 犐 犆图图犅 犘 狉 狌犱 狌蛋白定性检测犡 犐 犆图犅 核桃主要过敏原特征肽段定性检测犡 犐 犆图（见图 ）图犅 犑 狌 犵狉蛋白定性检测犡 犐 犆图 犌犅犜 犅 鸡蛋主要过敏原特征肽段定性检测犡 犐 犆图（见图 ）图犅 狅 狏 犪 犾 犫 狌犿 犻 狀蛋白定性检测犡 犐 犆图 犌犅犜 附录犆（资料性附录）过敏原特征肽段在不同基质中定量标准曲线种过敏原特征肽段在不同基质中定量标准曲线参见表 。表犆 种过敏原特征肽段在不同基质中定量标准曲线过敏原过敏蛋白定量肽段序列线性范围 基质标准曲线犚（狀）牛奶 饼干狔 狓 早餐谷物狔 狓 坚果狔 狓 巧克力狔 狓 鸡蛋 饼干狔 狓 早餐谷物狔 狓 坚果狔 狓 巧克力狔 狓 大豆 饼干狔 狓 早餐谷物狔