玉米温敏自交不亲和系HE97花丝与花粉的差异蛋白组分析-硕士论文

论文提交 日 学位授予 日 川Irr l lIl l l tl tl l ft l lI I l l I Y 17 2 8 5 61 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 玉米温敏自交个亲和系H E 9 7 花丝与花粉学位 硕士 文题目 的差异蛋白组分析级别 学生 付忠军 学科导师 姓名专业 作物遗传育种汤继华教授 姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我- r 司- r 作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：谢密耳蚴牛导师签名：蚴纤 日期。力l o 年6 月I 砂日日期泐每彳石月，；日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 研究生签谁早翩躲蚴院领导鹳：f 晕式7 日期沙矽年6 月f 明日期：J p 年p6 月妇日期：蟛年石月阳 致谢 本文是在导师汤继华教授的悉心指导下完成的。论文从选题、实验设计、实 施和论文写作等都凝聚着导师的大量心血和汗水。导师渊博的知识、宽阔的思路、 严谨求实的治学态度和兢兢业业的工作精神使我受益匪浅。导师宽厚豁达，乐观 积极、平易近人及忘我的工作态度是我今后学习、工作、生活以及做人的学习楷 模。恩师在学业上的谆谆教诲和在生活上无微不至的关怀，使我终生难忘，在此 谨向恩师致以最诚挚的感谢! 在学习和生活中得到了课题组刘宗华教授和胡彦民教授的热心指导和帮助， 在此表示深深的谢意，感谢陈彦惠教授、吴建宇教授、李玉玲教授、席章营教授、 崔党群教授在学科上的教导，感谢付志远老师和丁冬老师的关心和指导! 同时感 谢生命科学院王伟教授和G E 公司韩佩伟工程师在实验中给予的认真细致的指 导! 感谢省农科院王振华研究员对论文的修改，并提出了非常宝贵的意见。 特别感谢小麦育种研究室全体老师和同学们在试验中提供的友情帮助! 衷心感谢河南省农科院陈占宽老师和郑州大学杨艳坤老师的亲切指导! 感谢同窗王长城、崔子田、白杨、李海霞、杜光玲在实验过程中对我的帮助， 感谢师姐林兴娥、孙玲玲、段柳静，师兄冯晓曦、王艳朋、朱自贤、李永亮等在 实验上和生活中对我的各种关心和指导。感谢师弟邵帅、宋桂良、严程辉、张战 辉、王永学、宋鹏举、袁亮、韩明水，师妹进西宁、吴向远、刘慧等的热心帮助， 论文中的每一个数据都是我们大家共同的心血和汗水的结晶。 感谢2 0 0 7 级作物遗传育种专业研究生一班的同学们三年来对我学习、生活 和工作的支持和帮助。感谢宿舍的兄弟们，他们伴我度过了愉快的三年生活，祝 他们一切顺利! 最后，深深感谢我的家人多年来在学习和生活上给我的理解和支持。亲人们 的爱是我坚强的后盾和力量源泉，使我能顺利的完成学业! 再次衷心感谢曾经给予我关心、支持和帮助的所有人们! 付忠军 2 0 1 0 年6 月 目录 中文摘要一l 1 文献综述2 1 1 植物自交不亲和性及其类型2 1 2 孢子体自交不亲和研究进展2 1 2 1 孢子体自交不亲和表现2 1 2 2 孢子体自交不亲和发生机制2 1 3 配子体自交不亲和研究进展3 1 3 1 以S - R N a s e 为基础的S I 信号转导途径3 1 3 1 1S I 信号分子一S R N a s e 3 1 3 。1 2 信号分子的接受体花粉S 蛋白4 1 3 1 3 以S - R N a s e 为基础的细胞信号转导途径4 1 3 2 罂粟科s I 信号转导的研究进展5 1 4 禾本科自交不亲和性机理6 1 5 蛋白质组学的研究进展6 1 2 1 蛋白质组学分析技术6 1 2 1 1 双向电泳：6 1 2 1 2 图像分析7 1 2 1 3 质谱分析7 1 2 2 蛋白质组学在植物研究中的应用8 1 2 2 1 逆境胁迫下植物蛋白质组学研究一8 1 2 2 2 突变体的蛋白质组学研究8 1 2 2 3 植物亚细胞蛋白质组学9 2 引言1 0 3 材料与方法l2 3 1 材料1 2 3 2 试剂一1 2 3 3 仪器12 3 4 蛋白质组分析方法1 2 3 4 1 试验材料的种植、取样与鉴定1 2 3 4 2 蛋白质的提取1 2 3 4 2 1 三氯乙酸丙酮法( T C A a c e t o n ee x t r a c t i o n ) ：。1 2 3 4 2 2 酚提取法( p h e n o le x t r a c t i o n ) 1 2 3 4 2 3 改良的酚提取法1 3 3 4 3 蛋白质的溶解1 3 3 4 4 蛋白质样品浓度测定1 3 3 4 。5 第一向等电聚焦电泳条件的优化1 4 3 4 6 第二向S D S P A G E 电泳1 5 3 4 7 凝胶染色1 5 3 4 8 凝胶图像分析、蛋白质点的胶内酶解和串联质谱分析1 6 3 5 分子生物学类实验方法16 3 5 1 基因组D N A 的提取1 6 3 5 2P _ 和s 7 基因D N A 序列的克隆1 8 3 5 2 1 引物。l8 3 5 2 2 反应体系18 3 5 2 3 扩增产物的电泳纯化19 3 5 2 4D N A 片段的克隆2 0 3 5 2 5P C R 检测阳性克隆2 2 3 5 2 6P C R 产物的测序2 2 3 5 3 拟南芥转基因功能验证2 2 3 5 3 1 植物材料与种植方法2 2 3 5 3 2 引物设计2 2 3 5 3 3 基因序列的扩增2 3 3 5 3 4 表达载体构建2 4 3 5 3 5 农杆菌感受态细胞的制备2 4 3 5 3 6P C R 验证及菌种保存2 5 3 5 3 7 拟南芥转化2 5 3 5 3 8 转基因拟南芥的筛选鉴定2 6 g 结果与分析2 7 4 1 自交不亲和与亲和阶段的田间表现2 7 4 2 三种方法提取的蛋白质样品双向电泳效果比较2 7 4 3 不同聚焦时间对双向电泳图谱的影响2 9 4 4 不同丙烯酰胺浓度对蛋白质分辨率的影响3 0 4 5 不同上样量对蛋白质分辨率的影响3 0 4 6 蛋白质表达分析3 1 4 7 差异蛋白点的质谱鉴定3 3 4 8 p l 及s 7 基因D N A 序列的克隆3 8 4 9 拟南芥转基因功能验证试验3 9 4 9 1 植物表达载体P B I P 1 及P B I S 7 的构建3 9 4 9 2 重组质粒P B I P I 及P B I S 7 转化农杆菌4 1 4 9 3 转基因拟南芥的筛选4 2 5 讨论4 3 5 1 如何获得高重现性的双向电泳图谱4 3 5 2 差异蛋白质的功能4 3 5 3 关于自交不亲和相关基因P J 及S 7 。4 4 5 4 进一步的研究设想4 4 参考文献：4 5 附录1 5 4 附录2 5 6 附录3 5 8 A b s t r a c t 6 1 l 捅要 自交不亲和性在研究细胞信号传导和杂种优势利用中有重要意义，是植物分子生物学和 遗传育种的一个热点领域，目前这一现象的分子机制知之甚少，研究主要集中在自交不亲和 基因的精细定位和图位克隆方面。H E 9 7 是一种玉米温敏自交不亲和材料，它在不同温度生 态条件下存在亲和性的转换。前期研究证明H E 9 7 亲和性转换的敏感时期是雄穗小花分化期 ( 雌穗生长锥伸长期) ，主要受日最低温度的影响，其亲和性转换的温度区间为2 0 2 4 C 。 当最低温度低于2 0 。C 时表现不亲和，最高温度高于2 4 时表现亲和。 本研究在前期研究的基础上，于2 0 0 8 年4 月1 9 日至2 0 0 8 年6 月1 0 日，在河南农业 大学科教园区对H E 9 7 进行分期播种，每期材料雄穗散粉和雌穗花丝抽出3 - 4 厘米后取样自 交，选择亲和与不亲和的两期材料分别提取花粉和花粉总蛋白，利用蛋白质双向电泳和质谱 技术分析鉴定亲和性转换前后花丝与花粉差异表达蛋白质。本研究的主要结果如下： 1 不同播种期内H E 9 7 的雄穗均能正常散粉，雌穗均能正常吐丝，但不同时期H E 9 7 自 交果穗的结实性却存在显著的差异。该结果与前人观察结果一致。 2 以花丝为材料，比较了三种不同蛋白质提取方法三氯乙酸丙酮法、酚提取法和改良 的酚提取法对双向电泳结果的影响，并在蛋白质上样量、等电聚焦条件及S D S P A G E 凝胶 浓度等方面进行了探索与优化。结果表明，与酚提取法及改良的酚提取法相比，采用三氯乙 酸丙酮提取法提取蛋白质操作简便，所得的双向电泳图谱蛋白质点数较多，图谱背景也比 较清晰。 3 利用蛋白质双向电泳技术对玉米温敏自交不亲和系H E 9 7 花丝与花粉不同亲和条件下 进行了蛋白图谱分析。结果表明，大部分蛋白质集中分布在p H4 7 区域内，花粉中发现 有3 4 0 个蛋白质点，花丝中6 7 0 个蛋白质点。有9 个蛋白质点在不同亲和阶段表现差异，其 中P 2 蛋白点是仅在不亲和花粉中表达，P l 蛋白质点在不亲和花粉中下调表达；S 1 、S 2 、S 7 蛋白点仅在不亲和花丝中表达，s 4 、S 5 蛋白点仅在亲和花丝中表达，S 6 蛋白点在不亲和花 丝中上调表达，S 3 蛋白点在亲和花丝中上调表达。 4 利用二级质谱( L C E S I M S M S ) 和蛋白数据库分析鉴定差异蛋白，对9 个差异表 达蛋白点进行鉴定，共得到7 个不同的蛋白序列，其中2 个与信号传导有关。 5 克隆了P l 和s 7 两个自交不亲和相关基因，其中候选基因P l 与自交不亲和植物麝香 百合名为L I A N K 的全长c D N A 序列相似性很高，L 1 A N K 的短暂沉默或过度表达与花粉萌发 或花粉管生长密切相关；基因s 7 推测的蛋白在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。 关键词：玉米；温敏自交不亲和；花丝与花粉；蛋白质组；分析 河南农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 1 文献综述 1 1 植物自交不亲和性及其类型 自交不亲和性是植物界的一种普遍现象，常见于雌雄同株的植物，是植物长期进化过程 中形成的有利于异花授粉的一种重要遗传机制“q 1 。由于自交不亲和可以有效的防止致死基 因的积累和自身退化，并能使植物表现一定的杂种优势，对植物进化和物种自身繁殖具有积 极的促进作用；同时它又是植物生殖生物学研究的一种理想材料，而且在作物的杂种优势利 用方面具有重要作用，是植物生殖生物学和作物遗传育种学研究的一个重要内容。 植物自交不亲和性主要有以下几种情况：1 ) 花粉落在柱头上不能正常萌发，如甘蓝、 萝卜、天竺葵、黑麦等；2 ) 花粉萌发后，花粉管不能穿过柱头，如白菜等；3 ) 花粉管穿过 柱头，不能在花柱中继续延伸而达到胚囊，如烟草、矮牵牛等；4 ) 花粉到达胚囊后，精细 胞与卵细胞不能结合，如甜菜等。根据S I 花粉表型的遗传方式可以将其分为配子体s I 和孢子 体S I 两种类型，其中配子体s I 的亲和性由其本身单倍体基因型决定的，如茄科、玄参科、蔷 薇科、罂粟科和禾本科等；而孢子体s I 的亲和性则是由植株的孢子体基因型决定的，如十字 花科、菊科和旋花科等。 1 2 孢子体自交不亲和研究进展 1 2 1 孢子体自交不亲和表现 孢子体自交不亲和主要存在于白菜、甘蓝、萝卜等2 0 多科植物中，其不亲和性是由一个 单基因座( s 一基因座) 的一系列复等位基因( 即s 单元型) 决定的【4 1 。成熟花粉粒由外壁、内壁 和原生质体组成，虽然成熟的花粉粒本身是配子体，但绒毡层分泌的外壁蛋白却具有孢予体 的特性，是产生花粉的雄蕊的两个s 单元型的共同表达产物。花粉落在柱头上后通过花粉外 壁蛋白与柱头乳突细胞表面蛋白之间的相互作用，即花粉的两个s 单元型与柱头乳突细胞的 两个s 单元型之间相互“识别”与“选择”，从而决定亲和与否。当产生花粉和柱头乳突细 胞的s 单元型完全不同时，受精亲和；当有相同的S 单元型时，就会发生不亲和现象【5 1 。 1 2 2 孢子体自交不亲和发生机制 孢子体自交不亲和植物的S 一基因座应至少包括两个多态基因：一个编码雄s 决定子，主 要表达于花粉中；另一个编码雌s 决定子，主要表达于雌蕊柱头中。信号分子S C R ( S 1 0 c u s c y s t e i n e - r i c hp r o t e i n ) 的配体是由花粉粒产生的，被柱头乳突细胞S R K ( S r e c e p t o rk i n a s e ) 受体 识别后，进行细胞内信号转导| 6 1 。配体是位于花粉粒表面的一个小的胞被蛋l 刍( p o l l e nc o a t ) ， 由S C R S P lI ( S 1 0 c u sp r o t e i n1 1 ) 基因编码旧引；受体由S R K 基因编码，是一个具有丝氨酸苏氨 酸激酶活性的受体，位于柱头表面乳突细胞的原生质膜上旧 1 。花粉中的配体与柱头乳突细 胞内受体特异性的相互作用引起了柱头乳突细胞S I 信号转导，最终导致白交不亲和反应n 2 1 。 芸苔属( B r a s s i c a ) 植物的柱头乳突细胞中有一种称为s 基因座特异糖蛋白( S 1 0 c u ss p e c i f i c g l y c o p r o t e i n ，S L G ) ，与已知的S 等位基因在遗传上连锁，它们在成熟柱头乳突细胞的细胞壁 上大量积累，其表达时间与植物表达自交不亲和性的时间相关，并且在某些自交亲和突变体 2 河南农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 中，S L G 的表达水平降低，说日Y J S L G 主动参与了自交不亲和反应n 3 叫6 1 。S t e i n 等人又从甘蓝中 分离到了第三类与S L G 类似且在柱头乳突细胞中特异表达的基因，被称为s 受体激酶( s r e c e p t o rk i n a s e ，S R K ) 基因n 引，是植物中类受体蛋白激酶的一种n 引，S R K 基因在遗传上与S 基因 座紧密连锁，因此可能参与自交不亲和反应。S R K 基因编码的蛋白质具有一个胞外S 结构域( S d o m a i n ) ，一个跨膜结构域和一个具有丝氨酸苏氨酸激酶活性的胞内域n 引。 芜菁和甘蓝的自交亲和变异植株的实验分析表明，他们表达正常水平的S L G ，但缺乏 S R K 的转录产物瞳刨；向芜著中转入S R K 2 8 或S L G 2 8 发现，只转入S R K 2 8 便可使转基因植株拒 绝$ 2 8 的花粉，而转入S L G 2 8 却不具备这一功能，只是促进S I 反应的进行n0 。从上述这些结 果得出，S R K 是雌蕊的特异性决定因子，S L G 没有此功能，但它可能促进S I 反应，有利于S R K 的成熟和它在柱头表皮中积累到相对生理水平犯。 S c h o p f e r 等在对在芸苔属植物甘蓝( B r a s s c i ao l e r a c e a ) S 位点的遗传重组分析中发现了花 粉s 基因，位于S L G 和S R K 之间的1 3 k b 区域，一种编码小分子富含半胱氨酸蛋白的基因并将 其命名为S C R ( S l o u c s c y s t e m r i c h p r o t e i nS C R ) 。在另一芸苔属植物白菜型油菜( B r a s s c i a c a m p g y t r i s ) 中也发现了花粉S 一基I 天I s P l l ，与S C R 基因等位。原位杂交显示，S C R S P l1 在花药 的毡绒层细胞中表达，这种表达方式正好解释了孢子体型自交不亲和反应的信号传导的遗传 基础。获得性功能实验表明S C R S P i l 是雄性决定成分，S C R S P I I 基因的缺失导致自交亲和系 花粉的自交不亲和功能的缺失幢2 引。 花粉胞携带的一种可扩散的信号分子S C R ，作为位于柱头乳突细胞原生质膜上的S R K 蛋 白的配体而起作用。自交授粉后，经过花粉胞被蛋白形成的附着区转运到柱头表面；由于柱 头乳突细胞壁允许分子量小于6 0 k D a 的分子扩散，这样S C R 就可以通过柱头乳突细胞壁，与 S R K 胞外域相互作用，引起细胞内信号级联，并最终抑制自我花粉的发育。 1 3 配子体自交不亲和研究进展 配子体白交不亲和最早在烟草属植物中发现，研究表明该机制主要是位于s 位点的花柱 s 基因和花粉s 基因相互作用，并最终导致花柱S 基因产物S R N a s e 降解自身花粉管R N A ，使 自体花粉管停止伸长而不能完成受精他卜2 4 1 。目前在茄科( S o l a n a c e a e ) 、罂粟科( P a p a v e r a c e a e ) 、 蔷薇科( R o s a c e a e ) 、玄参科( S c r o p h u I a r i a c e a e ) 、禾本科( P o a c e a e ) 等研究较为深入。 配子体S I 信号转导主要有途径两种：一种途径是茄科、玄参科、蔷薇科中以S R N a s e 为 基础的信号转导担5 删；另一种途径是罂粟科、禾本科中以花粉管胞质自由c a 2 + 为第二信使 的信号转导眨7 。2 引。 1 3 1 以S R N a s e 为基础的S I 信号转导途径 1 3 1 1S I 信号分子一S R N a s e A n d e r s o n 等人研究证实S R N a s e 是一个大约3 0 K D 的碱性糖蛋白，主要分布在柱头和花柱 引导组织中，利用这些糖蛋白N 端序列同源的寡核苷酸做探针从烟草中( N i c o t i n aa l a t a ) 中 分离到与G S I 相关的花柱糖蛋白口，对这些s 糖蛋白功能进行的研究发现它与真菌R N a s e T 2 河南农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 。列的催化活性位点具有高度的序列相似性口3 1 ，因此认为s 糖蛋白具有核酸酶活性，故而命名 为S R n a s e m l ，多种配子体型植物中均分离得到了s 核酸酶口5 确1 。 花柱S R N a s e 在自交不亲和中起重要作用1 ，L e e 等m 1 利用反义S 3 R N a s e 基因得到的转 基因植株不能排斥S 3 花粉，而在S l ，S 2 植株中转入S 3 R n a s e 却能够排斥S 3 花粉。M u r f e t t 等1 将烟草的S A 2 R N a s e 转到自交亲和的杂交种中，结果在转基因植物中产生了排斥S A 2 花粉的 能力，这些结果说明S R N a s e 是雌蕊中s I 的决定因子，能够以S 等位基因特异性的形式抑制相 同基因型花粉管的生长。 不同S 一单倍型核酸酶有着高度的多态性，其氨基酸一致程度在3 8 9 8 之间。序列比 对分析结果表明茄科植物S R N a s e 有C 1 一C 55 个高度保守区域n q3 2 1 ，在保守区域上有7 1 0 个 半胱氨酸残基，形成的二硫键可能与蛋白质三级结构的稳定性有关，在保守区域外存在两个 高变区H V a 和H V b ，它们决定了s 等位基因的特异性H 。 1 3 1 2 信号分子的接受体花粉S 蛋白 S R N a s e 的功能缺失或获得性突变只能改变花柱而非花粉的自交不亲和表型。在花粉中 还有一个单倍型特异的花粉s 基因( S p ) m 1 。L a i 等发现了编码一个带有F b o x 结构域的蛋白 的新基因，并将其命名为A h S L F S 2 ( A n t i r r h i n u mh i s p a n i c u mS 1 0 C U SF - b o xs 2 ) 【4 引，Q i a o 等把 A h S L F s 2 转到自交不亲和的矮牵牛中，发现自交不亲和的矮牵牛转变成亲和的，这就证明 A h S L F S 2 确实是自交不亲和的花粉决定因子H 引。 S L F 通常具有4 0 5 0 个氨基酸并且在N 末端含有一个保守的F - b o x 结构域。Q i a o 等| 4 4 1 通过酵母双杂交、免疫沉淀等实验证实S L F 与花柱决定因子S - R N a s e 可以发生直接的相互作 用。在对矮牵牛花( E i n f l a t a ) S 一位点的3 2 8 k b 的区域进行充分搜索后鉴定到一个多态的编 码F - b o x 蛋白的基因P i S L F ，将P i S L F 的S 2 单倍型等位基因( P i S L F 2 ) 分别转入多个s 一单倍 型( 如S I S l ，S 1 S 2 和$ 2 S 3 ) 的P i n f l a t a 植株，这些转基因植株变为自交亲和 4 5 o 此外，U s h i j i m a 等和S o n n e v e l d 等分别研究樱桃和果梅的花粉部分自交亲和突变体时发现，这些花粉S C 突 变体皆因S L F S F B 基因发生缺失或移码突变，导致花粉s I 功能的丧失，也为S L F S F B 基因就是花粉S 基因提供了有力的佐证H 6 。4 7 1 。 1 3 1 3 以S - R N a s e 为基础的细胞信号转导途径 该途径的发生主要是由于S R N a s e 降解花粉管内的R N A ，进而不能合成花粉管生长所需 蛋白质，导致花粉管生长受到抑制n 争的3 。目前有两种模型解释花粉管R N A 的特异性降解晦0 5 ， 一种是受体模型，认为只有相同基因型S R N a s e 能通过跨膜受体进入花粉管并降解花粉管中 的R N A ，柱头内花粉管周围的S 糖蛋白与花粉的等位基因的专一受体发生特异性反应，选择 性地进入花粉管，降解花粉管的m R N A 和r R N A ，从而抑制其生长。另一种是抑制模型，认 为花粉管不仅吸收相同基因型S R N a s e 而且也吸收不相同基因型S R N a s e ，花粉管S 等位基因 产物位于胞质内，是S R N a s e 的抑制子，它能够抑制除相同基因型S R N a s e 夕b 的所有不相同 基因型S R N a s e 的活性，这样相同基因型S R N a s e 保持了核酸酶的活性，导致s I 反应。L u 等 4 河南农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 利用免疫定位技术发现S R N a s e 在相同基因型和不同基因型花粉管的细胞质内都存在，表明 花粉管摄入S R N a s e 是没有单倍型特异性的，从而否定了受体假说畸引 1 3 2 罂粟科s I 信号转导的研究进展 罂粟科植物S I 反应的生理现象与茄科等花粉管在花柱中受到的抑制现象不同，表现为花 粉管在柱头表面就停止生长。柱头S 蛋白与花粉S 受体特异性结合，引起花粉管内以胞质自 由钙离子为第二信使的信号级联反应，最终导致s I 反应。 有人推测罂粟科植物S I 的信号分子也是S R N a s e ，但是在罂粟( P a p a v e r ) 成熟花柱中 S - R N a s e 的活性水平要比烟草( N i c o t i a n aa la m ) 花柱中的s R N a s e 活性水平少2 0 0 多倍，而且发 现在柱头中无论有没有R N a s e 活性，花粉管都会以S 等位基因特异性结合的方式停止生长晦3 。， 由此可知S R N a s e 不是罂粟科信号转导中的信号分子，目前认为罂粟科S I 的信号分子是一个 从柱头中分离出来的约1 5 k D 的分泌蛋白，它以s 等位基因特异性的方式抑制体外花粉管的生 长，故被命名为柱头s 蛋白懵制。F o o t e 等利用柱头S 蛋白的N 一末端序列信息克隆出了柱头s 蛋白 的基因，并发现这个s 基因的表达与s I 反应一致。柱头S 蛋白具有高度的序列多态性，但其二 级结构高度一致驯。 H e a m 等利用重组的柱头S 蛋白进行了一系列的结合实验，在花粉中鉴定出一个 7 0 1 2 0 K D 的糖蛋白，命名为s 蛋白结合蛋白( S B P ) 瞄6 1 。S B P 位于成熟花粉的原生质膜中， 能够与柱头s 蛋白结合，但并不是以s 等位基因特异性方式结合的，因此认为S B P 可能不是花 粉s 受体，它可能作为一个次级受体以非等位基因特异性的方式与柱头s 蛋白的保守区域结 合，这样会利于柱头s 蛋白与真正的花粉s 受体结合。但J o r d a n 等人认为S B P 可能就是花粉s 受体，它不仅存在一个非等位基因特异性的结合位点，而且可能同时存在一个与柱头s 蛋白 以S 等位基因特异性方式结合的位点，推测它在s I 反应中可能是作为辅助受体，调节雌蕊S 一 蛋白与花粉s 一受体的相互作用哺。 在罂粟科的自交不亲和系统中，柱头s 蛋白是s I 的信号分子( 配体) ，而S B P 可能本身就 是花粉s 受体或者作为一个次级受体与花粉S 受体结合。植株自交授粉后，柱头S 蛋白转运到 花粉管表面与花粉s 受体结合，二者以S 等位基因特异性的结合引起了花粉管内信号级联反 应，最终使花粉管尖端生长受到抑制懈研1 。 在不亲和授粉中发现柱头s 蛋白能够特异性诱导花粉管匹 C a 2 + 水平短暂的增加，表现为 花粉管胫部c a 2 + 内流的增加，同时伴随着花粉管尖端c a 2 + 梯度的消失和花粉管尖端生长受到 快速的抑制嵋引，这个反应在s I 的几秒钟内就被引发了，能够持续几分钟，而亲和或热变性不 亲和柱头S 蛋白的刺激却不会引起花粉管C a 2 + 水平上的变化，因此认为花粉管内自由钙离 子的增加是S I 的特异性反应，把s I 的胞外信号转移成胞内信号哪引。D o d d s 等在培养黑麦自 交不亲和系花柱及柱头的人工培养基中加入蛋白激酶抑制剂或钙拮抗物，发现柱头的不亲和 反应消失，花粉可顺利萌发，表明钙可能通过调节蛋白激酶的活性调控自交不亲和的特异信 号反应。另有报道发现烟草自交不亲和反应是由花粉管中的钙蛋白激酶诱导花柱引导组织细 5 河南农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 胞中的核糖核酸酶磷酸化，从而抑制了不亲和花粉管在花柱引导组织中的生长哺3 1 。 1 4 禾本科自交不亲和性机理 禾本科自交不亲和不同与孢子体自交不亲和及配子体自交不亲和。可以把其看成是一类 特殊的配子体自交不亲和类型。其不亲和性由受两个非连锁的复等位基因位点S 和z 控制， 当花粉s 、Z 等位基因的类型和雌蕊柱头s 、z 等位基因的类型相对应时，禾本科自交不亲和 植物表现出与孢子体自交不亲和相同的现象哺引。 B a u m a n n 等【65 】发现了4 个花粉中特异表达的基因，序列分析显示它们均与蛋白激酶同源 W e h l i n g 等旧1 发现花粉和花丝蛋白磷酸化水平与裸麦( S e c a l ec e r e a l eL ) 自交不亲和现象的发 生密切相关。W a l k e r 等哺 报道玉米中具有编码保守S 一结构域的类受体蛋白激酶S R K 的基因 Z m P K l ，其m R N A 主要在茎和幼根组织中表达，少量在花丝中表达。Z h a n g 等哺引克隆了该基 因的c D N A 序列。 1 5 蛋白质组学的研究进展 蛋白质组的概念最早f l ：l W i l k i n s 和W i l l i a m s 旧1 在1 9 9 4 年提出，目前已成为功能基因组学的 重要研究内容之一。蛋白质组( P r o t e o m e ) 是指一种基因组所表达的全套蛋白质及其存在方式。 蛋白质是生命活动的最终体现者，蛋白质组学则是从整体的角度出发来研究细胞内蛋白质的 组成及其活动规律的- - I - J 科学1 7 0 - 7 2 】。随着人类、拟南芥、水稻、杨树等生物体全基因组序列 的揭示，人们发现仅从基因组序列的角度根本无法完整、系统地阐明生物体的功能。要想真 正揭开生命现象的奥秘，需要系统地认识基因组的产物一蛋白质组。近十年来，蛋白质组学 取得了长足的进展。植物蛋白质组学现已涉及到3 5 个植物物种，但是主要还是集中在双子叶 植物拟南芥和单子叶植物水稻上，其次是在禾谷类、豆类、茄科作物以及苜蓿上。这些物种 的全基因组序列大部分都已完成并且具有大量的E S T 数据，为人们在不同水平研究生物系统 及其复杂功能开辟了广阔的前景。用于蛋白质组学研究的植物材料包括各种各样的基因型、 栽培变种、转基因植物和突变体、器官、细胞以及亚细胞组分等。研究目标也已经从过去的 对蛋白质组的整体描述转变到运用差异表达策略研究植物生物学、生理或生物化学过程。目 前在植物的应用主要表现在单个因素诱导作物变化后的蛋白表达与对照之间的差异探索，杂 种优势的分析，雄性不育或光温敏感性不育系的发育关键期的界定，蛋白质的翻译后修饰及 互作关系的解释等【7 3 删。 1 2 1 蛋白质组学分析技术 1 2 1 1 双向电泳 双向电泳技术是最为经典的蛋白质分离技术，近年来，随着固相p H 梯度胶条的出现， 双向电泳可以同时展示1 0 0 0 多条多肽，重复性和分辨力都有很大提高H 引。2 - D E 能区分存 在于一个样品中的几千种蛋白质，这种精确的分离技术迄今尚无其它分离方法可以替代。 2 - D E 原理是根据蛋白质等电点和分子量不同，先经1 D E 高压电场下对蛋白质进行等电聚焦 ( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，I E F ) ，然后在与第一相垂直的方向上进行第二相S D S 一聚丙烯酰胺凝胶 6 河南农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 电泳( S D S P A G E ) ，经染色后可以在凝胶上得到大量的蛋白质点，从而得到样品的蛋白质 表达图谱。与单独的I E F 或S D S P A G E ( 只能分辩几十种到几百种蛋白) 相比，可以从组织 或细胞提取物中分辨出几千种到几万种蛋白质，大大提高了对样品的分辨率，是目前最好的 蛋白分离方法。I E F 的载体已从两性电解质管胶电泳发展到了目前的固相p H 梯度凝胶电泳 ( i m m o b i l i z e dp Hg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，1 P G E ) 。I P G E 法大大减少了上样量及提高了可 重复性，完全没有载体两性电解质造成的聚焦时间长，p H 梯度不稳定及阴级漂移等缺点， 因此它己成为分离蛋白质的支撑技术而广为应用。 1 。 日前2 D E 技术尚未完善，手工操作较多，经验性强，双向电泳存住许多局限性，如重 复性差，疏水蛋白、低表达量蛋白、极酸和极碱性蛋白、分子量较小和较大蛋白的分离还较 为困难，高通量自动化尚未达到等。尽管如此，双向电泳仍然是目前分离蛋白质最有效的方 法之一。 1 2 1 2 图像分析 2 - D E 图谱上蛋白点纷繁复杂，仅凭肉眼无法进行精确系统的分析，必须依靠计算机为基 础的图像分析软件进行分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建等在内的图像 分析。目前应用较为广泛的图像分析软件有P D Q u e s t 、I m a g e M a s t e r2 DE l i t e 、M e l a n i e 、 B i o l m a g eI n v e s t i g a t o r 等，分辨率较高，功能齐全。尽管如此，仍不可避免出现未检出点和假 点，需要手工添加、删除和分割。 1 2 1 3 质谱分析 质谱技术是对分离的蛋白质进行鉴定的一种重要方法，也是蛋白质组研究中最关键的一 步。其原理是依据样品离子的质荷比m z 的差异来进行成分荷结构分析。V e n e r 等用质谱 技术揭示出光合系统I I 复合物内许多蛋白质的磷酸化位点，并对逆境( 如热激) 和正常条件 下的蛋白质磷酸化位点进行了比较，为逆境条件下叶绿体功能的研究提供了科学数据。阳1 。应 用肽质量指纹谱和数据库检索方法鉴2 D E 凝胶电泳分离的差异蛋白质，具有消耗少、效率 高等优点，适合大规模、高通量的蛋白质鉴定工作盯引。用串联质谱进行肽序列分析的方法可 直接读出肽序列，已成为蛋白质鉴定的技术支柱啪1 。串联质谱技术与同位素标记技术联合使 用应用于差异蛋白质组学研究时，可跳过电泳分离的步骤而直接定量分析蛋白质表达水平的 差异1 8 。虽然该技术尚处于探索阶段，但无疑有巨大的应用潜力。其他新型质谱的发展也朝 着高灵敏度、高精确度、高分析速度和更强的多级质谱方向发展。如将M A L D I 离子源与高 效串联质谱仪系统结合起来能把高通量的肽链图谱法与高特异性的肽链序列法融为一体悃引。 蛋白质芯片技术的出现大大提高了差异蛋白的鉴定速度。蛋白质芯片的检测手段近年有很大 发展，如R C A 探针标记检测法喁3 1 ，表面增强激光解析离子化( S E L D I ) 质谱等非探针标记 检测法暗引，表面激源共振生物传感器( S P R ) 的即时动态检测法等陋引。这些检测方法的发展使 得蛋白质芯片技术更能充分发挥其灵敏快速的优势。 7 河南农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 1 2 2 蛋白质组学在植物研究中的应用 1 2 2 1 逆境胁迫下植物蛋白质组学研究 在干旱、高盐、缺氧、A B A 处理和机械损伤等逆境胁迫条件下的，植物生理生化发生会 引起大量蛋白质在数量和质量上的改变。 C h a n g 等旧6 】通过定量分析3 5 S M e t 的摄入量并结合2 D E 和M S 方法，比较低氧适应和 缺氧条件下玉米根内的蛋白质合成。结果表明，在低氧适应的条件下，绝大多数蛋白质都能 正常表达，只有少数几种蛋白质的表达选择性地增高。而在缺氧条件下，正常蛋白质合成受 到抑制，并且没有出现其他蛋白质。 A g r a w a l 等旧引用2 - D E 、氨基酸测序和免疫杂交法，首次检测了臭氧对水稻幼苗蛋白的 影响。臭氧对叶片强烈的可见坏死伤害和随之而来的抗坏血酸过氧化物酶蛋白的增加，反映 在二维电泳胶上蛋白质点分布的变化。在被检测的具有可重复结果的5 6 个蛋白中，5 2 个蛋 白点随控制条件的不同发生的变化可以通过肉眼判定。检测的5 6 个蛋白中，6 个蛋白是N 一 端阻断，1 4 个蛋白的序列无法测定，3 6 个蛋白的N 一端序列和一个蛋白的内部序列被测定。 研究发现臭氧造成叶片光合蛋白的剧烈减少( 包括核酮糖一1 ，5 一二磷酸羧化酶加氧酶) 和 各种防御、胁迫相关蛋白的表达。 S h e n 等旧1 应用蛋白质组学方法研究水稻叶鞘伤害反应相关蛋白，首次揭示了水稻叶鞘 伤害信号应答过程中蛋白质的变化。比较伤害前后蛋白质表达谱，发现伤害后至少有1 0 个 蛋白被诱导或上调，1 9 个蛋白被抑制或表达量下降。通过N 一端或内部氨基酸测序，分析了 其中的1 4 个蛋白，鉴定了9 个蛋白的功能，其它蛋白由于N 一端阻断，无法得到氨基酸序列 信息。此外，还通过M A L D I T O F M S 测定了1 1 种蛋白质，并与水稻数据库相吻合。在基 因功能被确认的蛋白质中，表达量下降的蛋白有2 个钙网蛋白、组蛋白H l 和血红蛋白和一 种假定的过氧化物酶；表达量增加的蛋白包括胰蛋白酶抑制因子( B B T I ) 、两种假定的蛋 白激酶受体类似物、钙调素相关蛋白、核酮糖一1 ，5 一二磷酸羧化酶加氧酶小亚基、2 个甘 露糖结合外源凝集素。其中，4 种蛋白质已被证实为与伤害反应直接作用的蛋白质。 C a m p o 等旧1 在研究玉米萌发种胚对真菌侵染后地防御反应时发现，有9 个蛋自在真菌 侵染后上调表达，它们主要参与植物组织抗氧化和解毒、蛋白质的合成和折叠。特别是翻译 起始因子e l f 5 A 表达量提高，暗示它可能与植物防御反应直接有关。 1 2 2 2 突变体的蛋白质组学研究 对野生型与突变型的2 - D E 模式进行比较可提供对突变效果的评价，而且，能够鉴定出 突变基因编码或受其影响的蛋白。具体做法通常是对在相同条件下栽培的突变体及野生型植 物的2 D P A G E 图谱进行比较，受到影响的蛋白质通过质谱法或E d m a n 测序法进行鉴定， 为研究表型突变背后的生化过程提供有价值的信息。 H o c h h o l d i n g e r 等啪1 应用双向电泳方法对玉米侧根生长缺陷突变体l r t l 与野生型9 天龄 幼苗的根蛋白质进行比较，在p H4 7 范围检测到约1 5 0 个根蛋白质，其中9 6 个蛋白质在 8 河南农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 侧根生长缺陷突变体l r t l 中表达丰度提高。经质谱与数据库检索分析，6 7 个高表达蛋白得 到鉴定。在所检测到的蛋白质中，1 0 ( 1 5 1 5 0 ) 优先在侧根生长缺陷突变体l r t l 中表达， 其中8 个蛋白质被鉴定，4 个蛋白质为木质素代谢相关蛋白质。 H e r b i k 等分析了野生型和缺铁突变体番茄( L y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 的蛋白质2 D P A G E 图谱，鉴定了参与无氧代谢和胁迫防御的几种酶，如甘油醛- 3 - 磷酸脱氢酶、甲酸脱 氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶、质体蓝素等，并分析了这些酶在获得铁的过 程中的功能旧1 | 。K o m a t s u 等比较了水稻绿苗和白化苗的蛋白质2 D P A G E 图谱，发现了在 绿苗中参与光合作用的蛋白质，而白化苗中仅有此蛋白质前体。而抗坏血酸过氧化物酶只在 白化苗中存在，说明抗氧化酶在白化苗中起细胞保护功能。当已知突变的基因时，可用蛋白 质组学技术研究受此基因控制的有关信息嗽1 。 1 2 2 3 植物亚细胞蛋白质组学 植物的蛋白