玉米穗分化候选基因的克隆-硕士论文

分类号 河南农业大学硕士学位论文 密级 英文是基目： ! Q n i 垒gQ 堡堑亟i 鱼丛星Q 曼n 星! QS 卫i k 曼 d i f f e r e n t i a t i o ni nM a i z e 导 专 研究方向： 生塑堇丕直叠 论文提交 日期： 学位授予 日期： 幽II Il lllr l l J l l I I I r l l l I II l l ll l l lFfIJIIllnlu | I ll i l Y 17 2 8 7 9 3 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论玉米穗分化相关基因的克隆 学位 文题目 级别 硕士 学生学科导师刘宗华教授、汤继 姓名 白杨作物遗传育种 专业姓名华教授 学位论 文 否如需保密，解密时间年月 日 是否保 密 独创性声明 研究生签名：季飒叨俐导师签名：影呵 日期：砌年g 月日日期：矽年铭月l ；日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必 须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文 的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方 式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业 离开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署 名单位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归 河南农业大学所有，否则，承担相应的法律责任。庀枣j 习 研究生签名：自府勿签导师签名：黝砰院领导签各- 二二划 日期：辨多月J 明日期：撕，争饷，弓日 白期：w 牌6 月嘶 致谢 本文是在导师刘宗华教授、汤继华教授和丁冬老师的悉心指导下完成的。在攻读硕士 学位的三年时间里，导师们严谨的治学态度、渊博的知识、活跃的学术思想、执着的科研 精神及高尚的做人原则，都给我留下了终生难忘的印象。三年的学习和科研工作，不仅使 我的知识结构和科研能力上了一个新台阶，更重要的是，各方面的素质得到了提高。所有 这一切都将成为我受益终生的宝贵财富! 在此，学生谨向导师们表示最衷心的感谢，没有 您们的无私付出就没有我今天的成绩，您们辛苦了! 感谢遗传组胡彦民老师，谢谢他提供的便利的试验场所和热心的试验帮助。感谢陈 彦惠老师、崔党群老师、李玉玲老师、吴建宇老师和席章营老师在学科上的教导，正是你 们丰富的教学经验才使我掌握了大量的试验理论，使我终身受益，在此表示感谢。同时感 谢扬州大学的王益军老师和河南农业大学付志远老师，试验过程中的困难的解决离不开他 们的帮助。感谢农科院王振华研究员、铁双贵研究员和河南农业大学吴建宇老师对论文的 修改，并提出了非常宝贵的意见。 特别感谢我的师兄冯晓曦、王艳朋、朱自贤和师姐孙玲凌、林兴娥、段柳静、程荣霞， 是他们给予了我最基础的试验指导，是我分子生物学试验征途上的领路人，希望他们都有 好的发展和作为。感谢和我同届的付忠军、王长成、崔子田、李海霞、杜光玲，谢谢他们 在试验中的帮助和生活上的照顾，祝他们都有一个好的前程。感谢师弟闫成辉、邵可、宋 桂良、张战辉、王永学、韩明水、袁亮和师妹进茜宁、吴向远、刘慧，正是大家在实验室 的和谐与团结才使得我的试验顺利开展。同时也要感谢4 # 4 0 6 的各位姐妹。 最后，向所有在生活中为我付出了大量心血的亲人表达我最深的谢意，没有你们的支 持和付出，就没有我所有的一切。 向所有的人表达我最深的谢意! 白杨 2 0 1 0 0 5 3 1 目录 摘要1 l 文献综述2 1 1 玉米穗分化过程2 1 1 1 玉米雌穗分化过程2 1 1 2 玉米雄穗分化过程3 1 L3 玉米穗分化的分子生物学研究3 1 - 2 转座子标签法克隆基因4 1 2 1 转座子的概念5 1 2 2 转座子标签法克隆基因的原理和方法5 1 2 2 1 转座子标签法克隆基因的原理5 1 2 2 2 转座子标签法克隆植物基因的方法5 1 2 3A c D s 、S p m d s p m 转座子5 1 2 4M u 转座子：6 1 2 4 1M u 转座子的发现及类型：6 1 2 4 2 胁的插入突变的特点7 1 2 4 3 胁因子的应用7 1 2 4 4 利用讹转座子克隆基因8 1 3A F L P 的标记1 0 1 3 1 A F L P 标记的基本原理1 0 1 、3 2 A F L P 技术特点1 0 1 3 3 改良的A F L P 技术1 1 1 3 4A F L P 标记的应用1 l 1 3 4 1 遗传多态性和种质鉴定1 1 1 3 4 2 构建遗传图谱1 1 1 3 4 3 辅助育种1 1 2 引言1 2 3 材料与方法1 2 3 1 试验材料1 2 l 3 2 玉米穗分化相关基因突变体的筛选1 2 3 3 高质量D N A 的提取和纯化1 2 3 3 1 采用改良的S D S 法提取亲本及突变体的基因组D N A 1 2 3 3 2D N A 的纯化及质量检测i 1 3 3 4 改良的A F L P 的基本程序1 4 3 4 1 限制性内切酶酶切1 4 3 4 2 酶切产物和接头引物连接1 4 3 4 2 1 连接反应的接头序列1 4 3 4 2 2 接头的制备和连接反应1 4 3 4 3 预扩增和选择性扩增的体系及P C R 反应的程序1 5 3 4 3 1 预扩增的引物和体系1 5 3 4 3 2 选择性扩增的体系和P C R 反应程序1 6 1 3 4 4 选择性扩增产物检测1 6 3 4 4 1 扩增D N A 变性1 6 3 4 4 2 电泳准备1 7 3 4 4 3 扩增产物的电泳1 7 3 4 4 4 扩增产物的银染检测聚丙烯酰胺凝胶N a O H 染色方法1 7 3 5 差异片段的回收和测序1 8 3 5 1 差异片段的回收1 8 3 5 2P C R 产物的纯化：1 8 3 5 3 差异片段韵测序1 9 3 5 3 1 差异D N A 片段与P M D l 8 - T 载体连接1 9 3 5 3 2 热击转化1 9 3 5 3 3P C R 检测阳性克隆，2 1 3 5 4P C R 产物的测序2 l 4 结果与分析2 1 4 1F 1 代种子的筛选2 1 4 2 穗分化基因突变体F M 的筛选2 1 4 3 穗分化突变体侧翼片段扩增：2 2 4 3 1 基因组模板D N A 质量的检测2 2 I I 4 3 2 基因组D N A 的酶切和连接的检测 4 3 3A F L P 预扩增的检测 4 3 4A F L P 选择性扩增的检测 4 3 5 差异片段的回收检测 4 3 5 12 2 0 b p 差异片段的序列分析 4 3 5 1 1 候选基因的生物信息学分析 4 3 5 26 7 3 b p 差异片段的序列分析 4 3 5 2 1 候选基因的生物信息学分析 5 结论和讨论 5 1 结论 5 2 讨论 5 2 1M u 转座子的突变频率。 5 2 2 改良的A F L P 法在分离g u 7 插入的侧翼片段中的应用 5 2 3 玉米穗分化与r p s 4 基因 5 2 4 进一步工作 参考文献 英文摘要 I 捅矍 玉米的单穗结实性是由穗行数和行粒数两个性状组成的，并且表现出典型的数量性状特 点，而这两个性状分别是在玉米雌穗的小穗和小花分化期形成的，在玉米雌穗和雄穗形成过 程中，需要经过从营养生长向生殖生长转变，生殖细胞向小穗成对分生组织、小穗成对分生 组织向小穗分生组织、小穗分生组织向小花分生组织等器官和细胞的连续转变过程，在整个 发育过程中受到一系列质量性状基因控制，任何一个基因发生变异，均会导致玉米小穗分化 或小花分化的不正常，引起玉米结实性的降低。因此对控制玉米穗分化相关的基因进行克隆， 不仅可以在一定程度上阐明玉米果穗形成的遗传机理，而且可以通过发掘控制玉米单穗结实 性的优良基因，为选育单穗结实性好的优良玉米自交系提供优异的基因资源。本研究利用转 座子标签法对玉米穗分化的相关基因突变体进行了筛选，并利用改良的A F L P 方法对突变体 的侧翼序列进行克隆，取得了以下主要结论： 1 、利用M u 转座子插入突变的方法，从2 9 7 3 2 株C m s - C 8 7 1 ( 月丹厅纠) g u 7 的F 1 群 体中筛选到4 株雄穗小穗数量减少、不育，同时雌穗花丝减少、结实数降低( 每穗结4 1 0 粒种子) 的插入突变体的插入突变体F 知。 2 、利用改良的A F L P 方法对C m s - C 8 7 - 1 ( 删月f 4 ) 、M u 7 和突变体h 进行多态性分析。 在引物M 1 B g lI I - 2 组合的选择性扩增结果中，发现了一个约8 0 0 b p 与两亲本有差异的特 异性扩增片段。把特异的扩增片段连接转化测序，获得了两个候选序列。得到的序列中包 含抛转座子的部分序列、一对选择性扩增引物的结合位点和两个候选未知片段。候选序 列l 与和细胞分化相关的基因r s p 4 有8 8 的相似性，候选基因2 和N A D H 脱氢酶亚基1 、 B 7 3 的B A CA Y 9 2 8 0 7 7 1 的序列有9 9 的相似性。 3 、利用生物信息学的方法对候选基因序列进行延伸，候选基因1 获得了一个5 0 9 b p 的c D N A 序列，且该c D N A 序列与r s p 4 基因有6 8 的相似性，该基因在B 7 3 的基因组上的 序列为11 9 4 b p ；候选基因2 在B 7 3 的基因组上的序列为2 4 3 2 b p 。有待于通过实时定量P C R 和转基因的方法对其功能进行验证。 关键词：玉米；M u 转座子；穗分化候选基因；克隆 1 文献综述 玉米是世界上三大粮食作物( 玉米、水稻、小麦) 之一，是我国重要的粮食和饲料作物。 据估算，玉米对我国粮食增产的贡献率为4 0 5 ，而水稻和小麦分别为2 6 和2 2 ，因此玉 米生产对于保障我国粮食安全具有非常重要的作用。随着我国耕作制度的不断变迁，对玉米 品种类型的要求也在不断地发生改变，特别是在目前农业生产比较效益低，农村劳动力大量 向城市转移，以及玉米种植密度在逐年增加的情况下，要求玉米品种不但具有产量高、适应 性广、综合抗性好等特点，而且具有较高的制种产量。因为制种产量直接决定了种子生产成 本，是目前降低种子生产成本、减少农民投入、增加企业效益的一条有效途径。因此杂交种 的制种产量与玉米杂交种母本的单穗结实率直接相关。 产量是农作物生产的主要目的，因此如何协调产量构成因素之间的关系，最终达到实现 高产的目标是众多遗传学家和育种学家致力于解决的问题。对玉米等利用杂交种的作物来 说，自交系本身的产量高低在一定程度上影响着杂交种子的成本和推广面积，因此选育高产 的自交系是玉米育种学家必须面对的另外一个问题，在玉米自交系产量的三个主要构成因素 穗行数、行粒数和百粒重中，穗行数和行粒数的变化直接决定着单穗结实的多少，对玉米自 交系产量起作关键性的作用，而这两个性状均与雌穗的分化形成有关。且这两个性状分别是 在小穗和小花分化期形成的，在发育过程中又受一系列质量性状基因的控制，任何一个基因 发生变异，均会导致玉米小穗分化或小花分化的不正常，引起玉米结实性的降低。 1 1 玉米穗分化过程 玉米雌、雄穗的分化与形成是个连续的动态发育过程，根据每一时期的发育特点，可 将玉米雌雄穗分化过程分为生长锥未伸长期、生长锥伸长期、小穗分化期、小花分化期和 性器官发育形成期等五个主要时期q 1 。 1 1 1 玉米雌穗分化过程。2 1 1 ) 生长锥未伸长期：雌穗生长锥开始分化，但尚未伸长，呈基部宽度大于长度，顶部 光滑的圆锥体。生长锥下面已分化出节和缩短的节间，将来发育成果穗柄，每节上有叶原 始体，以后发育成苞叶。 2 ) 生长锥伸长期：生长锥显著伸长，长度大于宽度，生长锥的基部出现分节和叶突起。 在叶突起的叶腋间将形成小穗原基，以后叶突起退化消失。 3 ) 小穗分化期：生长锥进一步伸长，出现小穗原基，每个小穗原基又迅速分裂为两个 小穗突起，形成两个并列小穗，并在它的基部出现褶皱状的突起，形成颖片。小穗原基的 分化从雌穗中下部开始渐次向上向下进行，当生长锥中下部出现成对并列的小穗突起时， 其顶部还是光滑的圆锥体。在条件适宜的情况下，可继续分化出小穗原基，并延续到以后 分化期。所以条件( 光、温、营养等) 适宜，雌穗生长锥的分化发育就会更加完全，小穗 的数量会相对增加，以后形成的果穗也会增大。因此，小穗形成期是决定穗长和穗粒数的 重要时期。 2 4 ) 小花分化期：每个小穗突起进一步分化成大小不等的两个小花突起，大的位于上方， 可继续发育为结实花，小的位于下方，以后退化为不育花。在小花突起原基的外围形成三 角形排列的三个雄蕊原基，在中央分化出一个扁圆形隆起的雌蕊原基。在小花分化末期， 雄蕊突起生长减慢最后消失，而雌蕊原始体却迅速生长。行粒数的多少及其整齐度，即取 决于这个时期。 5 ) 性器官发育形成期：雌蕊花丝逐渐伸长，顶端出现分裂，花丝上出现绒毛，子房体 增大，胚囊性细胞形成，果穗急剧增长，花丝抽出苞叶( 吐丝期) 。 由分化过程可以看出，雌穗分化过程直接影响着果穗的基本形态，其中以小穗和小花 分化的过程尤为重要。 1 1 2 玉米雄穗分化过程m 2 1 1 ) 生长锥未伸长期：茎端生长锥是一个表面光滑的圆形突起，长度略小于宽度。茎部 有叶原基突起，它分化茎的节、节间和叶原始体。 2 ) 生长锥伸长期：生长锥开始伸长，长度大于宽度，表面光滑，随后，生长锥显著伸 长，其基部形成叶突起，后在叶腋处发生分枝原基；中部开始分节，以后形成穗轴节片， 其节上着生小穗原基。 3 ) 小穗分化期：生长锥继续伸长，基部出现分枝突起，中部出现小穗原基。每一小穗 原基又迅速分裂为成对的两个小穗突起，大的在上，将来发育成有柄小穗；小的在下，发 育成无柄小穗。小穗基部可看到颖片的形成，同时生长锥基部的分枝突起也迅速发育为雄 穗的分枝，再分化出成对排列的小穗。 4 ) 小花分化期：第一个小穗突起进一步分化出两个大小不等的小花突起，在小花突起 的基部形成三个雄蕊原基，中央形成一个雌蕊原始体。当继续发育时，雄蕊生长产生药隔， 雌蕊原始体逐渐退化。 5 ) 性器官发育形成期：雄蕊迅速生长，花药进一步增大，花粉囊中的花粉母细胞形成 四分体，四分体进一步发育形成花粉粒。穗轴节片迅速伸长，整个雄穗长成。 1 1 3 玉米穗分化的分子生物学研究 尽管玉米雌穗和雄穗花序的形成具有典型的数量性状遗传特点【3 1 ，然而玉米是一个雌雄 同株异花的植物，在玉米雌穗和雄穗的发育过程中，需要经过从顶端分生组织( s h o o ta p i c a l m e r i s t e m ，S A M ) 或腋芽分生组织( a x i l l a r ym e r i s t e m ，A M ) 向花序分生组织( i n f l o r e s c e n c e m e r i s t e m ，I M ) 、小穗成对分生组织( s p i k e l e tp a i rm e r i s t e m ，S P M ) 、小穗分生组织( s p i k e l e t m e r i s t e m ，S M ) 、小花分生组织( f l o r e tm e r i s t e m ，F M ) 等一系列的细胞形态和功能转变过 程H 1 ，这样的一个复杂过程由一系列的质量性状基因控制，任何一个基因发生突变均会导致 雌穗或雄穗发育的异常。在玉米雌穗分化形成过程中，小穗成对分生组织小穗分生组织的转 化决定了穗行数的多少，小穗分生组织向小花分生组织的转化则决定了遗传学意义上的行粒 数，并最终决定了玉米单穗结实数的多少，进而直接决定着玉米的产量。 3 在玉米雌穗花序分生组织到小花分生组织的发育过程中，已经发现了一些影响不同发育 步骤的突变体，如F a s c i a t e de a r 2 ( 1 e a 2 ) 影响着腋芽分生组织或顶端分生组织向花序分 生组织的转换，小穗分生组织和小花分生组织簇生，雌穗表现出短粗扁平，籽粒行数不规则 的形态特征b S ot d l 基因与l e a 2 基因相似，但是它对雄穗具有显著的效应，其雌穗同样 表现出籽粒簇生，穗行数不规则的特征睁7 1 。b i f 2 基因影响着花序分生组织向小穗成对分 生组织或分枝组织的转化，产生较少的雌穗花芽、分枝、小穗、小花删。鉴于雌穗和雄穗发 育在玉米产量形成过程中的重要性，许多学者利用一些特殊的突变材料对玉米雌穗的生产发 育过程进行了大量研究，如K e r s t e t t e r 等人H 1 利用E M S 诱变的方法鉴定出K n o t l 基因的突 变体，该突变具有结实性减少、雄穗分枝减少的表型变异特征。K a p l i n s k y 和F r e e l i n g 憎3 分析了i d s l 和r g o l 两个对花芽分生组织的综合控制效应，发现r g o l 基因的突变体是在小 穗成对分化过程中表达，并启动了多行的分化机制，最终导致雌穗行数不规则的形态特征， 该基因位于玉米的第9 染色体上；而i d s l 基因一个是玉米A P 2 基因家族的转座因子，该基 因在小穗成对分化时期和小穗分化时期均有表达，但是只影响小穗的分化0 】该突变的每一个 小穗会产生多于正常两个小花的形态特征，该基因被定位在第l 染色体上。C h u c k 等u 刨报道 了一个i d s l 基因的突变体，当该基因的功能缺失表现出小穗分化的不确定性并且产生多余 的小花。B o r t i r i 等1 利用图位克隆的方法克隆了一个在腋芽细胞分生表达的r a 2 基因，该 突变表现出雄穗分枝变短，分枝数增加，而且雌穗表现出不规则的行数，该基因在禾本科的 水稻、大麦、高梁和玉米中具有明显的共线性关系。此外在玉米雌穗和雄穗形成过程中，b a l 基因导致腋芽分生组织不能正常发育，植株将不能形成雄穗分枝、小穗以及正常雌穗引。此 外t s 4 玉米突变体由于花序分枝组织的重复分化导致具有植株较多的分枝花序【1 引，与t s 4 基因相似，b d l 突变的雄穗具有额外的分枝”引。与上述两种突变相反，r a l 突变导致雄穗主 轴变长，而u b l 突变则表现出雄穗无分枝u 引。 在玉米穗分化相关基因的克隆研究中，F u m i o 等u 刮利用转座子插入的方法发现了屈口 的突变体，并对该基因进行了克隆，发现该基因突变基因编码一个富亮氨酸重复的受体类 似蛋白调控着玉米花芽分裂组织的增值。C h u c k 等n 7 1 利用M u 转座子标签的方法克隆了B D l 基因，该基因编码一个3 1 5 个氨基酸的乙烯相应元素结合因子，该基因有两个突变基因b d l 和b d l b ，被分别定位在第7 和第2 染色体上，b d l 突变体表现出玉米雌穗的不确定性，在 玉米雌穗的地方会形成分枝。C h u c k 等0 l 同样利用M u 转座子插入的方法克隆了一个控制 玉米小穗分化的基因i c l s l ，该基因与拟篮芥控制不定小穗的基因彳P 2 基因功能相似。 B o m m e r t 等阳1 利用转座子插入突变的方法证明了t d l 7 基因编码一个富亮氨酸重复的受体激 酶，与拟篮芥的C L A C A T A l 基因具有同源性。 1 2 转座子标签法克隆基因 通过转座子上的标记基因可检测出突变基因的位置和克隆出突变基因。转座子标 签法就是把转座子作为基因定位的标记和通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆 4 基因 z s - z g 。 1 2 1 转座子的概念 转座子( t r a n s p o s o n ) 又称为转座因子或移动因子，是基因组中一段可以移动的D N A 片段，它可以通过切割、重新整合等一系列过程从染色体的一个位置“跳跃”到另一个位 置，也可以从一个染色体跳到另一个染色体，从而使插入位点的基因功能失活，形成突变 心刚。这一现象最早是在1 9 4 4 年由美国遗传学家M e C l i n t o c k 在研究玉米籽粒颜色时发现了 转座子激活A c ( A c t i v a t i o n ) 和解离元件D s ( D i s s o c i a t i o n ) 晗卜2 3 棚1 ，并命名为转座子。但该 概念直到1 9 6 7 年在大肠杆菌的半乳糖操纵子研究中发现插入序列这类转座因子后才被普 遍承认和接受。1 9 8 4 年S h e p h e r d 幢引等在玉米中又发现了另一类转座子一反转录转座子 ( R e t r o t r a n s p o s o n ) 。大量研究证实了转座子在矮牵牛、金鱼草、飞燕草、甜豌豆等植物以及 一些多细胞绿藻中广泛存在心靴引。目前至少在3 2 种植物上发现有转座因子存在，其中研究 最多的是玉米、金鱼草、拟南芥等。 1 2 2 转座子标签法克隆基因的原理和方法 1 2 2 1 转座子标签法克隆基因的原理 转座子可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的某一个位置“跳跃”到另外 一个位置，因此当转座子跳动而插入到染色体上的某个功能基因内部或临近位点时，就会 引起插入位点基因的失活，诱导突变体的产生比；但当转座子再次跳动离开此位点时，失 活基因的功能又可得到恢复。通过遗传分析可以确定某基因的突变是否是由转座子引起 的。由转座子引起的突变便可以以转座子D N A 作为探针，从突变体的基因组文库中找出 含有该转座子的D N A 片段，并获得含有突变体D N A 序列的克隆，然后以该突变体D N A 为探针，筛选野生型的基因组文库，最后得到完整的目的基因的克隆乜8 。2 9 。另外，转座子 也可以作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物，由于T - D N A 整合到基因组所引起 的插入突变，也可用上述原理来克隆基因，这样就大大提高了分离基因的效率心引。 1 2 2 2 转座子标签法克隆植物基因的方法 转座子标签法分离植物基因的主要步骤是：( 1 ) 构建含转座子的质粒载体；( 2 ) 将含转 座子的质粒载体通过农杆菌介导或其他适当的转化方法导人目标植物中；( 3 ) 转座子插入 突变的鉴定与分离；( 4 ) 转座子在目标植物体内的活动性能检测；( 5 ) 利用转座子序列作 探针，与突变体基因组文库杂交，获得部分基囚序列；( 6 ) 用部分基因序列作探针，与野 生型基因组文库杂交，分离出完整的目的基因。 1 2 3 月c D s 、S p r n d s p m 转座子 A d D s 、S p m d s p m 转座子根据其结构可分为自主转座子( A c 或S p m ) 和非自主转座子( D s 或d s p m ) ，自主转座子自身编码一种转位酶可促使其发生转位作用，非自主转座子不编码 转位酶，不具备自我转座能力，但在细胞内存在有转位酶的条件下，仍可以发生转位作用。 所以，A c D s 系统和S p m d s p m 系统可以只用自主转座因子( A c 或S p i n ) ，也可以把非自主转 5 座因子( D s 或d s p m ) 和从自主因子改造而来的转座酶基因一起使用，这样便有自主转座 因子标签法和双因子标签法两种应用形式口。 1 ) 自主转座因子标签法 此法只需一个自主转座因子，如A c 或S p i n ，它们在异源植物中都表现转座。将自主转 座因子转化异源植物后，在转基因当代或自交一代筛选转座基因型。从自交一代开始，在 后代群体中筛选转座因子插人引起的表型突变。到目前为止，已通过A c 因子标签分离到 突变基因。C h u c k 等口引把A c ：S P T ( A c 被克隆在3 5 S 启动子和链霉素抗性基因S P T 的 编码区之间) 转化矮牵牛，大量筛选发生A c 解离的植株。W h i t h a m 等口3 1 从A c ：N P T I I 的转基因烟草后代中分离出烟草花叶病毒病( 1 v ) 抗性基因。 2 ) 双转座因子标签法 用自主转座因子基固标签时，插入在突变基因内的转座因子再解离或转座，造成变异 的不稳定，于是设计出了双转座因子系统阳h3 4 - 3 7 o 该方法是将自主和非自主两个因子同时 导人受体植物，其中非自主转座因( D s 或d s p m ) 因为转座酶编码区有缺陷，不能产生转 座酶，没有自主转座能力，但另一末端有缺失，不能转座的因子带有正常转座酶基因，能 产生转座酶，使非主转座因子激活和转座。当产生转座酶的因子( A c 或S p i n ) 和非自主因 子( O s 或d s p m ) 在后代中分离后可获得非自主因子稳定插入的突变体。J o n e s 等“训用A c i D s 双转座子系统分离到番茄抗叶霉病基c f - 9 。A a r t s 等旧4 】用S p m d s p m 顺式双因子系统( i n c i st w o e l e m e n t t r a n s p o s o ns y s t e m ) 成功地分离到拟南芥雄性不育基因M s 2 。 1 2 4 批转座子 1 2 4 1 批转座子的发现及类型 1 9 5 2 年，W i s c o n s i n 大学的D rB r i n k 在含有插入以c 因子的玉米穗轴和果皮鞣红色基 因的种质中发现了1 个回复的突变体，预计通过7 次回交将其导入自交系W 2 3 的背景中。 在第6 次回交后检测以c 活性时，没有发现A c 因子存在，但在其中1 个自交果穗上有籽粒 异常的突变体。B r i n k s 将该果穗送给同事K e r m i c l e 做进一步研究。1 9 6 1 年，K e r m i c l e 在 该果穗的又1 个自交子代中发现了淡黄色胚乳突变体，于是将其寄给正在研究类胡萝卜素 突变体的b w a 州立大学的D rR o b e r t s o n 。R o b e r t s o n 将其命名为y 9 ，并在它的自交后代中 观察到频率高且不连锁的突变体m 1 。于是R o b e r t s o n 将该性状定义为M u t a t o r ( 简称为朋。 在鉴定的籽粒和幼苗突变体中，大约有1 3 突变体表现出不稳定性，主要是体细胞的回复 突变。鉴于玉米中已知的A c D s 和S p m d s p m 转座因子，预示着讹也可能具有转座的特性。 在1 9 7 8 年他首次报道了玉米M u 转座因子汹帅1 。1 9 7 9 年，D rP e t e r s o n 等在富含转座子的 玉米种质中发现了l 份命名为勿的因子。勿因子能够转座到b z l 基因内形成b z l - r c y ， 但勿因子自身与6 Z 基因并不连锁。后续研究表明 因子的活性与舰活性相关，并且证 实b z - r c y 里含有讹因子的插入片段m 4 2 1 。1 9 8 1 年，R o b e r t s o n 等又研究发现，批的诱变 能力比已知的A c D s 等玉米转座因子的诱变能力高出至少2 0 倍。在有肌活性的玉米品系 6 中，胁拷贝数很高( 1 0 到1 0 0 拷贝基因组) H 引。 F r e e l i n g 等H 4 1 用肋种质分离出了玉米乙醇脱氢酶1 ( A d h l ) 基因的突变体。将突变体 D N A 序列与相应野生型作对比，在A d h l 的第一个内含子区内有1 个1 1 4 k b 的插入片段。对 该插入片段进行克隆和测序发现其含有约2 0 0 b p 的末端反向重复，9 b p 的A d h l 靶位点正向 重复，将其命名为舰j 暗引。随后还检测出一些其他与胁末端反向重复同源的序列，这些序 列也可能是讹转座子家族中的成员。所有讹插入片段都具有约2 2 0 b p 的末端反向重复， 在插入位点处往往产9 b p 靶D N A 侧翼序列，但每个肌插入片段的内部序列差异很大。 B e n n e t z e n 根据抛内部序列的特异性将M u 插入片段分为6 个亚族，即g u l M u 2 、g u 3 、M u 4 、 Y u 6 M u 7 、讹8 、删M u 5 H3 1 。同时，为了纪念R o b e r t s o n 在肌转座因子研究方面的贡献， 将原来分别命名为M u A 2 H 引、g u R l 1 、M u 9 H 7 1 和删的自主胁因子统一命名为M u D R 。 1 2 4 2M u 的插入突变的特点 由于发育晚期的胁活性较高，在体细胞中，活性讹因子通过“剪切粘贴”或“只 剪切”的转座方式产生分离；在前减数分裂细胞和配子中，活性讹因子通过复制”式 转座产生插入。砌因子只在组织发育末期的细胞分裂过程中有活性，受转录后水平的调控， 很少有生殖细胞的回复突变型引，可以改变转座结果是肋因子的独特属性。所有被证实 的由胁转座因子插入引起的突变都是在细胞核基因组内，其中绝大多数为隐性突变，很 小一部分是显性突变，大多数舰因子插入后导致基因失活或引发染色体重排| 4 引。 在绝大多数的讹种质中，检测到的正向突变的频率约为1 0 。3 - 1 0 。5 争训。M u 因子的活 性会受到作物不同遗传背景的影响，在不同品系的不同位点间存在相当大的差异，即使在 同一个讹种质中，不同基因的突变频率差别可高达8 倍【5 。批种质中大量的突变体序列 分析表明大多数含有M u U M u 2 因子( 其中以M u l 居多) ，肌的拷贝数普遍高于其他胁因子 类型，这可能与M u l 插入位点的偏好和高转座频率有关哺引。其他胁因子也各自有一定的 插入序列偏好，例如g u 8 因子插入到玉米K n l 基因中较多，且易产生显性突变旧引。C r e s s 分析了1 9 个随机选取的M u l M u 2 插入位点，表明了不同讹因子亚族可能有不同的插入位 置序列的偏好怕引。 1 2 4 3 批因子的应用 插入到功能基因内部或其附近的因子都具有破坏基因功能并产生突变的潜力m 3 。胁 转座因子具有突变频率高、插入专一性低、自身在基囚组的拷贝数多等特点，使它可以在 相对少的群体内产生覆盖全基因组的大量突变瞄引。且讹因子具有相对保守的末端反向重 复序列，可以用来设计P C R 引物，提高检测插入突变的效率。所以，肋因子非常适合用于 构建玉米突变体库和分离突变体H 0 1 。用舰因子进行插入突变通常采用两种方法。 1 ) 定向插入突变，将讹活性品系与纯合候选基因材料进行杂交，直接对其F 1 进行 检测，鉴别出表现与隐性对照相似且非致死的表型个体。或者将其F 1 自交，产生含胁因 子且在对照位点上纯合的材料，再筛选该材料与野生型的杂交后代，挑取稀有的野生型个 7 体即可能是无效型或亚效型表型的插入突变体m 。 2 ) 随机插入突变，用活性胁品系与测验材料杂交、监测胁活性，将F 1 自交产生F 2 家系，这些F 2 家系中将会出现候选基因内的相应插入突变表型分离嘲1 。在随机插入突变 体中，从F 2 群体里可检测到果穗上的种子突变表型，也可通过沙盆检测幼苗期突变表型 或在大田检测成株期突变性状。讹因子转座常发生在植株发育晚期，从而很容易通过讹 花粉与受体雌蕊杂交得到大规模的随机插入突变群体H 训。 目前，国际上有6 个运用玉米胁转座因子进行插入突变的研究晦7 1 ，希望在相对少的 植株群体中得到尽可能多的舶插入突变体。这六个研究小组分别是：( 1 ) 先锋种子公司在 1 9 9 5 年发起的玉米性状利用系统项目( T r a i tU t i l i t yS y s t e mF o rC o r n ，T U S C ) 。这是第 一个将具有诱变特性的舰转座因子应用于大规模反向遗传学研究的项目。在4 2 0 0 0 株的 群体中，依靠P C R 技术鉴别出了几百个讹插入在玉米基因内的突变体。( 2 ) 冷泉港实验室 M a r t i e n s s e n 等通过N S F 资助的植物基因组计划公开征集了4 0 0 0 0 个含讹因子的玉米家 系，展开肋转座因子材料的收集和筛选，建立了玉米定向诱变数据库( M a i z eT a r g e t e d M u t a g e n e s i sd a t a b a s e ，M T M d B ) 嘲1 ，使用微列阵技术鉴别已测序的基因和E S T s 中舰因子 的插入状况，提高了筛选候选基因的效率。( 3 ) 英国的E d w a r d s 等改进了分析玉米基因中 舶转座因子插入的M u - A F L P 检测方法| 5 引，运用基于分子杂交技术的舰微列阵M u I D 技术 来鉴定讹因子在表达基因内的插入。( 4 ) 斯坦福大学的W a l b o t 将基因工程化的R e s c u eM u 导入玉米品系后，与舰活性品系杂交，诱发讹因子在玉米基因组中转座，建立了R e s c u e M u 序列数据库旧1 。( 5 ) 在N S F 资助下，俄勒冈大学B a r k a n 启动了光合作用突变体筛选研究， 用于鉴别胁因子诱导的调控非光合作用的表型突变体，在近1 7 0 0 个讹因子品系中发现 有淡绿、淡黄、条斑、叶绿素高荧光叶片突变表型的分离。( 6 ) 佛罗里达大学的M c C a r t y 在N S F 资助下用含有讹因子的W 2 2 回交群体( u n i f o r mM u ) 鉴定与胚乳发育有关的突变 体，采用D N A 微列阵方法筛选出2 0 0 0 多个品系表现出籽粒突变表型分离。改进了分析玉 米中高拷贝插入位点的M u T a iI - P C R 检测方法哺，从3 1 5 4 8 个F 家系中选择到的2 0 0 0 多个 独立的籽粒突变和3 4 2 5 5 个M uT a i l 序列的公共数据库哺引，并鉴定出与胎生位点插入突变 相关的M u T a i l 侧翼序列m 制。 我国在引进国际先进农业科学技术计划( 9 4 8 计划) 项目资助下，从美国引进具有高频 转座活性的舰因子玉米种质1 0 余份，并用它们作为供体分别与我国多个优良玉米自交系 进行杂交，构建玉米肋因子插入突变体库，观察到了一些玉米叶片、籽粒等突变表型，通 过M u T a i l - P C R 方法检测到了一些讹因子插入的侧翼序列。目前在玉米基因组中已经发 现了2 1 8 1 9 多个玉米不同发育阶段及产量相关性状的肌转座子突变体 ( W w w m a i z e g d b o r g ) 。7 1 2 4 4 利用批转座子克隆基因 转座子标签技术是通过筛选由基因内插入转座因子而产生的表型突变植株，通过分子 8 生物技术获得包含有转座子的突变基因，再利用突变基因的部分序列制备探针，用分子杂 交技术，从基因组文库中筛选出该基因的剩余序列，得到该基因的全长序列。得到基因的 全长序列后，一方面对序列进行生物信息学分析，获取基因的结构和理论的生物学功能； 另一方面对序列进行载体构建、遗传转化，确定该基因的实际生物学功能。 当某个基因被舰转座因子插入引起表型突变以后，就可以利用讹因子的序列或舰 因子插入位点的侧翼序列将该基因分离、克隆出来，再通过生物信息学分析和遗传转化等 方法确定该基因的生物学功能。现已通过胁转座子标签法成功地分离、克隆了与玉米生 长发育、淀粉合成、氨基酸含量、细胞质雄性不育恢复、光合作用、信号传导、细胞死亡 等相关的近4 0 个基因：利用M u l 分离、克隆出了乙醇脱氢酶1 A d h l 1 ，紫色素合成相关基 因B r o n z e 2 7 1 ，转录因子、调控脱落酸响应基因V i v i p a r o u s l 哺引，胚乳中直链淀粉a 衄y l o s e e x t e n d e r l 舯1 ，影响籽粒中淀粉的组成的基因S u g a r y l 盯射，合成表皮分化受体激酶 c r i n k l y 4 盯6 1 ，使产生条斑植株的基因i o j a p 盯7 。，影响幼苗叶片表面角质蜡沉积的基因 G l o s s y l m 3 ，调节A B A 生物合成的基因V i v i p a r o u s l 4 阳，妨碍籽粒正常发育的基因 d i s o l o r e d l 隋2 1 ，编码新的淀粉合成酶d u l l l ，控制在叶片上产生坏死性斑点的基因 L e s 2 2 m4 | ，影响细胞形状和同一性的基因G n a r l e y l 阳8 1 ，空间调控细胞质分裂的基因 T a n g l e d l m ，玉米编码双氢槲皮素还原酶a j 旧5 1 ，热激响应负调节子、负责玉米胚胎发生的 基因e m p t yp e r i c a r p 2 1 ，恢复基因R f 2 、其c D N A 为乙醛脱氢酶基因月L 删，玉米M A D S 一 盒亚族基因A G 2 0 2 1 ，引起籽粒和幼苗异常的基因E t c h e d l n 0 3 1 ，与钼辅因子的生物合成相关 的基因V i v i p a r o u s l O PV i v i p a r o u s l 3 n 0 5 1 ，编码固蝶呤合成酶的小亚基的基因 V i v i p a r o u s l1 0 6 1 ；利用M u 2 分离、克隆出了合成内贝壳杉烯基因A n t h e re a r l n 引；利用g u 3 分离、克隆出了在胚乳和叶片中产生B 一胡萝卜素的基因力汹1 、利用M u 6 分离、克隆出了 引起鞘组织增生相关基因r o u g hs h e a t h l m l ；利用M u 8 分离、克隆出了参与赤霉素生物合 成的基因d w a r f 3 盯引，抑制细胞死亡基因L e t h a li e a rs p o t l 1 ，调节叶片萌动的基因 t e r m i n a le a r 跖3 ，累积基因B u n d l es h e a t hd e f e c t i v e 2 1 ，调节分生组织大小的基因 f a s c i a t e de a r 2 陋1 ；利用肌分离、克隆出了影响器官确定性基因z a g l 阿引，改变叶片细胞 命运的基因l i g u l e s s 3 引，决定淀粉结构的基因S t a r c h b r a n c h i n ge n z y m e s - 2 a 阳3 | ，决定 淀粉结构的基因S t a r c h - b r a n c h i n ge n z y m e s J 嘲1 ，调节信号传导和细胞形态发生的基因 t o p 2 n0 0 1 ，决定糊粉层细胞数量的基因s u p e r n u m e r a r ya l e u r o n el a y e r s l n0 1 1 ，与赖氨酸合 成相关的基因O p a q u e 2 1 # 1 川；利用M u D R 分离、克隆出了影响幼苗叶片表面角质蜡沉积的 基因g l o s s y 9 7 1 ；利用M u l 、肌伽分离、克隆出了叶绿体膜生物发生基因H c f l 0 6 4 | ，叶绿 体合成基因C r p l 哺 ，引起鞘组织增生的基因r o u g hs h e a t h 2 啪1 ；利用抛、肘u 朋分离、克 隆出了影响花中器官的特性的基因S i l k y l 旧。 胁因子是目前为止发现的转座活性最高、诱变能力最强的植物转座因子，虽然对于其 9 转座的调控何机理研究的还不是很透彻，但肋转座因子插入突变已经成为诱导玉米产生基 因突变和分离、克隆玉米基因的主要方法。如果能够获得可以转化的活性讹因子，舶因子 将会成为其他异源物种基因诱变和基因分离的有利工具。 1 3A F L P 的标记 A F L P ( A m p l i t l e dF r a g m e