Co-γ射线对八宝景天的辐射效应及变异植株的分析-硕士论文

t C l a s s i f i e dI n d e x ： U D C ： D i s s e r t a t i o nf o rt h eM a s t e rD e g r e e 。 T H EE F F E C TO F 6 0 C o 一丫 I R RA D I A T I O NO N s E D U MS PE C T A B I L EB 舰A U 黼 A N A I S I S0 FV A I U A N T C a n d i d a t e ： S up e r v i s o r ： A c a d e m i cD e g r e eA p p l i e df o r ： S p e c i a l i t y ： D a t eo fo r a lE x a m i n a t i o n ： U n i v e r s i t y ： 缪勋gH u a n h u a n P r o f G u oC h u n j i n g， M a s t e rO f A g r i c u l t u r e G a r d e nP l a n t & O m a m e n t a lH o r t i c u l t u r e J u n e ，2 0 1 0 N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y o，I 争、， ，二一 目录 目录 中文摘要I 英文摘要：。I I I 1 ，j ；l 言l 1 1 目的与意义2 1 2 关于辐射诱变育种2 1 2 1 辐射诱变育种特点_ 2 1 2 2 辐射源的种类3 1 2 3 植物辐射诱变材料的选取4 1 2 4 植物辐射诱变的机理。4 1 2 5 植物辐射敏感性机理。5 1 2 6Y 射线辐射诱变中应注意的问题5 1 3 观赏植物辐射诱变育种的研究进展。6 1 4 遗传标记研究进展及I S S R 标记在观赏植物研究中的应用7 1 4 1 遗传标记简介：。7 1 4 2 常用分子标记简介8 1 4 3I S S R 标记在观赏植物种质资源研究中的应用1 0 1 5 八宝景天的研究进展1 0 2 材料与方法。1 2 2 1 试验材料。1 2 2 2 方法：1 2 2 2 1 扦插繁殖1 2 2 2 2 辐射处理( 预处理) 。1 2 2 2 3 半致死剂量的确定1 3 2 2 4 正实验辐射处理1 4 2 2 5 形态学观察1 4 2 2 6 叶片中叶绿素含量的测定1 4 2 2 7 叶片中超氧化物歧化酶( S O D ) 活性的测定。1 5 2 2 8 叶片中过氧化物酶( P O D ) 活性的测定1 5 2 2 9 叶片中过氧化氢酶( C A T ) 活性的测定1 5 2 2 1 0 扫描电镜分析法。1 6 t 。2 2 1 1I S S R 多态性分析法1 6 2 2 1 2 数理统计分析法。1 8 2 3 本研究的技术路线。l8 3 结果与分析。1 9 3 1 半致死剂量的确定1 9 3 1 1 预实验中半致死剂量的确定1 9 卜一 l I 东北农业大学农学硕十学位论文 3 1 2 正实验中半致死剂量的确定2 1 3 2 植株对射线的敏感性反应2 2 3 2 1 死亡率的分段统计。2 2 3 2 2 辐射植株的性状表现2 3 3 3 不同辐射剂量对植株成熟期生长指标的影响2 4 3 4 不同辐照剂量对植株表型的影响2 5 3 4 1 不同辐照剂量对叶型的影响2 5 3 4 2 不同辐照剂量对植株叶片致变的影响2 6 3 4 3 不同辐照剂量对株形和分枝形式的影响2 6 3 4 4 不同辐照剂量对开花的影响2 7 3 5 不同辐照剂量对叶片中叶绿素含量的影响2 8 3 6 不同辐射剂量下叶片内酶活性变化。2 9 3 6 1 不同辐射剂量下叶片内S O D 活性变化2 9 3 6 。2 不同辐射剂量下叶片内P O D 活性变化2 9 3 6 3 不同辐射剂量下叶片内C A T 活性变化3 0 3 7 变异植株的选择3 0 3 8 辐射对八宝景天变异株叶片气孔的影响3 l 3 8 1 对气孔形态的影响3 l 3 8 2 对气孔大小的影响- 3 2 3 9 八宝景天的I S S R 多态性分析3 2 3 9 1 八宝景天总D N A 的提取及质量检测- 3 2 3 9 2I S S R 优化反应体系的建立3 3 3 9 3 引物筛选及扩增结果3 7 3 9 4I S S R 扩增结果分析3 9 下部茎植株， 上部茎植株为最佳辐射诱变材料。 。 ( 2 ) 八宝景天扦插苗的半致死剂量L D 5 0 为1 0 0 G y ，可诱导植株变异的最适剂量为5 0 G y 。 ( 3 ) 辐射后八宝景天变异株或变异枝的产生方式主要有四种：植株长到一定程度发生 分枝且主干顶端单生；主干上互生很多枝，顶端生长停滞；在同一叶腋处产生多个分枝、在 一个植株干的同一轮处互生很多枝：地上植株死亡后从根部长出新的M 1 代变异株。 ( 4 ) 辐射后植株的性状变异早期主要表现在叶型、株型、花型上。叶型变异表现为叶 片不对称、叶色白或黄有条纹、扭曲、叶尖内凹或开裂、双叶脉等；株型变异表现为植株矮 化、节间短、茎粗大、分枝多样等：花型变异表现为花序直径和花朵直径大，花色深，花瓣 变异数目增多，花期延长。 ( 5 ) 叶绿素含量与辐射剂量之间呈负相关性；S O D 、P O D 活性随着辐射剂量增加先升 高后降低；C A T 活性在3 0 G y 剂量处升高到活性峰值后下降，7 0 G y 到l O O G y 略有小幅上升。 ( 6 ) 辐射对植株叶片气孔形态影响显著：5 0 G y 变异植株叶片气孔较对照植株叶片气孔 开度大，3 0 G y 下陷严重，气孔紧闭。 ( 7 ) 首次建立八宝景天I S S R - P C R 反应体系：总体积2 0 此，1 0 x B u f f e r ( M g + f r e e ) 2 0 - t L ， d N T P s2 m m o i L ，引物7 5 0 n m o l L ，D N A 模板2 5 n g ，T a qD N A p o l y m e r a s e1 U ，M g e l 2 2 m m o l L 。 P C R 扩增条件：9 4 预变性7 m i n ，3 5 个热循环，每个热循环包括：9 4 * ( 2 变性4 5 s ，5 2 退火 l m i n ，7 2 延伸1 5 m i n ，结束循环后7 2 延伸4 m i n 。 ( 8 ) 样品间的遗传相似系数( G s ) 在0 5 8 0 5 - 0 7 8 8 6 之间，平均相似系数为O 6 8 4 6 ； 利用I S S R 技术对辐射八宝景天植株的遗传相似性进行了鉴定和分析，筛选出观赏价值高的 变异植株M o 1 、M o 一2 、M o 3 、M o - 4 、M o 一5 。 关键词八宝景天：叫C o - ) , 射线；辐射诱变育种：I S S R 标记 ，l；一 ， a d v a n t a g e so fi t ss t r o n gr e s i s t a n c e ，l o wm a i n t e n a n c ec o s ta n dl u s hg r o w t h S s p e c t a b i l eB a r w a sc o m b i n e dw i t h6 0 C o - Tr a yt od e t e r m i n et h ei r r a d i a t i o nd o s eo fi n d u c t i n g p l a n t v a r i a t i o ni nt h ee x p e r i m e n to fi n d u c e dm u t a t i o nb r e e d i n g T h ei r r a d i a t i o ne f f e c t so n S s p e c t a b i l eB a r i n d u c e db y ”C o - ? r a yw e r ea n a l y z e d ，o fw h i c ht h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e s ， p h y s i o l o g i c a li n d i c a t o r s ( c h l o r o p h y l lc o n t e n t ，S O D ，P O D ，C A Ta c t i v i t y ) a n dl e a fs t o m a t a l m o r p h o l o g yw e r eo b s e r v e du t i l i z i n gb ym o r p h o l o g y , p h y s i o l o g y , c y t o l o g yp r i n c i p l e T h eg e n e t i c d i v e r s i t yo fm u t a n tw a sa n a l y z e db yI S S Rm o l e c u l a rm a r k e r sa n dc l u s t e ra n a l y s i sm e t h o d s T h e r e s e a r c hr e s u I t si n d i c a t e dt h a t ： ( 1 ) T h er e l a t i o n s h i pi sc l o s eo nt h ec h o i c eo fp l a n tj r r a d i a t i o np a r t sa n dt h er a d i a t i o ns e n s i t i v i t y T h er a d i a t i o ns e n s i t i v i t yo ft h eu p p e rs t e mi sb e t t e rt h a nt h el o w e ro n e T h eu p p e rs t e mi st h eb e s t i r r a d i a t i o ni n d u c e dp a r t ( 2 ) T h es e m i l e t h a l ( L D s 0 ) i sa p p r o x i m a t e l y10 0 G y T h em o s ta p p r o p r i a t ed o s eo fi n d u c e d S s p e c t a b i l eB a r m u t a n t si s5 0G y ( 3 ) T h e r ea r ef o u rm a i n l yp r o d u c t i o nw a y sa f t e rm u t a n t so rv a r i a n tb r a n c h e so fS s p e c t a b i l e B a r w e r ei r r a d i a t e d T oac e r t a i ne x t e n t , t h et o ps i n g l e = b r a n c hw i t hb r a n c h e sf o r m a t i o nh a p p e n e d ； Al o to fb r a n c h e sg r e wo nt h et r u n k , h o w e v e r , t h et o ps t o p p e dt og r o w ；S e v e r a lb r a n c h e se m e r g e d f r o mt h es a m ep l a c e ；An e wg e n e r a t i o no f m u t a n tM1g r e wa f t e rt h eg r o u n dp l a n td e a d ( 4 ) T h ec h a r a c t e r i s t i c sv a r i a t i o no fp l a n te a r l yp e r f o r m e di nt h ea s p e c to fl e a ft y p e ，p l a n tt y p e ， f l o w e rt y p e T h ev a r i a b i l i t yi nt h el e a fs h o w e db l a d ea s y m m e t r y , c o l o rw h i t eo ry e l l o ws t r i p e d ， t w i s t e d ，c o n c a v eo rc r a c kt i p ，t w ov e i n s ，e t c ；T h ev a r i a t i o no fp l a n tt y p es h o w e dp l a n t sd w a r f , i n t e r n o d e ss h o r t , d i a m e t e rl a r g e ，m u l t i p l eb r a n c h e se t c ；T h ev a r i a t i o no ff l o w e rt y p es h o w e d l a r g ed i a m e t e r ，d a r kc o l o r t h ei n c r e a s e dn u m b e ro fp e t a l sv a r i a b i l i t ya n de x t e n d e dt h ef l o w e r i n g p e r i o d ( 5 ) B e t w e e nc h l o r o p h y l la n dr a d i a t i o nd o s ee m e r g ean e g a t i v ec o r r e l a t i o n ；W i t ht h ei n c r e a s e o fr a d i a t i o nd o s e ，S O D ，P O Da c t i v i t yi n c r e a s e df i r s ta n dt h e nd e c r e a s e d ；C A Ta c t i v i t ya t3 0 G yd o s e i n c r e a s e dt oa c t i v i t yp e a ka n dt h e nd e c r e a s e d ，s l i g h t l yf r o m7 0 G yt o10 0 G y ( 6 ) I r r a d i a t i o ns i g n i f i c a n t l ya f f e c t e dt h el e a fs t o m a t a lm o r p h o l o g y ：t h el e a fs t o m a t a la p e r t u r e o f5 0 G yv a r i a t i o np l a n t sw e r el a r g e rt h a no t h e r s 3 0 G yp l a n ts a n ks e r i o u s l y , t h es t o m ak e p tc l o s e d ( 7 ) E s t a b l i s h i n gas a t i s f a c t o r yI S S R - P C Rr e a c t i o ns y s t e mf o rS s p e c t a b i l eB a r f i r s t l y ：2 0 1 x l r e a c t i o ns y s t e mc o n t a i n e d1 0 x P C RB u f f e r ( M g z + f r e e ) 2 0 1 x l ，2 m m o l Ld N T P s ，7 5 0 n m o l Lp r i m e r 2 5 n gt e m p l a t eD N A ，1 0 UT a qD N Ap o l y m e r a s e ，2 m m o l L8 8 2 + A m p l i f i c a t i o np r o g r a mi n c l u d e d p r e d e n a t u r a t i o na t9 4 f o r7 m i n ；d e n a t u r a t i o na t9 4 f o r4 5 s ，a n n e a l i n ga t5 2 f o r1m i n 。e x t e n d I I I i n ga t7 2 。C f o r1 5 m i n ，a f t e r3 5 c y c l e s ；t h ep r o d u c tw a se x t e n d e da t7 2 * Cf o r4 m i n ( 8 ) T h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n ta m o n gp l a n t sw e r e0 5 8 0 5 - - 0 7 8 8 6a n dt h ea v e r a g es i m i l a r i t v c o e f f i c i e n tw a s0 6 8 4 6 T h eg e n e t i cs i m i l a r i t yo ft h em u t a t i o n sw a si d e n t i f i e da n da n a l y z e db v u s i n gt h em e t h o do fI S S Rt e c h n o l o g y , a n dh i g ho r n a m e n t a lv a l u ep l a n tM o 1 ，M o 2 ，M 0 3 ，M o 4 a n dM 0 - 5w e r gs e l e c t e d K e y w o r d s S e d u ms p e c t a b i l eB a r e a u ；6 0 C o - 7 ；i n d u c e dm u t a t i o nb r e e d i n g ；I S S R C a n d i d a t e ：W a n gH u a n h u a n S p e c i a l i t y ：G a r d e np l a n t sa n dO r n a m e n t a lH o r t i c u l t u r e S u p e r v i s o r ：P r o f G u oC h u n j i n g I V r 引言 1 引言 八宝景天( S e d u ms p e c t a b i l eB a r e a u ) ，景天科景天属，多年生草本植物，别名：蝎子草。 株高3 0 7 0 c m ，茎直立不分枝，圆而粗壮，稍木质化，高2 5 7 0 c m ，叶对生或3 叶轮生，卵 形至长圆状卵形，长4 1 0 e m ，宽2 - 5 e m ，基部渐狭，先端钝或急尖，全缘或有波状锯齿。伞 房状聚伞花序项生，直径7 1 1 e m ，花密生，直径约1 c m ，花梗长2 - 4 m m ；萼片5 ，线状披针 形至宽披针形，长约1 m m 花瓣5 个，花淡紫红色至紫红色，披针形至宽披针形，长4 5 m m ， 宽约1 2 m m ；雄蕊l O ，长6 - 7 m m ，花药紫色，自交授粉：鳞片5 ，长圆状楔形，长1 1 2 m m ， 先端有微缺：心皮5 ，狭椭圆形，长约4 2 m m ，花柱长约1 2 m m ，瞢荚果直立且靠拢；花期 7 - 9 月，果期9 1 0 月；染色体数2 n = 5 0 ( ： L 京林业大学园林系花卉教研组，1 9 8 8 ；包满珠，2 0 0 3 ) 。 八宝景天原产中国东北地区以及河北、河南、安徽、山东等，日本也有分布，多以栽培 为主。八宝景天抗逆性强，耐高温、严寒等恶劣环境条件，在3 6 8 C 的严寒下能安全越冬， 不影响正常生长发育，极适合干旱少雨、土壤瘠薄的环境，绿期、花期较长；通常以扦插繁 殖为主，也可分株，少见播种，自春季抽生地上茎至开花前，均可露地扦插，扦插繁殖的植 株当年开花，分株以春初秋末为好，春季十分干旱的地区，应灌溉1 - 2 次( 矫国荣等，2 0 0 6 ： 张晓艳等2 0 0 7 ) 。八宝景天在早春天气转暖即可返青，花期在8 9 月，可以填补夏季花卉在 秋季凋萎没有观赏价值的空缺。其花密集而美丽，花开时一片粉烟，群体效果极佳。所以园 林中常将它用来布置花坛、岩石园、花镜或做成圆圈、方块、云卷、弧形、扇面等造型，营 造一种良好的视觉效果。目前在园林绿化工程中提倡乔、灌、草结合的复层绿化模式，八宝 景天作为地被植物，生长繁茂，铺地景观极佳，可有效弥补乔灌木生长缓慢，下层空隙大的 不足，有利于丰富园林景观。由于八宝景天植株低矮，抗逆性强，管理费用低，大量节约养 护用水，同时可以自我繁殖，所以无需繁杂的养护和修剪，可粗放管理，这样节省大量劳动 力，降低养护费用( 康红梅等2 0 0 8 ) 。 辐射诱变的目的是诱发突变产生新的遗传性状，从变异群体中有目的地把符合育种目标 的变异准确筛选出来供育种直接或间接应用。辐射诱变作为育种手段是常规育种难以取代的。 通过人工诱变可提高突变频率，促进遗传基因重组，有利于远缘杂交成功。随着分子学、细 胞学、遗传学的不断发展，D N A 技术开始在观赏植物研究中得到广泛的应用。D N A 分子标 记涉及的是既容易识别又可有效遗传的D N A 片段，不受组织类别、发育时期和环境条件的 影响而直接以D N A 的形式表现，所需实验材料量少、标记多态性高、表达呈中性( 不影响 目标性状的基因表达，与不良基因之间无必然的连锁关系) 。将辐射育种与分子标记结合应用， 利用分子标记对突变体进行遗传多样性分析，把表型与基因位点连在一起，可以有效区别真 伪突变体，使有些难以在表型中区分出来的基因在较短时间里鉴别出来，从而提高筛选效率 ( 王文恩，2 0 0 6 ；王磊，2 0 0 7 ) 。近些年，在观赏植物研究方面出现许多辐射诱变育种报告， 研究对象有菊花、月季、美人蕉、大丽花、矮牵牛、唐菖蒲、荷花、杜鹃等花卉( 杨晓红等 2 0 0 4 ) 。八宝景天作为辐射诱变研究的新材料，对我国观赏植物诱变育种的发展能起到补充作 用，通过0 0 C o q 射线辐照八宝景天能提高突变频率，促进遗传基因重组，同时利用I S S R 技 东北农业大学农学硕士学位论文 术可以从分子水平上检测辐射诱变后代基因组的变异程度，提高育种效率。 1 1 目的与意义 本研究目的在于探索6 0 C o 吖射线对八宝景天扦插植株的辐射效应及辐射育种的适宜辐照 诱变剂量；通过植株形态学观察、气孔形态观察、生理指标测定，初步筛选性状变异植株： 首次建立八宝景天I S S R P C R 反应优化体系，用分子标记手段分析和鉴定变异植株与对照之 间的差异性和基因变异情况，对样品进行聚类分析。这样可以丰富八宝景天种质资源，为间 接利用突变体来改良和选育新品种提供了条件，更为八宝景天遗传标记的应用及其辅助育种 提供理论依据与基础。 八宝景天是重要的园林绿化材料，抗逆性强，花开美丽，具有良好的观赏效果，栽植后 少见病虫害，可降低景观应用成本，是极具推广前景的优良地被植物。但因八宝景天的株形、 花色单一，花期短而在一些园林景观设计中被摒弃，利用辐射源辐照八宝景天植株以期得到 理想的景天品种，将是一种快速有效的研究方法。 八宝景天以扦插或分株繁殖为主，很难用有性杂交的方法培育新品种，长期无性繁殖会 造成种性退化，因此改良和创新八宝景天种质资源具有重要意义。辐照诱变育种是培育无性 繁殖作物新品种的重要手段之一，也是当前国际上突变育种的热门研究领域( 赵孔南，1 9 9 0 ) ， 6 0 C o - 3 辐照是选育无性繁殖植物新品种应用最为广泛的诱变手段，通过6 0 C o - ) 辐照提高变异 频率以获得新品种的研究在八宝景天上尚未见报道。本研究对无性繁殖的八宝景天扦插植株 进行6 0 C o - ) 辐照处理以研究射线对八宝景天的形态、生理( 叶绿素、活性酶) 、叶片组织( 气 孔) 和分子方面的辐照效应，并筛选适宜的辐照诱变剂量和观赏价值高的变异植株，以期为 八宝景天辐射诱变育种提供技术支撑。 1 2 关于辐射诱变育种1 1 2 1 辐射诱变育种特点 辐射诱变属于物理因素诱变，有电离辐射和非电离辐射两种。电离辐射指能量较高引起 物质电离的射线，有丫、p 、中子、X 射线等。非电离辐射的能量不能将原子电离，只能起到 激发作用，如激光、紫外线等。它与常规育种方法相比具有以下特点： 1 提高变异频率，扩大变异范围 自然条件下，由于外界环境与遗传结构的不稳定性，植物本身会发生一定的自发突变， 然而频率很低。而利用具有辐射能的射线诱发植物基因突变或染色体结构变异、倍性变异， 可使突变频率提高千倍以上，还能够诱导产生自然界稀有或没有过的或用常规方法难以获得 的新性状、新类型，这就为新品种的选育提供丰富的原始材料( 杨晓红等2 0 0 4 ) 。诱变还能 增加突变类型，扩大突变范围，诱发产生自然界少有或未曾有的或用常规方法难以获得的新 性状、新类型，丰富植物种质资源，为育种提供宝贵的原始材料。某些诱变因素可使叶绿素 类型增多，出现浅绿、暗黄、亮黄、白化、黄化、红化等类型，对于不考虑生殖特性而仅以 株型、叶形、叶色为主的观叶植物来说，是极为有效的育种手段。 2 能改变品种单一不良性状，保持其他优良性状不变 2 e1，jl带 引言 花卉品种中有些优良性状和不良性状通常是基因连锁的，有性杂交很难将它们分开，而 辐射诱变育种常常只作用于个别基因位点，就可能使品种在基本保持原有遗传背景的前提下， 改变其某个或某些不良性状，使连锁性状分开。在进行植物早熟、抗病、矮杆及品质育种时， 辐射育种可以取得满意效果，在短时间内获得性状优良的品种。 3 诱变引起的变异易稳定，育种年限短 辐射变异大多是一个主基因的改变，因此与传统育种方法比稳定较快，有利于在较短时 间内育成新品种。一般一二年生草花，F 3 代就可稳定，3 到6 年内可育出适合生产的新品种。 而有性杂交育种大多数需4 到6 代才能稳定，需7 1 2 年时间培育出新品种。 4 能克服远源杂交的不结实性 亲缘关系较远的种属间杂交易出现不结实现象，用射线处理花粉后杂交，某些情况下可 以提高结实率，克服杂种不育性。 5 增强抗逆性 利用辐射诱变可有效增强植物的抵抗能力，如：北京林业大学用钴射线处理“药红”小菊 脚芽幼叶愈伤组织，获得抗性强的新品种。 1 2 2 辐射源的种类 1 T 射线：也称丙种射线，辐射源是放射性同位素6 0 C o 和1 3 7 C s ，波长1 0 8 1 0 1 5 c m 。 在花卉辐射诱变育种工作中，6 0 C o - q 射线是最普遍的诱导源，6 0 C o 的缺点是半衰期短，仅5 2 7 年。1 ，射线波长短，比X 射线还要短，穿透力强，射程较远，主要用于外照射，同时可以处 理大量植物材料，且剂量比较均匀。目前常用的照射装置有钴圃、钴室、钻温室、钴人工气 候车照室等。 2 p 射线：又称乙种射线，辐射源为放射性同位素3 2 P 和”S 。由原子核衰变释放出来的 高能电子。p 射线在空气中射程短，穿透力较弱，通常用于内照射，不适宜外照射，如果利 用带p 射线的溶液浸种，让同位素进入植物组织和细胞中，直接渗入细胞核集中发挥作用， 可获得某些特点的突变谱。 3 x 射线：又叫阴极射线或伦琴射线，由x 光机产生的较短射线，不带电荷，属核外 产生的电磁辐射。波长O 1 l n m 为软X 射线，穿透力较小；波长O O l o 0 0 1 n m 为硬x 射线， 穿透力较大，是最早用于植物育种的射线，穿透力不如Y 射线。 4 中子：是不带电的电子流，自然界中并不存在自由中子，用在辐射育种的主要是原子 核受到外来粒子冲击，反应堆释放中子源和回旋加速器或静电加速器中子源。中子所带能量 大小不同，在1 0 日- 1 0 刁e V 之间，可分为热中子、慢中子、快中子、中能中子和超快中子。由 于中子的诱变能力比较强，在植物育种中应用也日益增多。 5 紫外线：一种穿透力小的非电离射线，波长短于可见紫色光，又紧接着紫色光的射线， 波长范围1 3 6 3 9 0 n m ，以2 5 0 2 9 0 n m 范围的紫外线诱变效果最强，这一波段为核酸吸收波长， 即遗传物质核酸吸收最多的区域。紫外线对植物组织的穿透力很弱，主要用于处理孢子或花 粉粒。 6 激光：是2 0 世纪6 0 年代重大科学技术成就之一，近些年才应用到植物育种领域，是 基于物质受激辐射原理而产生的一种高强度的单色相干光。它具有亮度高、方向性、单色性 东北农业大学农学硕士学位论文 和相干性都好的特点，主要是通过光、热、压力和电磁场效应等方面直接或间接地作用于生 物有机体，用激光可处理植物的种子、花粉、合子等。 7 高能离子束：离子经高能加速器加速后产生的放射线，具有高传能线密度、尖锐的电 离峰、低氧增比，能精确控制入射深度及部位，离予束与其它射线相比具有独特的优点，能 在电场、磁场作用下被加速或减速以获得不同大小的能量；可对其进行高精度的控制，从而 获得平行束，也能被聚焦成微细束。用高能电子束处理后的植物，M 1 代损伤轻，M 2 代诱变 效率高。 1 2 3 植物辐射诱变材料的选取 正确选择辐射材料是诱变育种成功的基础。早期的辐射诱变常因种子照射量大、操作简 便、便于运输贮藏等优点作为处理对象，近些年几乎所有的植物器官和繁殖体都能作为诱变 材料处理，如花粉、插条、多倍体、根芽、球茎、愈伤组织、休眠萌动种子、杂合种子、种 胚等。不同的器官和细胞对辐射的敏感性不同。按敏感性程度排序为：愈伤组织 试管苗 E l 间苗 根芽 插条 种子，主要由于射线引起诱变的间接作用机理，这些材料中愈伤组织含水 量高达8 0 以上，在辐射处理下，产生很多氧自由基破坏核酸和蛋白质等生物大分子；此外 愈伤组织的代谢系统尚不健全，对损伤的修复能力还很弱因此最为敏感；种子对射线的敏 感性最差，因其含水量通常低于2 0 ，辐照产生的间接损伤作用不大。种子处于休眠状态， 一些较大的生物分子被保护，不容易被射线破坏，因此种子与其它类型材料相比射线敏感性 最弱。另外，选择易产生不定芽的材料和利用茎上、根上产生的不定芽进行辐射，均易取得 较好效果( 杨晓红等2 0 0 4 ) 。 1 2 4 植物辐射诱变的机理 辐射诱变的主要原因有两方面：一是辐射后引起遗传物质的突变，如染色体的畸变、D N A 分子的变异。二是R N A 、蛋白质的生物合成受抑制，生长素及酶等生理活性物质的代谢受到 破坏，表现为细胞死亡、细胞突变( 杨再强等2 0 0 6 ) 。 辐射诱发突变作用通常认为有间接作用和直接作用两种。间接作用是指射线处理形成损 伤引起的反应，例如作用于水，引起水的裂解，进一步作用产生超氧自由基或过氧化氢，再 作用于生物大分子，导致突变。赢接作用是射线与被照射物质直接发生作用，是生物大分子 发生电离或激发所引起的原发反应。生物体在含水量较高的情况下对射线的敏感性很大，是 间接效应的证据。 P l a t z m a n 把生物体内的辐射作用分为四个阶段：首先是物理阶段，被处理物质吸收射线 的能量，使分子产生电荷与激发，此过程持续1 0 - 1 8 1 0 。1 5 秒；第二阶段是物理化学阶段，是 被处理物质的分子经过重新排列形成稳定的损伤分子，此过程持续1o - 1 2 。l s ；第三阶段是化 学阶段，是辐射产生的自由基与环境中其它物质进行反应，此过程持续1 0 1 0 2 m i n ；最后是 生物效应阶段，生物体通过代谢表现出各种效应，是一个相当复杂的阶段，持续过程从几秒 到若干年不定( 孙大容，1 9 9 8 ) 。 4 ，、Ij I 引言 1 2 5 植物辐射敏感性机理 1 2 5 1 靶学说 靶学说由B d a y 、A l t e n b e r g e r ( 1 9 2 3 ) 和G t o w t h e r ( 1 9 2 4 ) 首先提出，是解释物种间辐射敏感性 差异的重要学说。在之后的几十年内，此学说得到不断的发展和扩充。基本观点有：( 1 ) 在细 胞或生物结构中存在一种对射线敏感的部位，它的损伤将产生某种生物学效应，这种敏感结 构称为“靶”。靶被射线击中而产生损害，没被击中的不会引起损害；( 2 ) 电离辐射以离子簇的 形式撞击“靶区”，被击中是随机的，遵循P o i s s o n 分布；( 3 ) 不同生物的靶有不同的损伤击中 数，当“靶”受到一定次数的击中后，会产生某一放射生物学效应( 许耀奎等1 9 8 5 ：赵孔南等 1 9 9 0 ) 。从E P s t e i n ( 1 9 5 3 ) 证明D N A 分子是辐射的“靶分子”后，该学说己经被大多数人所接受。 S p a r r o w 等( 1 9 6 7 ) 以靶学说作为基础，提出引起植物辐射敏感性差异的内在原因是由于间期细 胞核体积和染色体体积不同所导致的。二者体积越大对辐射愈敏感。但这个理论难以解释同 一物种不同品种间的辐射敏感性差异，因为品种间细胞核和染色体体积几乎没有差异，但辐 射敏感性却差异很大。 1 2 5 2D N A 双键断裂学说 L e e n h o u t s ( 1 9 7 3 ) 租C k a d w i e k 在靶学说基础上，创建D N A 双键断裂学说，试着从分子生 物学角度说明电离辐射对细胞的作用。其基本内容是：( I ) D N A 分子完整性对细胞增殖最重 要：( 2 ) 辐射引起的最为严重的损伤是D N A 双键断裂，完整性受到破坏；( 3 ) 诱变的各种生物 效应均与D N A 双键结构断裂有关；( 4 ) 辐射效应的强度随细胞内D N A 双键断裂的平均数增加 而增加：( 5 ) 修复会影响最终的D N A 双键断裂数，而这种修复是由辐射期间或辐射后的代谢 条件决定的。I n o u e 等( 1 9 8 0 ) 以D N A 辐射损伤修复作为基础，指出不同品种间辐射敏感性差 异取决于遗传控制的损伤修复能力。他们用咖啡因作为损伤修复抑制剂，对具有不同辐射敏 感性大麦品种的幼苗进行了损伤修复研究，发现敏感性低的品种的损伤修复比率高于敏感性 高的品种；冯志杰等( 1 9 8 7 ) 对小麦的研究也得出了相同的结论。 1 2 6Y 射线辐射诱变中应注意的问题 植物辐射诱变是利用一定剂量的射线，照射植株、花粉、种子、根或其它器官，诱导产 生变异，达到有利突变目标的过程。辐射诱变效果受辐射剂量、处理方式、材料选取以及地 域外部环境等因素的影响。 1 2 6 1 辐射剂量 辐射剂量的选择是辐射诱变育种成功与否的关键之一，辐射剂量直接影响到材料诱变的 效果和突变频率，对于同一种材料，辐射剂量与辐射诱变率里正相关性，剂量越高则变异率 越高，如果辐照剂量过低，则不能引起基因结构、染色体结构和数目的变化：而辐射剂量过 高，会导致出苗率、成活率的降低及畸变率的提高，因此要选择适宜的辐射剂量。实际工作 中，最适辐射剂量通常是诱导材料死亡率为5 0 的辐射剂量，植物对辐射的敏感性常以半致 死剂量和临界剂量来表示。一般来说，由于诱变育种是个随机复合事件，成功率由植物材料 的成活率与突变率的乘积决定，对应最大概率积的剂量则是最适剂量。 5 东北农业大学农学硕十学位论文 1 2 6 2 辐射处理方法 正确选择处理方法是诱变育种成功的基础，辐射方法不同，在作物上所产生的诱变效果 和生物效应会不同。应该先确定育种目标，再对植物的基因型和器官进行仔细选择。 方法一：外照射。主要利用各种射线进行外照射，这种方法可大量处理材料，简便，可 靠。适合外照射处理的材料很多，如种子，根茎，插穗。种子的含水量有高低之分，与辐照 后的生理生化关系密切，种子含水量不同，辐射诱变效果也会有明显差异。但一般多用干种 子，因为干种子处理量大，操作方便，受环境影响小等优点；无性繁殖器官照射包括块茎、 块根、插穗、幼芽、鳞茎等，一般认为处于活跃状态的不定芽照射较为合适，可获得完全突 变的嫩梢；此外还有花粉照射、子房照射、愈伤组织照射等。近年来采用离休培养辐射育种 获得了纯合突变体，也缩短了育种年限。另外，选择易产生不定芽的材料和利用茎上、根上 产生的不定芽进行辐射，易取得较好效果。在外照射处理时还要注意，辐射材料的摆放位置 应尽量均匀，减少吸收剂量的误差。 方法二：内照射。是将放射性元素引入要处理的植物体内进行照射，常用的用于内照射 的放射性元素有3 5 S 、3 2 P 、H C 等。引入方式有浸种法、注射或涂抹法、施肥法。 1 3 观赏植物辐射诱变育种的研究进展 。 自1 9 2 7 年M u l l e r 发现x 射线能诱导果蝇产生变异后，4 0 年代初期德国L e i n 和F r e s j e b e n 将诱变剂作用于植物得到有益突变体，世界各国也相继开展了大量关于辐射诱变和植物育种 的研究工作。6 0 年代后期核技术的应用研究有了较大的发展，诱变育种方法也随之日益成熟。 7 0 年代，诱变育种的注意力转到培育抗病品种、优质品种和突变体上，8 0 年代后分子遗传学 和分子生物学的广泛应用于诱变育种工作中，尤其9 0 年代分子标记的应用，为实现品种的定 向诱变提供了准确的签定方法( 高健，卢惠萍，2 0 0 0 ) 。到2 0 世纪9 0 年代，辐射诱变育种才 真正应用在观赏植物育种上，巴西和荷兰等国家利用1 ，射线处理菊花材料培育出了新的菊花 品种。在辐射剂量与辐射材料两方面进行了探讨，N a g a t o m i S 等6 0 C o o 射线处理切花菊研究 表明辐射材料诱变效果从强到弱依次为：愈伤组织 植株 根芽 枝条，从照射方式来看快照 射比慢照射较易引起材料的损伤( 杨再强，王立新，2 0 0 6 ) 。 我国植物辐射诱变育种工作始于上世纪5 0 年代末，主要是在农作物上开展，应用到园林 观赏植物育种上是始于上世纪7 0 年代。虽比别的国家起步较晚，得也取得了显著成效，将辐 射育种与杂种优势育种技术、现代生物技术相结合，一套综合性的育种技术己渐进成熟，将 诱发突变发挥出巨大潜力，获得了大量突变新品种，在