枫香遗传转化体系的优化及转化PaFT基因的研究-硕士论文

分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 1 830327 枫香遗传转化体系的优化及转化砌刀墓囟院珊 O p t i m i z a t i o no fA g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d T r a n s f o r m a t i o nS y s t e m a n dG e n e t i cT r a n s f o r m a t i o nw i t hP a F T G e n e si nL i q u i d a m b a r f o r m o s a n a H a n c e 研究 生：刘冉冉 指导教师：包满珠 专业：园林植物与观赏园艺研究方向：园林植物遗传 获得学位名称：农学硕士 育种与生物技术 获得学位时间：2 0 1 0 年月 华中农业大学园艺林学学院 二O O 年四月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：鲫冉净 时间：如p年6 月f 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 籼睾雠删鲔 锄张一签名日期：九6 0 年6 月1 日签名日期：多加年占月ff 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 枫香遗传转化体系的优化及转化P a F T 基因的研究 目录 摘要I A b s t r a c t I I I 缩写名词表V 第一部分文献综述1 1 枫香属植物的研究进展。1 2 植物转基因研究进展3 2 1 植物转基因的研究概况3 2 2 植物转基因的主要方法4 2 2 1 植物转基因方法的概述。4 2 2 2 农杆菌介导的遗传转化机理4 2 2 3 影响根癌农杆菌介导植物基因遗传转化的因素。6 2 3 植物基因工程在木本植物遗传改良中的应用1 1 2 3 1 利用基因工程创造不育植株1 3 2 3 2 缩短育种周期和促进开花基因工程1 4 3 本研究的目的和意义1 6 第二部分枫香遗传转化体系的优化18 1 材料与方法1 8 1 1 试验材料18 1 1 1 转化受体材料18 1 1 2 供试农杆菌菌株和质粒。1 8 1 1 3 主要生化试剂18 1 2 转化试验所用培养基配方。19 1 3 遗传转化方法。19 1 3 1 农杆菌侵染液的制备2 1 1 3 2 预培养2 1 1 3 3 侵染和共培养2 1 1 3 4 看护培养与选择2 1 1 3 5G U S 染色瞬间表达2 1 1 4 转基因植株的培育2 2 1 4 1 抗性芽的诱导2 2 1 4 2 抗性芽的增殖筛选2 2 1 4 3 转基因植株的获得2 2 1 4 4G 己靥染色稳定表达2 2 1 5 转基因植株的分子生物学检测2 2 参 致 1 1 2 菌株和质粒3 8 枫香遗传转化体系的优化及转化砌盯基因的研究 摘要 枫香( L i q u i d a m b a r f o r m o s a n a H a n c e ) 作为我国著名的秋色叶树种，主要分布 于秦岭淮河以南地区，是我国重要的乡土树种。由于其生长迅速，适应性强，树形 美观，叶秋季红艳，具有很强的园林特性，故在我国很多城镇作为行道树和庭院观 赏树栽培。但是枫香结实多、个体大且果实硬，严重影响了其应用和推广。对于此 种情况，培育不育的无球果枫香成为一种行之有效的解决方法。 本研究通过对根癌农杆菌介导的枫香遗传转化体系的优化和改进，得到了转化 G U S 的转基因植株。在此基础上，对悬铃木P a F T 基因的转化进行了研究。主要研 究结果如下： 1 对农杆菌介导的枫香叶片转基因体系中菌液的制备进行了优化，比较了在A B 重 悬液中分别加入0 1 t M ，5 0 1 t M ，1 0 0 p M ，2 0 0 p MA S 后，枫香叶片的G U S 瞬间表 达和抗性芽的诱导率，得到在菌液中添加1 0 0 “M A S 叶片的G U S 瞬间表达可达到 1 0 0 。共培养后，将叶片放入只含3 0 0m e J r , C e f 培养基中培养3 0d 后再转入2 5m g L K a n + 3 0 0m g LC e f 选择培养基筛选，叶片抗性芽的诱导率和每个外植体平均出芽丛 数最高分别达到9 1 6 士3 0 和3 1 2 + 0 5 5 个。 2 比较了预培养时间的长短对枫香叶片遗传转化的影响，分别对枫香叶片进1d ，3 d ，5d 和7d 的预培养，观察统计其G U S 瞬间表达和抗性芽的诱导率，结果表明， 在预培养3d 和7d 时枫香叶片的G U S 瞬间表达率都可达到1 0 0 。共培养后，将叶 片放入只含3 0 0m g & C e f 培养基中培养3 0d 后再转入2 5m g LK a n + 3 0 0m g & C e f 选 择培养基筛选，抗性芽的诱导率分别为9 2 3 士2 7 和9 2 6 - 4 - 3 4 ，且每个外植体平均 出芽丛数也较高，分别达到3 2 3 - + 0 0 1 个和2 9 8 士0 5 6 个。 3 在枫香叶片抗性不定芽筛选策略上，从降低选择培养基中K a n 浓度和推迟筛选时 间两个因素上进行了研究，其中，K a n 浓度设置为0m g L ，1 0m g L 和2 0m g L ，推 迟时间为0d ，1 0d ，2 0d 和3 0d 。实验结果表明，将叶片放入只含3 0 0m g L C e f 培 养基培养3 0d 后再转入2 5m g LK a n + 3 0 0m g L C e f 选择分化培养基筛选，抗性芽的 诱导率和每个外植体平均出芽丛数分别为9 3 4 a ：7 4 和3 1 5 士0 6 7 个，但阳性率较低； 而将叶片先放入1 0m g LK a n + 3 0 0m g LC e f 选择分化培养基上培养1 0d 的阳性率最 高达到8 8 9 。 4 在对枫香叶片遗传转化体系进行优化的基础上培育转基因植株，进行G U S 组织 性，2 株转化苗表 P a F T 基因的抗性 枫香遗传转化体系的优化及转化P a F T 基因的研究 A b s 仃a c t F o r m o s a ns w e e t g u m ，m a i n l yd i s t r i b u t e di nt h ea r e aS o u t ho fQ i n l i n gM o u n t a i na n d H u a i h eR i v e r , i so n eo f t h ei m p o r t a n tn a t i v et r e es p e c i e si nC h i n a D u et oi t sm a n yd e s i r a b l e t r a i t s ，s u c ha sf a s tg r o w t h ，诚d ea d a p t a b i l i t y , h i g hr e s i s t a n c ea n dr e dl e a v e si na u t u m n , f o r m o s a ns w e e t g u mi sb e c o m i n gp o p u l a ri nu r b a ng r e e n l a n da ss t r e e tt r e ei nm a n yt o w n s a n da so r n a m e n t a lt r e e si nc o u r t y a r d H o w e v e r , t h es p i n yf r u i t so f t h et r e ed i s i n t e g r a t ev e r y s l o w l ya n dc a u s ean u i s a n c eo nl a w n sa n dw a l k sa n ds t e r i l i t yo rf r u i t l e s sb r e e d i n gw o u l d g r e a t l yi m p r o v et h eu s e f u l n e s so ff o r m o s a ns w e e t g u m B yo p t i m i z i n go fA g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o ns y s t e ma n dg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n , t r a n s g e n i cp l a n t l e t sw e r ef i n a l l yo b t a i n e ds u c c e s s f u l l yw i t ht h e s t a b l e i n t e g r a t i o no fG U Sg e n ei nt h eg e n o m eo f L i q u i d a m b a rf o r m o s a n aH a n c e B a s e do nt h e i m p r o v e ds y s t e m s ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nw i t hP a F Tg e n e sw a s c a r r i e do u t ，a n dt h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 T h em e t h o do fc u l t u r i n gb a c t e r i aW a si m p r o v e di nt h eA g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo ff o r m o s a ns w e e t g u m W ea d d e d0 “M ，5 0 肛M ，I0 0 0 M ， 2 0 0 肛MA Si nt h eA Bs u s p e n s i o n s ，a f t e rc o m p a r i s o no f t h eG U St r a n s i e n te x p r e s s i o n a n dt h ei n d u c t i o nr a t eo fr e s i s t a n c eb u d s ，w ed i s c o v e r e dt h a tt h eG U St r a n s i e n t e x p r e s s i o nW a s10 0 i nt h eA Bs u s p e n s i o n sa d d e d10 0 “MA S A f t e rC O c u l t u r e ， s w e e t g u mW a sc u l t u r e d3 0d a y so nt h em e d i u mo f3 0 0 m g LC e fa n dt h e ns e l e c t e do n t h es e l e c t i o nm e d i u mo f2 5m g LK a n + 3 0 0m g LC e f T h ei n d u c t i o nr a t eo fr e s i s t a n c e b u d sW a Su pt o91 6 士3 0 a n dt h ea v e r a g en u m b e ro fs p r o u t i n gp l e x u so fe a c h e x p l a n t sw a su p t o3 1 2 - 士0 5 5 2 T h ee f f e c to ft h et i m eo fp r e - c u t u r eO i lt h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo ff o r m o s a n s w e e t g u mw a sc o m p a r e d T h es w e e t g u mw a sp r e c u t u r e dr e s p e c t i v e l y1d ，3d ，5d a n d7d T h eG U St r a n s i e n te x p r e s s i o na n dt h ei n d u c t i o nr a t eo fr e s i s t a n c eb u d sw e r e o b s e r v e d A sar e s u l t ，t h eG U St r a n s i e n te x p r e s s i o nW a sa l l10 0 a f t e rp r e - c u t u r e d3 d a n d7 d A f t e rC O - c u l t u r e ，s w e e t g u mw a sc u l t u r e d3 0d a y so nt h em e d i u mo f3 0 0 m g L C e f ，a n dt h e ns e l e c t e do nt h es e l e c t i o nm e d i u mo f2 5m e d LK a n + 3 0 0m g LC e f T h e i n d u c t i o nr a t eo fr e s i s t a n c eb u d sW a s9 2 3 ：J ：2 7 a n d9 2 6 a ：3 4 A n dt h ea v e r a g e m a n d2 9 8 - 0 5 6 p r o l o n g i n gt h e 1 0 m g La n d 2 0 m g L a n dt h et i m eo f s e l e c t i o nw a s0d ，1 0d ，2 0da n d3 0dw a st e s t e d A sa r e s u l t ， s w e e t g u mW a sc u l t u r e d3 0d a y so nt h em e d i u mo f3 0 0 m g LC e f a n dt h e ns e l e c t e do n t h es e l e c t i o nm e d i u mo f 2 5m g LK a n + 3 0 0m g LC e f , t h ei n d u c t i o nr a t eo fr e s i s t a n c e b u d sW a s9 3 4 + 7 4 ，a n dt h ea v e r a g en u m b e ro fs p r o u t i n gp l e x u se a c he x p l a n t sW a s 3 15 + 0 6 7 ，b u tt h ep o s i t i v er a t eW a sv e r yl o w W h e nt h es w e e t g u me x p l a n t sw e r e c u l t u r e do nt h es e l e c t i o nm e d i u mw i t h10m g LK a r l + 3 0 0m g LC e ff o r10d a y s ，t h e p o s i t i v er a t eW a su pt o8 8 9 4 B a s e do nt h e o p t i m i z e dA g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f f o r m o s a ns w e e t g u m ，t h et r a n s g e n i cp l a n t sw e r eo b t a i n e d 19k a n a m y c i nr e s i s t a n t p l a n t sw e r ep o s i t i v ei nt h eP C Rd e t e c t i o n ，a n d2t r a n s g e n i cp l a n t se x p r e s s e do fG U S a c t i v i t y I ti n d i c a t e dt h a te x o g e n o u sG U Sg e n eW a si n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m eo f f o r m o s a nt r a n s g e n i cp l a n t 5 P n ng e n eW a su s e df o rt r a n s f o r m i n gf o r m o s a ns w e e t g u m ，P C Rd e t e c t i o nr e s u l t s s h o wt h a t1r e s i s t a n tp l a n tW a sp o s i t i v e K e yw o r d ：F o r m o s a ns w e e t g u m ( L i q u i d a m b a rf o r m o s a n a ) ；L e a fe x p l a n t s ；G e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n ；G U Sg e n e ；P a F Tg e n e I V 枫香遗传转化体系的优化及转化P a F T 基因的研究 缩写名词表 2 ，4 - D A S B A C e f C T A B D E P C E D T A G A 3 m A K a n L B m R N A M S N A A m P C R T D Z 2 ，4 - D i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d 2 ，4 - 二氯苯氧乙酸 b e n z y l a d e n i n e C e f o t a x i m e 乙酰丁香酮 苄基腺嘌呤 头孢霉素 C e t y lT r i m e t h y lA m m o n i u mB r o m i d e 十六烷基- 三甲基溴化铵 D i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 E t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g i b b e r e l l i ca c i d 赤霉酸 I n d o l e 3 b u t y r i ca c i d 吲哚- 3 乙酸 K a n a m y c i n L u d a - B e r t a n i ( m e d i u m ) M e s s a g eR N A M u r a s h i g ea n dS k o o g ( m e d i u m ) a - n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d 卡那霉素 L B ( 培养基) 信使R N A M S ( 培养基) 甜萘乙酸 新霉素磷酸转移酶I I P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 T h i d i a z u r o n 苯基噻二唑基脲 枫香遗传转化体系的优化及转化P a F T 基因的研究 第一部分文献综述 1 枫香属植物的研究进展 枫香( L i q u i d a m b a rf o r m o s a n aH a n c e ) 为金缕梅科( H a m a m e l i d a c e a e ) 枫香属 ( L i q u i d a m b a rL 1 的一种高大落叶乔木，是我国重要的乡土树种，也是亚热带地区优良 速生的落叶阔叶树种( 翁琳琳等，2 0 0 7 ) 。枫香属约有6 个主要的种，均为高大的落 叶乔木，产于美洲以及亚洲。其中枫香主要分布于我国秦岭、淮河以南地区，东自 东海边，西至四川、云南、贵州和西藏；北起山东、河南，南抵广东、海南。日本、 越南北部、老挝和朝鲜南部亦有分布。一般在海拔1 0 0 0 - - - 1 5 0 0m 以下的丘陵及平原 生长。美国枫香化s t y r a c l f l u a ) 广泛分布于北美洲南部、东南部以及墨西哥、中美洲 至洪都要拉斯南部的高海拔山区。枫香属树种木材轻软纹理通直细致，易于加工是 建筑、家具等理想的材料；同时，其适应性强，耐干旱瘠薄，生长迅速，抗风抵寒，耐 火烧，对二氧化硫尤其氯化物有较强的抗性( 刘增荣等，1 9 9 0 ) ，在湿润肥沃的土地 生长尤为茂盛且天然更新容易，故有“荒山先锋”树种之称。再次，枫香属植物作为 著名的秋色叶树种，树干圆满通直、枝叶繁茂、气势雄伟、深秋叶色鲜红美艳，是良 好的园林观赏树种。美国枫香早已在北美地区广泛用于行道树及园林绿化用树，得 到了良好的效果。近年来，随着我国城市建设和城市化进程的加剧，枫香由于以上 的优良特性在城市园林绿化中日益受到重视，需求量也日益增大。 在国际上，自2 0 世纪6 0 年代以来，已经对枫香属植物进行了广泛深入的研究， 主要表现在对美国枫香进行了比较全面系统的研究，研究主要包括育种，栽培，组 织培养以及遗传转化等几个方面。在育种方面，V e n d r a m ee ta l ( 2 0 0 1 ) 对枫香与美国 枫香未成熟的种子在人工控制条件下授粉杂交，对得到的1 0 2 0 粒种子进行胚培养， 其中有2 获得成功并培养成幼苗，从而成功进行枫香属种间杂交。在组织培养方面， 1 9 8 0 年，H E S o m m t r 和C L B r o w n 将美国枫香野生种子培育成苗，用液体悬浮培养液 培养苗的下胚轴分离块，从而获得胚状体。K i me ta l ( 1 9 9 7 ) 以美国枫香的下胚轴 作为外植体对不定芽进行诱导，使用了2 ，4 D 和T D Z 进行组合，试验在阐明了T D Z 对不定芽诱导效果的同时对其试管苗的生根效果也进行了对比。M e r k l ee ta l 在后来 分别运用美国枫香的未成熟花序和种子进行研究并成功诱导出体胚( M e r k l ee ta l ， 1 9 9 8 ；M e r k l ee ta l ，2 0 0 0 ) 。1 9 9 8 年，B r a n d 和L i n e b e r g e r 分别对美国枫香的叶柄和 叶片为外植体进行诱导分化出了大量的不定芽，并对不定芽分化的部位进行了比较 说明。在遗传转化方面，1 9 9 3 年，S u l l i v a n 和L a g r i m i n i 采用农杆菌介导对美国枫香叶 规律的研究，并对不同家系枫香种子的各种成分进行了分析( 刘亮东和陈凤毛， 2 0 0 2 ) ，方乐金等( 2 0 0 3 ) 对枫香子代性状的遗传变异方面进行了分析研究。 为了了解枫香的遗传变异特性方面的规律，以便于充分发挥枫香的野生树种和 栽培资源的作用，中国林业科学研究院进行了枫香苗期地理变异及遗传多态性两方 面的研究。他们首次进行了枫香种源试验研究，研究主要选取了8 个省市的2 0 个枫香 种源作为研究材料，研究了枫香在苗期生长量和适应性、种子性状及叶色变异等4 个方面的地理变异，同时应用R A P D 分子标记法从D N A 的水平上进行了枫香群体的 遗传多样性方面的研究。人们结合美国枫香的引种工作还研究了枫香与美国枫香在 种植各方面的对比，所有的被研究性状在种源之间存在着显著差异，使用R A P D 分 子标记研究表明枫香与美国枫香群体之间存在着丰富的遗传多样性，有极大的遗传 分化，且群体内的变异大于群体间的变异，表明枫香与美国枫香之间存在较大的进 化动力，这也可能是造成其在森林生态系统树种中占重要地位的原因，同时还从 D N A 水平上揭示了枫香与美国枫香之间存在着较近的亲缘关系( 孟现东，2 0 0 3 ) 。 成铁龙，施季森( 2 0 0 3 ) 在枫香多目标育种基础上继续开展了枫香优良种质资 源在扦插和微繁等方面的无性繁殖研究工作。2 0 0 1 年，王洪云等对枫香下胚轴的离 体培养和枫香的植株再生也进行了全面研究。孟现东和陈益泰( 2 0 0 4 ) 确定了枫香 2 枫香遗传转化体系的优化及转化 a F T 基因的研究 合适的基因组D N A 的提取方法，优化并构建了枫香P C R 检测的扩增程序。乔桂荣等 ( 2 0 0 7 ) 利用根癌农杆菌介导的以枫香幼叶为外植体转化材料进行干涉R N A 基因遗 传转化，经过生根筛选得N 5 株抗性植株，其中4 株抗性植株经过分子检测为转基因 阳性植株。 2 植物转基因研究进展 2 1 植物转基因的研究概况 从上个世纪六、七十年代，人们就开始了对植物转基因研究的尝试。1 9 8 3 年， 自从第一株转基因植株的研究问世( Z a m b r y s k i ，1 9 8 3 ) ，也就标志着植物转基因工程 时代的到来。二十多年以来，生物技术发展十分迅猛，植物转基因研究和应用得到 一系列突破性成就。 1 9 8 4 年，P a s z k o w a k i 把M 叮膊嵌合基因载体克隆N E C o l i 的质粒上，并利用 P E G 成功获得了转基因烟草。以往都是利用原生质体为受体材料进行转基因研究， 而H o r s c he ta l 在1 9 8 5 年开创了利用根癌农杆菌介导的“叶盘法 遗传转化体系，很 大程度上地简化了前人的转化体系，具有十分重要的里程碑意义。此后，P o w e l l A b e l l e ta l ( 1 9 8 6 ) 将T M VC P 基因转入烟草并得到了转基因烟草植株。J e f f e r s o ne ta l ( 1 9 8 7 ) 经过研究得到G 璐因可以作为遗传转化的报告基因，这样检测转化的愈伤组织和 植株都变得方便快捷，很大程度上提高了遗传转化的效率。 在1 9 8 7 年，美国康耐尔大学的S a n f o r de ta l 发明了基因枪技术。随后，K l e i n ( 1 9 8 8 ) 首次将基因枪技术应用于植物基因工程的研究，从而克服了当时受到受体的种类和 基因型限制的利用农杆菌介导方面的转基因方法，从此植物转基因方法有了更广阔 的新领域。H i e ie ta l ( 1 9 9 4 ) 在转基因过程中加入了农杆菌侵染的诱导剂乙酞丁香 酮( A S ) 的使用，并利用构建得到的V i r B 和V i r G 超双元载体的高效表达，从而对水 稻地进行了高效成功的转化。I s h i d ae ta 1 ( 1 9 9 6 ) 、C h e n ge ta 1 ( 1 9 9 7 ) 和T i n g a ye ta 1 ( 1 9 9 7 ) 利用这种转基因体系相继获得了转基因的小麦、大麦和玉米植株。 随着植物生物技术的高速发展，转基因植物在农业、园艺和林业生产上的应用 和研究得到了快速的发展。在1 9 9 7 年统计得出，全世界范围上通过转基因技术获得 的植株至少涉及N 3 5 个科的2 0 0 多个种，其中主要包括了绝大多数的经济和粮食作 物、观赏和药用植物、蔬菜、果树、林木以及牧草( B i r c he ta 1 ，1 9 9 7 ) 。截止至1 J 2 0 0 2 年统计得出，全世界在1 6 个国家中种植的转基因作物的面积已达至1 J 5 8 7 0 万公顷，其 中发展中国家转基因作物的种植面积占全球的2 7 达至U 1 6 0 0 万公顷，而仅美国、加 3 以及电泳法等。 在这所有的方法中，使用最多的是农杆菌介导法，而其中又以根癌农杆菌的应 用最为广泛。目前，利用根癌农杆菌转化体系产生的转基因植株，在已经得到的近 2 0 0 种的转基因植物中占到了8 0 以上( 王关林和方宏筠，2 0 0 2 ) 。 2 2 2 农杆菌介导的遗传转化机理 农杆菌可以分为根癌农杆菌( A g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 和发根农杆菌( 彳 r h i z o g e n e s ) 。根癌农杆菌是种革兰氏阴性土壤杆菌，其介导的遗传转化，是受伤 的植物细胞被作为中间载体的根癌农杆菌侵染后，将农杆菌携带着的质粒D N A 片段 4 枫香遗传转化体系的优化及转化P a F T 基因的研究 也就是转移D N A ( T - D N A ) ，插入到植物细胞核基因组之中，从而实现植物基因的 遗传转化。很多试验研究的结果都证明，在植物转基因中利用农杆菌介导的方法， 既能实现单子叶植物的遗传转化，也能实现双子叶植物的遗传转化( 王关林和方宏 筠，2 0 0 2 ) 。 根癌农杆菌在介导植物的遗传转化时，其作用的关键是在其体内存在的肿瘤诱 导质粒即n 质粒( T u m o ri n d u c i n gp l a s m i d ) 。T i 质粒是一种存在于根癌农杆菌核外 的环状双链D N A 分子，长约2 0 0 3 0 0k b ，包括T - D N A 、毒性区( V i r 区) 和冠瘿碱 代谢基因编码区，其中T - D N A 区约长2 3k b 两端是两个2 5b p 的重复序列，分别是 左边界( 1 e f tb o r d e r ，L B ) 和右边界( r i g h tb o r d e r ，R B ) ，这两个边界的序列之间包 括了细胞分裂素和生长素的合成基因及冠瘿碱的合成基因。T - D N A 区内控制基因表 达的序列与真核生物很相似，因而可以在植物中直接表达而不在农杆菌中表达。利 用农杆菌转化植物实质是T - D N A 在一系列V i r 区基因的辅助下，从而插入植物细胞 的核染色体中，实现由农杆菌向植物的转移及整合的全过程，该过程主要包括了以 下几个步骤( 徐春辉等，2 0 0 2 ) ：第一，细菌在植物细胞表面特定部位进行识别并在 其上附着结合；第二，V i r 区基因控制着位于T i 质粒上T - D N A 区基因转移，它经过 敏感宿主的诱导作用后而被激活；第三，在V i r 区基因被激活后，T - D N A 就从从n 质粒上被切割下来并且形成T - D N A 复合体；第四，T - D N A 复合物受到农杆菌的介 导转移到植物细胞中；第五，T - D N A 被整合到植物染色体组上并且进行表达。 随后，在T - D N A 中的细胞分裂素和生长素合成酶类的基因进行表达，使得植物 细胞大量地增殖，最后形成了肿瘤。由于被转化细胞的增殖，T - D N A 也随之大量扩 增，导致冠瘿碱合成酶类基因的拷贝数也被增加，这样就能合成到越来越多的冠瘿 碱。冠瘿碱在农杆菌中为之提供主要的氮源和碳源，是其它土壤中含有的微生物所 不能代谢的，所以在自然界中农杆菌为自己争取得到了独立生存的空间。 由于天然的T i 质粒中包含了与冠瘿碱代谢有关的基因，所以在T - D N A 区内含有 的细胞分裂素和生长素基因在实际运用中很多都是多余不利的，实际遗传转化操作 中对其进行改造是十分必须的。卸甲T i 质粒是将T i 质粒的T - D N A 区中去除导致肿瘤 生成的基因后，将其T - D N A 区植入到转化植物中( Z a m b r y s k ie ta l ，1 9 8 3 ) 。人们运 用卸甲T i 质粒使受体材料转化的部位不再产成肿瘤，从而更好地获得转化的植株。 研究得到，在V i r 基因蛋白的辅助作用下，所有被插入边界序列之间的D N A 都可 以被转移并且整合到被转化植物的基因组q b ( G e l v i n ，2 0 0 0 ) 。人们根据T - D N A 区和V i r 区分别位于两个质粒上反式作用的这一原理，构建了双元载体系统( 即由两个质粒 的各种条件是植物转基因体系所必需的两个条件。作为一个成功高效的植物遗传转 化体系应满足如下的条件：( 1 ) 可以再生成植株的细胞需要达到一定的量；( 2 ) 具 有高效地选择和转化植株再生体系；( 3 ) 具有优良方法将这些外源D N A 导入细胞。 一个植物转化体系的效率与受体植株的再生率以及外源基因转移和整合的效率成正 比( B i r c h , 1 9 9 7 ) 。而根癌农杆菌的利用可以为建立成功的植物遗传转化体系提供了 行之有效的途径。 2 2 3 影响根癌农杆菌介导植物基因遗传转化的因素 农杆菌介导的遗传转化是一种使外源基因转移到目的植株中的天然系统，其是 通过对植物表达载体上D N A 进行加工与转移并将其整合到受体植物细胞中的一种 转基因的方法。在利用农杆菌介导的木本植物的基因转化中，有两个关键步骤：转 6 枫香遗传转化体系的优化及转化P a F T 基因的研究 化材料的高效再生和农杆菌对转化材料的侵染。其他各种因素对转化效率的影响都 可以归结到这两个过程上，其包括农杆菌菌株、外植体的种类和生理状态、研，基因 的活化、再生植株的细胞起源以及整个操作过程中的环境和物化条件等。主要的有 以下几个方面： 2 2 3 1 农杆菌菌株 研究表明，在已经分离得到的很多农杆菌菌株中，只有少数的几种菌株可以被改 造然后用于植物的遗传转化。目前有三种菌株最为常用，分别是遗传背景为A 1 3 6 的 S u c 型的菌株E H A l 0 1 ，遗传背景为A c h s 的O c t 菌株L B A 4 4 0 4 以及E H A l 0 1 为背景衍生 出的菌株E H A l 0 5 和A G L I ( 周再刚等，2 0 0 7 ) 。C h a ne ta l 在水稻转化的研究中结果 表明，章鱼碱型农杆菌对其有着不同的转化效率( C h a ne ta l ，1 9 9 3 ) 。H i e ie ta l 比较 了2 个菌株( E H A l 0 1 和L B A 4 4 0 4 ) 和3 个双元载体质粒( P i g l 2 1 H m ，p T O K 2 3 3 和 p B I N l 9 ) 在水稻中的转化效率，结果发现L B A 4 4 0 4 ( p T O K 2 3 3 ) 的转化效率比 E H A l 0 1 ( P i g l 2 1 H m ) 和L B A 4 4 0 4 ( P i 9 1 2 1 H m ) 的转化效率均高( H i e ie ta l ，1 9 9 7 ) 。在 比较用不同菌株中所含的同一质粒对于同一种水稻受体组织的转化能力时，发现超 毒力菌株E H A l 0 5 对水稻受体组织的敏感度高于普通型宿主菌株L B A 4 4 0 4 ，因此，证 实了不同的农杆菌菌株对植物品种的浸染能力也有所不同( L i ue ta l ，1 9 9 9 ) 。在双 子叶植物遗传转化中的结果与这些相类似，可能是因为农杆菌与植物相互之间存在 着适应性。除此以外，农杆菌菌液浓度的高低和菌液中细菌的生长状态对遗传转化 效率也有一定的影响。 2 2 3 2 外植体的种类和生理状态 在前人的遗传转化研究中，原生质体、愈伤组织、子叶、实生苗上胚轴、胚状 体、成年态的茎段以及种子等不同类型的外植体都曾经作为遗传转化的外植体被加 以运用。在植物转基因的实际操作过程中，由于不同组织以及处于不同生理生化状 态同一组织对于农杆菌的敏感程度都是不一样的，因而，正确地选择外植体是植物 转基因成功的一个首要条件。1 9 9 7 年，V i l l e m o me ta l 研究指出遗传转化只发生在细 胞分裂期的一个较短时间内，即只有当细胞处在细胞分裂S 期( D N A 合成期) 的时 候才具有整合外源基因的能力。一般来说，选择合适的转化外植体材料并使之处于 最佳的生理生化状态是需要进行仔细摸索的，大量的试验结果证实，农杆菌对幼嫩 组织、生长旺盛的组织以及发育早期( 幼年期) 的组织细胞侵染较为敏感。( S c h l a p p i a n dH o l n ，1 9 9 2 ：V i l l e m o n te ta l ，1 9 9 7 ) 。 7 使用诱导剂A S 对农杆菌进行前处理可以在一定程度上提高农杆菌的转化效率 ( A l d e m i t ae ta l ，1 9 9 6 ) 。H i e ie ta l ( 1 9 9 7 ) 证明浓度为1 0 0 “M 的A S 对水稻的转化最 为适合，试验发现在侵染之前用高糖和低p H ( p H 值为5 2 - 5 4 ) 的A A M 培养基活化 农杆菌3 5h ，并且在活化培养基和共培养培养基中都加入信号物质A S ，可以明显地 提高水稻的转化频率。 2 2 3 4 乙酰丁香酮的作用机理及应用 农杆菌介导的遗传转化具有转化机理清楚、拷贝数低、整合位点稳定、转化的 外源D N A 结构完整且整合后结构变异小等优点，其作为一种天然的转基因系统是植 物转化策略中的首选方法，所以建立稳定高效的植物遗传转化体系已经成为一个十 8 枫香遗传转化体系的优化及转化P a F T 基因的研究 分重要的研究领域。据研究，宿主植物细胞可以分泌出激活农杆菌内T i 或黜质粒D N A 上V i r 区基因的某些酚类化合物，诱发其高效表达，从而使农杆菌T - D N A 向宿主细胞 核转移，促进遗传转化效率的提高。试验中最常用并且效果最佳的转化诱导剂是乙酰 丁香酮( A S ) ，是由S t a c h e lSE e t a l ( 1 9 8 5 ) 从烟草代谢活跃的根和叶愈伤组织的提取 物中分离得到的。近几年，A S 被广泛应用于植物转基因中并取得了较好的效果，从而 更加完善农杆菌介导的植物遗传转化的方法。 研究表明，农杆菌对酚类化合物存在依赖于v i r A 和v i r G 基因的趋化性 ( S h a w 1 9 8 4 ) 。S t a c h e lSE e ta l ( 1 9 8 5 ) 研究发现烟草叶子的受伤部分比未受伤的诱 导作用更明显，于是将A S 从受伤的植物细胞中分离提取出来，可以用来作为趋化物 识别。随着继续深入的研究，A S 的作用机理日益清晰，这样就为A S 在遗传转化率提高 的作用上奠定了基础。A S 作为酚类化合物中最好的诱导剂，其主要的作用机理是使 农杆菌H r 区基因活化与表达，从而促使T - D N A 在受体细胞中的加工与转移，使农杆 菌的T - D N A 更容易进入到被转化植物的基因组中并与之整合。A S 具有很强的诱导效 果主要是由于酚类化合物的诱导效果大多与其分子结构有很大的关系 ( H o o k y a a s p ，1 9 9 2 ) 。 一般来说，A S 使用的有效浓度在5 0 - - 一2 0 0p m o l L 2 _ 间，浓度若是太高则会影响 植物的转化效率，可能会对外植体产生毒害作用。M o h r ie ta l ( 1 9 9 7 ) 在日本白桦的 转化中加入A S1 0 0g m o l L 可使其转化效率提高8 倍。席梦利( 2 0 0 4 ) 在杉木遗传转 化的研究中得出，在共培养培养基中添加8 0g m o l L A S 时，K a n 抗性芽的诱导率会明 显的高于