小麦新品种豫农202杂株类型的鉴定与指纹图谱构建-硕士论文

分类号 河南农业大学硕士学位论文 论文题目： 密级 英文是基目： 亘坠亟呈望! i 壁壁垒丛Q 坠! 塾呈白 卫星墨Q 坠望Q ! 堡垒! ! 垒卫! 曼 墨卫堕堇! = i 坠g 皇! = 乜! = i 丛! 垒Q 望曼! 坚垒Q 塾Q ! 毯竺塑 盥h 亟! 坠! 丛塑! = ) 匦丛Q 坠9 2 Q 2 导 专 论文提交 日 学位授予 日 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 小麦新品种豫农2 0 2 杂株类型的鉴定学位 文题目 与指纹图谱构建 级别 硕士 学生学科导师 姓名 朱有朋作物遗传育种詹克慧教授 专业姓名 学位论文 是否保密 趸 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究篡吼铱荫月恳 翩签名锄珏 日期：加咩占月形日 日期：二年月，日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 注：保密学位论文在解密后适用于夺授权书。恳 碱蜷氧采翎翩签移拂糯领i 签矧 日期：勿净6 月肜日日期渤形律月，彳日日期：如碎月汐百 敛调寸 本文是在恩师詹克慧教授的悉心指导和关怀下完成的。从论文的选题、试验 方案的制定、研究工作的开展，到论文的撰写、修改与审定，无不凝聚着恩师的 心血与汗水! 值此论文完成之际，首先感谢我的恩师詹克慧教授。三年来，恩师对我的培 养付出了大量的心血，恩师严谨的治学态度、一丝不苟的工作作风、敏锐的洞察 力、开拓创新的学者风范、渊博的知识以及对科学事业的孜孜追求深深地影响着 我，使我受益终身。詹老师在学习和生活等各个方面都给予了我无微不至的关怀 与帮助，而且引导我不断改正缺点，使我在为人、处事、求学等方面逐步提高。 在此，谨向尊敬的恩师致以最诚挚的敬意和感谢! 忠心感谢在试验和论文的完成过程中给予我关心和帮助的崔党群教授、许海 霞副教授、陈军营副教授、程西永老师和董中东老师! 特别感谢农学院李玉玲教 授和生命科学院副院长吴建宇教授在论文开题时给予的建议和意见! 特别感谢许海霞副教授及河南省农科院的胡琳研究员在百忙之中对论文进 行了认真的评阅。 感谢在试验进行过程中给予我帮助的师兄马东钦、师姐王晓伟、许兰杰、师 弟孙文鑫、周扬、张福彦、刘华、李志勇、师妹马彩艳、同学马金亮、马兴立、 马超、李正、郭春艳、徐园园、徐艳花等，2 0 0 5 级本科生郑杭杭、杨钊钊、郭 慧娟、郭晓，2 0 0 6 级本科生张源源、耿彦超、林利美、孙鑫蕊，是他们的辛勤 汗水使我的试验得以顺利完成。 另外，我还要感谢研究生处和农学院各位领导和老师对我的教育和培养。也 真诚感谢多年来关心和帮助过我的所有老师、同学和朋友们。 谨以此文献给我的家人，是他们在我多年的求学过程中，从经济和精神上对 我理解、支持和鼓励，给予了我战胜困难的信心和勇气，使我得以顺利完成学业。 再次感谢所有曾经关心我学习和成长的师长、同学和朋友们! 朱有朋 二零壹零年六月于郑州 目录 摘要1 l 文献综述3 1 1 小麦品种的纯度鉴定研究3 1 1 1 小麦形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 的纯度鉴定研究4 1 1 2 小麦细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r ) 的纯度鉴定研究5 1 1 3 小麦生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r ) 的纯度鉴定研究。5 1 1 4 小麦分子标记( m o l e c u l em a r k e r ) 的纯度鉴定研究7 1 1 4 1R F L P 分子标记8 1 1 4 2R A P D 标记9 1 1 4 3A F L P 标记9 1 1 4 4S S R 标记1 0 1 2 小麦杂株产生的原因1 l 1 2 1 机械混杂类1 l 1 2 2 天然异交类1 1 1 2 3 剩余变异类一1 2 1 2 4 杂株与本品种的区分比较1 2 1 3S S R 标记在小麦遗传育种研究中的应用。1 2 1 3 1 研究小麦遗传多样性1 3 1 3 1 1 小麦近缘野生植物亲缘关系分析1 3 1 3 1 2 小麦群体遗传结构研究1 3 1 3 1 3 小麦种质资源研究1 4 1 3 1 4 小麦遗传多样性变化动态研究1 4 1 3 2 构建小麦遗传连锁图谱一1 5 1 3 3Q T L 定位l6 1 3 4 鉴定和区分品种1 6 1 3 5 检测种子纯度1 7 1 3 6 构建指纹图谱1 7 1 3 7 标记和定位目的基因1 7 1 3 8 系谱分析和分子标记辅助选择育种。1 8 1 3 9 鉴别小麦细胞遗传学材料1 8 2 引言1 9 3 材料与方法：2 l 3 1 试验材料与设计2 l 3 2 试验方法2 2 3 2 1S S R 分析2 2 3 2 1 1D N A 的提取及纯化2 2 3 2 1 2S S R 引物2 2 3 2 1 3P C R 反应体系2 4 3 2 1 4P C R 反应程序2 4 3 2 1 5 扩增产物电泳检测2 5 3 2 1 6 扩增产物的银染检测2 5 3 2 2 农艺性状的调查。2 6 3 3 数据分析2 6 3 3 1S S R 数据分析2 6 3 3 2 农艺性状数据分析2 6 3 3 3 不同分组方式的结果的吻合率计算2 7 4 结果与分析2 7 4 1 小麦杂株农艺性状的分析2 7 4 1 1 小麦杂株农艺性状的差异分析一2 7 4 1 2 小麦杂株农艺性状的变异分析。3 0 4 1 2 1 小麦杂株农艺性状的变异系数分析3 0 4 1 2 2 小麦杂株农艺性状的一致性分析3 3 4 1 38 8 个杂株农艺性状分组标准3 6 4 2 小麦杂株的分子标记分析3 7 4 2 14 7 对引物在8 8 个材料中的标记分析3 7 4 2 28 8 个杂株S S R 标记分组标准3 9 4 3 农艺性状、S S R 标记和农艺性状+ S S R 标记分组结果的比较3 9 4 3 1 农艺性状+ S S R 标记分组标准3 9 4 3 2 农艺性状、S S R 标记和农艺性状+ S S R 标记分组吻合率的比较与分析4 0 4 4 小麦新品种豫农2 0 2 与其它1 8 个品种( 系) 的指纹图谱分析4 l 4 4 1S S R 多态性分析4 1 4 4 2 豫农2 0 2 与1 8 个小麦品种( 系) 的遗传相似性分析4 2 4 4 31 9 个供试材料指纹代码构建。4 3 5 结论与讨论4 4 5 1 结论4 4 5 2 讨论4 4 I I 5 2 1 小麦新品种豫农2 0 2 杂株类型的鉴定方法4 4 5 2 1 1 遗传标记对小麦种子纯度、杂株鉴定与遗传差异分析的应用4 4 5 2 1 2 小麦新品种豫农2 0 2 杂株类型分组方式的评价4 5 5 2 2 小麦新品种豫农2 0 2 杂株产生的原因及防止措施4 7 5 2 2 1 小麦新品种豫农2 0 2 杂株产生的原因4 7 5 2 2 2 小麦新品种豫农2 0 2 的防杂措施4 8 5 2 3 小麦新品种豫农2 0 2 与1 8 个小麦品种( 系) 的区分及指纹图谱的构建4 8 5 3 本研究拟开展的后续工作一4 9 参考文献：5 l A B S T R A C T ：6 0 I I I 河南农业大学硕士学位论文 摘要 小麦遗传差异的研究对于小麦种质资源评价、品种权益保护和种子纯度检测具有重要意 义。鉴定小麦新品种杂株类型并构建其指纹图谱，不仅有助于小麦新品种繁育推广，也有利 于种子纯度检测方法的研究。本研究利用形态标记和S S R 分子标记对小麦新品种豫农2 0 2 的杂株类型进行鉴定，旨在从表型性状和分子水平上弄清楚小麦新品种豫农2 0 2 杂株的遗传 差异特点，同时利用S S R 分子标记对1 9 个小麦品种( 系) 的遗传差异进行分析，并构建其 指纹图谱，为进一步探讨小麦种子纯度鉴定方法提供依据。其结果如下： 1 小麦新品种豫农2 0 2 杂株在农艺性状的表现上具有较为广泛的变异区间。不同性状 间变异系数变化范围最大的是成穗数，为1 4 2 5 9 2 ，平均值为2 9 3 ；变化范围最小 的是小穗数，为2 2 - - - , 1 0 1 ，平均值为5 4 。而不同材料间各性状变异系数的平均值变 化范围为8 9 1 9 6 ，变异系数最大的是材料7 7 ，为1 9 6 ；变异系数最小的是材料8 8 ， 为8 9 。 2 对8 8 份材料的株高、成穗数、旗叶长、旗叶宽、倒二叶长、脖长、倒一节长、倒二 节长、穗长、小穗数、主茎穗粒数等1 1 个农艺性状指标的平均值进行t 测验分析，1 1 个性 状与临近对照相应性状的平均值相比，所调查的8 8 份材料在1 1 个性状上分别有5 0 、1 0 、 1 8 、2 9 、1 8 、1 4 、1 4 、3 5 、2 4 、2 4 、3 7 份材料与对照存在显著性或极显著性差异，所占的 比例依次为5 6 8 2 、1 1 3 6 、2 0 4 5 、3 2 9 5 、2 0 4 5 、1 5 9 1 、1 5 9 l 、3 9 7 7 、2 7 2 7 、 2 7 2 7 、4 2 0 5 。 3 对8 8 份材料的株高、成穗数、旗叶长、旗叶宽、倒二叶长、脖长、倒一节长、倒二 节长、穗长、小穗数、主茎穗粒数等1 1 个农艺性状指标进行F 测验分析。与临近对照相比， 所调查的8 8 份材料在1 1 个性状上分别有5 1 、l O 、2 、8 、0 、1 4 、1 5 、1 6 、2 5 、1 1 、7 份材 料间存在显著性或极显著性差异，所占比例依次为5 7 9 5 、1 1 3 6 、2 2 7 、9 0 9 、0 0 0 、 1 5 9 1 ，1 7 0 5 、1 8 1 8 、2 8 4 l 、1 2 5 0 、7 9 5 。 4 用4 7 对S S R 引物对8 8 份材料的D N A 进行分子标记鉴定。在8 8 份材料中，S S R 引 物标记的带型与对照豫农2 0 2 带型相同的条数为2 2 4 7 条，所占比例为4 6 8 l 1 0 0 0 0 ； 与对照豫农2 0 2 带型不相同的条数为0 - - - - 2 5 条，所占比例为0 0 0 5 3 1 9 ；其中含有杂合 带的条数为O 1 5 条，所占比例为0 0 0 一- 3 1 9 1 。 5 采用农艺性状、S S R 标记和农艺性状+ S S R 标记等三种分组方式将8 8 个材料分为三 大类：剩余变异类、天然异交类和异品种( 系) 类，计算三种分组方式的吻合率。从整体上 看，农艺性状分组与S S R 标记分组有6 2 个材料一致，吻合率为7 0 4 5 ；S S R 标记分组与 农艺性状+ S S R 标记分组有7 5 个材料一致，吻合率为8 5 2 3 ；农艺性状分组与农艺性状+ S S R 标记分组有7 5 个材料一致，吻合率为8 5 2 3 。 6 利用2 4 对S S R 引物对1 9 个小麦品种( 系) 的遗传差异进行分析，共检测到7 3 个多 态性位点，每对引物平均为3 0 4 个，变幅为2 5 个。与相关的研究比较发现，这1 9 个小 河南农业大学硕上学位论文 麦品种( 系) 的S S R 位点变异范围和平均等位变异个数相对较少。 7 1 9 个小麦品种( 系) S S R 位点的多样性信息含量( P I C ) 变幅为O 1 8 8 4 0 7 3 6 8 ，平 均为O 5 4 8 1 。豫农2 0 2 与其他1 8 个小麦品种( 系) 的遗传相似系数为0 2 0 8 - - 0 7 0 8 ，平均 为0 4 1 0 。2 4 个S S R 位点的P I C 值以引物B A R C 0 5 9 值最高( O 7 3 6 8 ) ，有5 个等位变异； 引物D u p w 2 5 4 值最低( O 1 8 8 4 ) ，有3 个等位变异；等位变异最少的引物有2 个等位变异。 从结果可以看出位点多样性信息含量与等位位点数目不完全一致。 关键词：小麦新品种；豫农2 0 2 ；杂株类型；遗传差异；农艺性状；S S R 标记；指纹图 谱 2 河南农业大学硕士学位论文 1 文献综述 高产、优质的优良品种是农业增产、农民增收的前提。随着科技的进步和发展，越来越 多的优良品种为农业的丰产丰收做出了重要贡献。 小麦是我国的重要粮食作物之一，也是河南省的第一大粮食作物，小麦生产的发展直接 关系到地方经济的发展和国家粮食安全。小麦属自花授粉作物，但仍存在一定的天然异交率， 不同小麦品种相邻种植时，很容易发生天然异交；对于刚开始繁育和推广的小麦新品种来说， 由于分离纯化世代有限，导致群体内个体间在遗传性状上存在一定的差异，很容易产生剩余 变异株；另外，在小麦种子整个繁育过程中，人为作业不当使繁殖的小麦品种中混进了其他 小麦品种的种子，导致出现机械混杂株。近年来，随着国家惠农政策的实施和种子产业的快 速发展，种子质量已成为小麦种子生产中普遍关心的问题。种子质量的优劣是品种特征、特 性能否充分发挥的关键，它不仅影响小麦的产量，还影响其品质。随着群众法律意识的日益 增加和科学种田技术的普遍提高，农业生产上对小麦种子质量和品种纯度的要求越来越高。 因此，探讨小麦种子纯度检测的方法，提高种子质量，是小麦新品种推广中急需解决的问题。 1 1 小麦品种的纯度鉴定研究 种子纯度为种子质量的重要指标，所谓种子纯度是指供检样品中本品种的种子数占供检 样品总数的百分率【l 】。品种间的种子混杂、生物学混杂和基冈位点的纯合程度均可造成小麦 株间表型和基因型表达上的明显差异，在很大程度上影响种子纯度。品种间种子混杂往往是 在种子生产过程中，由于播种、收获和贮藏等环节操作没有严格遵循要求所致；小麦的自然 异交率远高于大麦、水稻、大豆等其他典型白花授粉作物，不同小麦品种相邻种植时，很容 易发生天然异交，另外有些小麦品种由于颖壳张开角度大、持续时间长，天然异交率也大大 提高，成为导致生物学混杂的主要原因；而品种基闪型纯合程度则主要受品种选育世代长短 所影响，系统选育t H = 代越长，基因型的纯合程度就越高，反之基因型的纯合程度就较低。品 种间的种子混杂和生物学混杂都会直接影响一个品种的商品品质，而基因位点不纯将会影响 一个品种的遗传稳定性【2 6 】。 随着新品种的选育和推广，品种纯度鉴定技术及检测水平也在不断向前发展。目前，农 作物种子纯度鉴定技术主要依据遗传标记，遗传标记是指可追踪的染色体、染色体某一节段 或某个基因座在家系中传递的一种遗传特性，具有一定的可识别性和可遗传性【_ L 剐。因此， 生物的任何具有差异表型的基因突变都可以作为遗传标记【7 】。理想的遗传标记主要应具备4 条标准：( 1 ) 有较强的多态性；( 2 ) 表现共显性( c o d o m i n a n c e ) ，能够鉴别出纯合基因型和杂合 基因型；( 3 ) 对主要的农艺性状没有影响；( 4 ) 经济方便，观察记载要容易。目前遗传标记主 要有4 种，即形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 、细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r s ) 、生化标记 ( b i o c h e r a i c a lm a r k e r s ) 和分子标记( m o l e c u l a r m a r k e r s ) 9 。1 2 1 。遗传标记总体发展趋势为从宏观向 微观，从费力费时向简便快速方向发展。 3 河南农业大学硕士学位论文 1 1 1 小麦形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 的纯度鉴定研究 形态标记是指与目标性状紧密连锁，表型上可识别的等位基因突变体，即能够明确显示 遗传多态性的外观性状，主要包括肉眼可见的外部特征，包括叶型、叶色、叶片数、叶片宽 窄、株型、株高、穗型、花药颜色、种子形状、大小、色泽、质地、抽穗期、成熟期等特征； 也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性1 6 9 1 。在研究农作物时，通 常是指农艺性状。农艺性状主要是指生长发育习性、植物学特征以及产量性状等方面的主要 性状，观测时主要是以幼苗、叶片、果穗、种子等组织器官的形态、颜色、品质等作为鉴定 的指标1 6 J 。 形态标记法主要包括种子形态鉴定法与幼苗形态鉴定法。种子形态鉴定法是依据种子的 形状、大小、饱满度、色泽等特征加以鉴定。然而对种子而言，可用于品种鉴定的形态学特 征非常有限，并且在种子成熟过程中很容易受气候、水肥等外界环境条件的影响，因此，当 品种数量多、品种间形态差异又非常小时，利用种子形态鉴定不能达到理想效梨7 1 。幼苗形 态鉴定是将种子在控制较为一致的环境条件下种植，然后进行幼苗或植株的生物学特征及形 态学特性等方面的鉴纠”l 。蔡建等f l4 1 以小麦株高、穗长、小穗数、小穗密度、千粒重、粒 长、粒宽和护颖长短等8 个农艺指标为依据，对皖北地区近5 0 年来推广面积在6 6 7 0 0 h m 2 以上的2 0 个主栽小麦品种的遗传差异进行了初步探讨，成功地将供试材料分为8 个不同类 群，划分结果与系谱亲缘基本一致；秦海英掣1 5 】以株高、单株成穗、穗粒数、千粒重、饱 满度、单株产重、叶枯病抗性、抗寒性、抽穗期等9 个主要性状作为分析对象，利用星座图 聚类分析将濮阳市农科所从各地引进地2 0 个小麦品种分成3 类，分析结果与田间表现吻合； 方先文等【l6 】通过对8 个小麦品种8 个性状进行遗传聚类分析，把参试材料分为4 类，初步 认为遗传聚类分析是综合评价小麦优异亲本资源的一种较好的方法。孟凡华等【1 7 】对3 6 个半 矮秆小麦品种( 系) 的1 6 个性状进行了主成份分析，从品种的多花多粒性、繁茂性、丰产性、 抗倒性、抗病性和优质等方面对参试品种( 系) 进行了综合评价，能够将不同品种( 系) 区分 开来；刘三才等【l8 】的研究表明，我国小麦育成品种和地方品种在4 个穗部性状( 芒长、壳 色、颖毛、粒色) 、5 种病害( 条锈病、叶锈病、秆锈病、白粉病、赤霉病) 、6 个农艺和品 质性状( 株高、穗长、穗粒数、千粒重、蛋白质、赖氨酸) 方面都存在较大的遗传差异。 幼苗形态鉴定法的优点是设备简单、操作方便、成本较低，且受人为因素影响小，总体 比较客观，结果相对准确。但也有其局限性：( 1 ) 周期较长、费工占地，且受季节条件限制， 对当年生产的种子纯度在客观上很难加以鉴定；( 2 ) 对受环境条件影响所引起的变异与本品 种遗传所产生的变异区分比较困难：( 3 ) 能够用于鉴定的性状相对较少，只能用于品种间有 明显遗传差异的鉴列1 3 】。 形态标记法具有简单直观、经济方便、易于识别、便于掌握等特点，因此，人们对它的 研究远远早于其他性状，早期的作物纯度鉴定在很大程度上依赖于形态标记。但其缺点也较 多：( 1 ) 其数量非常有限，且多态性较差；( 2 ) 表型易受环境因素、栽培技术和鉴定者的观测 4 河南农业大学硕士学位论文 经验所影响，鉴定结果不完全准确；( 3 ) 一些形态标记掩盖了连锁的次要基因的效应，不能 用于筛选连锁基因中进行鉴别：( 4 ) 形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期 较长f 7 一。因此，形态标记在作物遗传育种中的作用比较有限。 1 1 2 小麦细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r ) 的纯度鉴定研究 细胞学标记即植物细胞染色体的变异，包括染色体核型( 染色体结构、数目、随体有无、 着丝粒位置等) 和带型( C 带、N 带、G 带等) 的变化【1 9 1 。8 0 年代以后，基因组原位杂交技术 ( G o I n i ci ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 的发展为细胞学标记增添了新的内容2 0 2 1 】。细胞学标记主要应 用在外源基因的定位和分析上，这些外源基因一般来源于小麦的近缘种属。为了改良普通小 麦种质资源，遗传学家通过染色体工程、远缘杂交等方法将人类所需要的许多基因导入小麦， 如抗病虫害、耐早、耐寒、耐盐碱等基因，这些外源物种的染色体在形态上明显不同于小麦， 使得普通小麦的染色体发生了部分变化。与形态标记相比，细胞学标记的优点是能够进行一 些重要基因的染色体或染色体区域定位。易自力等田】以普通小麦中国春为对照，对( 节节麦) 中国春、( 无芒山羊草) 中国春和( 卵圆山羊草) 中国春3 种同核异质杂种小麦进行了核型分析 比较，结果表明它们的核型与对照一致。窦全文等【2 3 】利用C 分带、基因组原位杂交并结合 分子生物学技术，对1 2 份巨穗小麦种质资源中的外源遗传物质进行了检测，同时讨论了2 A i 在巨穗小麦种质中存在的遗传学意义及小麦遗传改良中的应用。王长有等【2 4 】对( 小麦 E r e ；c t i s e l u s ) B C 2 F 2 衍生后代的形态学和细胞学进行了研究；利用细胞学标记可以研究小麦 核质不育。王小利等【2 5 】利用C 分带和A P A G E 技术，对不同核型的具有偏凸、粘果、易变 和二角山羊草细胞质的小麦雄性不育系进行分子细胞学遗传标记检测，结果表明G l d l B 3 位 点和I R S 端带可以作为1 B L 1 R S 易位型不育系分子细胞学遗传标记。 细胞学标记需要花费较大的人力和较长时间，难度大，同时某些物种对染色体变异反应 极为敏感；还有些变异难以用细胞学标记进行检测。此外，染色体带型及核型变化是由染色 体结构与数目变化引起的，如多倍体、缺体、三体以及染色体倒位、易位、重复、缺失等。 因此，到目前为止，真正应用细胞学标记检测种子纯度还很少。 1 1 3 小麦生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r ) 的纯度鉴定研究 生化标记是在生化水平上进行鉴定的一类标记，主要包括两种方法：( 1 ) 物理化学法； ( 2 ) 蛋白质电泳法。 物理化学法是利用种子含有的某些特殊生理活性物质在某些特殊的化学药剂中产生特 定的反应，从而通过测定种子的生理生化指标来鉴定品种纯度，如荧光扫描分析法、愈创木 酚法、苯酚染色法等 2 6 1 。物理化学法快速、简便，但因要求被鉴定的种子必须具备一些物 理化学的特异反应，其应用范围也受到极大限制。 近年来，利用蛋白质电泳技术鉴定品种和杂交种的纯度得到广泛应用 2 7 3 0 】，该方法可 以产生具有品种特征的蛋白质标记谱带或特定的D N A 指纹，可以准确地将不同品种区分开 来，在重复性和稳定性方面优于形态鉴定法，有较强的实用性。种子蛋白质电泳技术已广泛 5 河南农业大学硕士学位论文 应用于小麦、大麦、玉米种子真实性和品种纯度鉴定【3 卜3 5 1 。 根据蛋白质的特性可将蛋白质电泳法分为同工酶电泳和种子贮藏蛋白电泳两大类。目前 大约有1 8 0 多个生化标记位点被定位于小麦特定的染色体或臂上【3 6 1 ，其中已对编码小麦 L M W 、H M W 麦谷蛋白质亚基及a 、B 、? 、? 麦醇溶蛋白进行了基因定位，在小麦遗传育种、 品种鉴定和品质评价等研究领域中得以应用。通过检测基冈表达产物同丁酶和蛋白质的有无 或多少来判断含有该标记染色体的片段存在或缺失的位置，进而推断目标基因在该染色体或 片段上的位置。生化标记在外源基因鉴定和定位上有很高的利用价值，目前在中间偃麦掣3 7 3 8 1 、黑型3 9 1 、簇毛麦 4 0 4 2 1 、山羊草等小麦异附加系、易位系和异代换系的基因定位上都 曾有成功应用。 1 9 5 9 年M a r k e t 和M o i l e r 首次提出同工酶的概念以来，有关同工酶的研究得到了迅速发 展。目前，在小麦上定位的同工酶基因位点已达2 0 多个1 4 4 。酶蛋白本身的等位基因和非等 位基因的差异是造成同工酶谱差异的主要原因。同工酶谱是基因表达后分子水平的表型，通 过其谱带的分析能够简便快速地识别出编码这些谱带的等位基因和基因位点。因为同工酶谱 带与基因位点直接相关，而且几乎有2 5 的位点具有多态性，所以该技术已成为一种非常有 效的遗传标记方法。李卓杰等【4 5 】建立了I E F 同工酶检测种子纯度的技术。近年来，随着等位 酶水平切片凝胶电泳技术的发展，给同工酶标记带来了巨大的推动作用。但是同工酶电泳分 析也有一定的局限性：首先，有限种类的酶分析会给结果带来一定的偏差，即便是一个个体 的全部酶也仅仅是该个体很少的一部分，大约有1 0 0 种，常用的酶又只是其中2 0 3 0 种可溶 性酶。因此，同工酶分析在一定程度上会受所选用酶的种类及数量的限制而使结果发生偏差； 其次，由于翻译后的修饰、酶和酶谱的特异性与相对较低的多态性等原因，研究所选的酶的 所有基因未必都能完全表达在酶谱上【拍】，因此，同工酶分析在纯度检测的应用中受到一定 的限制。 小麦族( T r i t i c e a e ) 大部分生化标记的多态性在种属间表现明显，在同一种内不同的品种 或材料间缺乏足以作为品种特征特性的多态性【4 7 4 引，而麦谷蛋白和醇溶蛋白( 特别是后者) 在品种间差异较明显，其电泳谱带的多少和组合方式完全受基因型控制，因此被称为品种的 指纹( f i n g e rp r i n t ) 。L o o k h a r t 掣4 9 J 建立了一种标准化的麦醇溶蛋白鉴定技术。相对而言，麦 醇溶蛋白检测种子纯度性的研究更为深入。1 9 8 6 年，国际种子检验大会将小麦品种醇溶蛋白 质分析技术列入国际种子检测规程。随后有很多国家建立了小麦种子纯度的醇溶蛋白国家检 测标准。国内外许多研列5 0 5 3 1 均表明小麦醇溶蛋白组成是受遗传因素决定，不受栽培条件、 气候条件、种植年限等环境因素的影响。不同品种电泳图谱在谱带数量、颜色深浅、迁移率 等方面都存在稳定的差异，是绘制小麦蛋白指纹图谱的理想标记，可应用于小麦品种区分和 种子纯度检测。 小麦醇溶蛋白是种子胚乳中的主要贮藏蛋白，编码醇溶蛋白基因的6 个位点( G l i - A l ， G l i - B i ，G l i D 1 ，G I i - A 2 ，G l i B 2 ，G l i D 2 ) 间存在大量的等位基因变异，从电泳图谱上发 6 河南农业大学硕士学位论文 现不同等位基因间的遗传差异主要表现在蛋白谱带的数量、相对迁移率等方面f 5 2 5 5 1 。通过 酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳( A P A G E ) 技术得到的醇溶蛋白谱带组合类型完全受基因型控制， 不受环境条件影响，在品种间存在稳定丰富的多态性，因而可作为品种的“生化指纹，【5 0 5 6 1 。 目前，醇溶蛋白电泳技术不仅在小麦遗传多样性分析5 7 1 、品质改良【5 4 1 等方面得到应用，还 应用于杂交小麦种子纯度检测。赵伟等【5 8 谴过酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术构建杂交小麦 西杂一号、西杂三号和西杂五号的醇溶蛋白标准电泳图谱，并对其种子纯度进行鉴定，结果 表明，杂交种的谱带类型是由亲本决定的，亲本的谱带类型存在稳定的差异，部分表现为互 补型( 共同遗传了父母本的差异谱带) 或杂种型( 杂交种的特有谱带) ，根据这些谱带可以准确 区分杂交种和亲本，鉴定杂交种子纯度。尽管醇溶蛋白电泳技术被广泛地应用于小麦种子纯 度的检测，但也有不足之处。赵俊彪等【5 9 】认为蛋白质多态性低，重复率偏低，不能完全显 示品种( 系) 间的遗传，往往难以区别一些亲缘关系较近的小麦品种( 系) 。 蛋白质电泳法是根据蛋白质数量、大小和结构等方面的差异来揭示基因的差异，即由生 化表型来反映基因型，具有简便快速、重复性好、准确性高等优点，即利用电泳技术对供检 的种子或幼苗的蛋白质进行分离、染色，然后根据蛋白质电泳谱带的差异，并与品种的标准 谱带相比较，从而鉴定品种的真实性和种子纯度【6 0 6 2 1 。 生化标记虽然大大拓宽了遗传标记的范围，但由于方法和技术的局限，能经常使用的生 化标记的数量极为有限，无法建立较详细的遗传图谱，此外不同类型的同工酶往往需要不同 的检测程序，而且有些同工酶在不同发育阶段或组织内的特性或类别不同，因此一定程度上 限制了其广泛应用。与传统的鉴定方法相比，醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术具有简 便快速、准确易行、分辨率高等优点，适用于室内杂交种子的纯度鉴定。 与形态标记和细胞学标记相比，生化标记具备以下优点：( 1 ) 表现中性；( 2 ) 直接反映基 因产物的差异，受环境条件影响相对较小。但是，蛋白质只是基因表达的产物，具有较强的 时空特异性，而且环境因子对基因表达的影响也会影响检测结果的准确性，加之目前可使用 的生化标记数量有限，且某些酶的电泳技术和染色方法有一定难度，因此，在实际应用中受 到了某些限制。 1 1 4 小麦分子标记( m o l e c u l em a r k e r ) 的纯度鉴定研究 分子标记技术是伴随着分子生物学的快速发展而产生的一种通过直接检测D N A 碱基序 列变异来鉴定研究材料的新型遗传标记，是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。广义 的分子标记包括两类，即：同工酶标记与D N A 标记，狭义的分子标记仅指D N A 标记。目 前所指的一般是狭义的概念，即D N A 分子标记【8 】。 D N A 分子标记是指电泳后能够根据一定的方法检测到的反映基因组某些变异特征的 D N A 片段。这种D N A 片段可以通过限制性内切酶切割、P C R 扩增或两者结合而获得。由 此，可以把D N A 标记分为四个类别： ( 1 ) 基于D N A - D N A 杂交的D N A 标记，主要指限制性片段长度多态性( R e s t r i c t i o nf r a g m e n t 7 河南农业大学硕上学位论文 l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称R F L P ) 和重复数可变串联重复( V a r i a b l en u m b e ro f t a n d e mr e p e a t s ， 简称V N T P ) 。 ( 2 ) 基于P C R ( P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n ) 技术的标记方法。它又分为二类，一是利用随机 引物( A r b i W 叫p r i m e r ) 进行扩增，主要有随机扩增多态性D N A 技术( R a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i cD N A ，简称R A P D ) 、随机引物P C R 标- h 己( A r b i t r a r yp r i m e rP C R ，简称A P - P c R ) 和简单序列重复间区( I n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，简称I S S R ) ；另一类标记是使用特定引物 或引物对扩增的标记，主要有S C A R ( S e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ) 、 s T S ( S e q u e n c et a g g e ds i t e ) 、小卫星D N A ( M i n i s a t e l l i t eD N A ) 、微卫星D N A ( M i c r o s a t e l l i t eD N A ) ， 又称简单重复系歹l J ( S i m p l es e q u e n c er e p e a t ，简称S S R ) 、R G A ( R c s i s t a n c eg e n ca n a l o g s ) 等。其 中S T S 和S C A R 属于位点特异的P C R 标记方法，其它则属于多位点标记方法，检测的区域 均与微卫星序列有关。 ( 3 ) 基于P C R 与酶切相结合的标记方法，主要指A F L P ( A m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 和C A P S ( C l e a v o dA m p l i f i e dP o l y m o r p h i cS e q u e n c e ) 两类。其中A F L P 标记方 法是先酶切，然后用特殊设计的引物进行扩增，而C A P S 是先扩增，然后酶切扩增片段，检 测酶切片段的长度多态性。 ( 4 ) 基于单个核苷酸多态性的D N A 标记，主要指最近发展起来的单核苷酸多态性S N P 标记。 常用的分子标记有： 1 1 4 1R F L P 分子标记 R F L P 标记是B o t s t e i nB 等在1 9 8 0 年创建的，它是根据物种基因组D N A 在限制性内切酶作 用下，产生较多的大小不等的D N A 片段，利用放射性同位素或某些非放射物质标记探针与 转移于支持膜上的基因组总D N A ( 经限制性内切酶消化) 杂交，通过显示限制性酶切片段 的大小来检测不同遗传位点等位变异( 多态性) 的一种技术。R F L P 技术的优点是无表型效 应，与形态标记或同工酶标记相比，其不受生物发育阶段和生物生活环境条件影响，并且与 基因的显隐性无关。该技术具有共显性，可以区别纯合基因型与杂合基因型，可以提供单个 位点较完整的资料，而且检测到的遗传位点相当多，因此，该标记一出现便得到广泛的应用。 V a v i n o 等【6 3 1 利用R F L P 技术，用2 个特异性的麦醇溶蛋1 刍( g l i a d i n s ) 探针和麦谷蛋白 ( g l u t e n i n s ) ，将意大利的5 4 个普通小麦品种区分开；张文俊等【删用R F L P 技术发现了来自黑 麦6 R 染色体上的抗小麦白粉病基因( P m ) ；翁跃进等【6 5 】利P 9 2 9 个小麦R F L P 探针及6 种限制性 酶切的M 染色体组D N A 进行分子杂交，获得了5 5 个M 染色体组的R F L P 标记带，其中有1 5 个 与小麦A B D 染色体组相同，4 0 个为M 染色体组的特殊标记，在顶芒山羊草和小麦顶芒山 羊草双二倍体以及小麦顼芒山羊草异代换系中能够稳定遗传，可作为锚探针( a n c h o r p r o b e s ) 用于鉴别M 染色体和小麦背景下具有M 染色体遗传物质的双二倍体、易位系、代换系和附加 系以及它们的剂量；朱列层等【6 6 J 用R F L P 方法研究了陕西省4 0 年代以来广为种植的小麦品种 的遗传多样性，并利用U P G M A 聚类分析法将他们分为4 组，从分子生物学角度揭示陕西省 8 河南农业大学硕上学位论文 小麦品种遗传多样性特点及演变规律，为品种资源研究和遗传育种工作提供理论参考依据。 由于R F L P 技术复杂，而且费用高、需时较长、有放射性，而且在普通小麦的六倍体水 平上，由于几乎所有小麦属各亚种都与T a e s t i v u m 密切相关，其种间多态性仍较低，导致 R F L P 技术在小麦遗传育种应用中受到一定的限制。 1 1 4 2 凡廿D 标记 R A P D 标记是由美国加里福尼亚生物研究所的W e l s h 和杜邦公司的科学家W i l l i a m s 在 1 9 9 0 年几乎同时发展起来的一项新型分子标记技术，它是利用一个随机寡核苷酸引物( 一般 为l O 个碱基) 对基因组进行P C R 扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺电泳或琼脂糖凝胶电泳分离， 经染色或放射至显影来检测D N A 序列的多态性。R A P D 实际上是一种特殊形式的R F L P 标记， 它与一般R F L P 标记的主要区别在于用于扩增多态性R A P D 的引物不是专一的，而是随机的。 与R F L P 标记技术相比，R A P D 标记技术具有操作简便、快速、D N A 用量少、不使用同位素、 无放射性、多态性检出率较高等优点，应用十分广泛。另外合成一套引物，可应用于不同生 物基因组的分析，具有通用性和广泛性，同时，R A P D 标记在构建遗传连锁图谱、品种鉴定、 标记和定位基因、遗传多样性研究和杂种优势利用等方面均有广泛的应用【5 4 5 7 1 。因而，R A P D 技术受到了许多学者的重视。郑红军掣6 7 】用R A P D 标记技术检测了外源D N A 转入普通小麦的 后代矮杆变异体，有5 个引物检测出D N A 的多态性；W e i 等【6 8 】用R A P D 分子标记技术分析了 小麦簇内代表8 个不同居群的2 2 个物种，结果获得11 - I 对物种特异和2 9 个对属特异的片段， 进一步揭示了它们之间的亲缘关系；鲍晓明等【6 9 】用R A P D 技术对2 个小冰麦易位系和杂交种