中国水仙Narcissus tazetta Lvarchinensis Roem花香相关基因DXPS、DXR和PAL的克隆-硕士论文

分类号：$ 6 8 2 2 密级： 单位代码：1 0 3 8 9 学号：1 0 7 2 2 0 5 福建农林大学硕士学位论文 中国水仙( N a r c i s s u st a z e t t aL v ar c h i n e n s i sR o e m ) 花香相关基因D X P S 、D X R 和P A L 的克隆 学科门类： 一级学科名称： 二级学科名称： 研究方向： 研究 生： 指导教师： 农学 林学 园林植物与观赏园艺 生物技术与分子生物学 马传营 潘东明教授 完成时间：二0 0 年四月 T h eT h e s i sf o rM a s t e r sD e g r e eo fF u j i i a nA g r i c u l t u r ea n dF o r e s t r yU n i v e r s i t y C l o n i n g o fD X P S 、D X Ra n dP A LR e l a t e dt oF l o r a l F r a g r a n c e f r o mN a r c i s s u st a z e t t aL v a r c hi n e n s i s R o e m D i s c i p l i n e ：A g r o n o m y F i 隔tR a n k D i s c i p l i n e ：F o r e s t r y S e c o n dR a n kD i s c i p l i n e ：O r n a m e n t a lP l a n t sa n dH o r t i c u l t u r e R e s e a r c hF i e l d ：B i o t e c h n o l o g y & M o l e c u l a rB i o l o g y P o s t g r a d u a t e ： M a C h u a n y i n g S u p e r v i s o r P r o f P a nD o n g m i n g S u b m i t t e dT i m e ： A p r i l ，2 0 1 0 吣959叭7 4m7-Y r r 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独 立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致 谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。 与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢 意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 酢膨日期：冲 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：琶隹I 彰日期：跏勿7 指导教师亲笔签名： 幽t 日期：k 厂D 参c 广 - 一 福建农林大学硕士学位论文 目录 目录 目录I 缩略词I I I 摘要i A b s t r a c t i i i 第一章文献综述l 1 1 、中国水仙概况1 1 2 、本研究的科学意义。l 1 3 、本研究的国内外现状2 1 3 1 观赏植物花香物质生物合成的研究进展2 1 3 2 观赏植物花香基因的研究现状3 1 3 3 中国水仙花香生理和花香基因的研究现状4 1 3 4D X P S 、D X R 和P A L 的研究现状。4 1 4 本研究的技术路线5 第二章中国水仙花香相关基因倒娜D N A 全长克隆6 2 1 试验材料6 2 1 1 植物材料6 2 1 2 仪器与试剂6 2 1 3 试剂盒、酶和M a k e r 6 2 1 4 菌株和质粒载体6 2 1 5 实验用具和耗材6 2 1 6 引物合成与测序。7 2 2 试验方法7 2 2 1 中国水仙总R N A 的提取与检测7 2 2 2D X P S 基因保守区片段的克隆8 2 2 3D X P S 基因3 R A C E 的克隆1 1 2 2 4D X P S 基因57 R A C E 的克隆。1 2 2 3 结果与分析o 1 4 2 3 1 中国水仙总R N A 的提取1 4 2 3 2D X P S 基因的e D N A 保守区的克隆与序列分析1 4 2 3 3 中国水仙D X P S 基因c D N A 的R A C E 克隆及序列分析1 6 2 3 4 中国水仙啪咯c D N A 全长的获得与序列分析1 8 2 3 5 中国水仙劂c D N A 序列的同源性分析2 0 2 3 6 中国水仙嬲基因蛋白序列分析2 l 2 4 讨论2 6 第三章中国水仙花香相关基因D X R c D N A 全长克隆2 7 3 1 试验材料2 7 3 1 1 植物材料。2 7 3 1 2 仪器与试剂2 7 3 1 3 试剂盒、酶和M a r k e r 2 7 3 1 4 菌株和质粒载体一2 7 福建农林大学硕士学位论文目录 3 I 5 实验用具和耗材。2 7 3 1 6 引物合成与测序2 7 3 2 试验方法2 7 3 2 1 中国水仙总R N A 的提取与检测2 7 3 2 2D X R 基因保守区片段的克隆2 7 3 2 3D X R 基因37 R A C E 的克隆2 8 3 2 4D X R 基因57 R A C E 的克隆2 9 3 3 结果与分析2 9 3 3 1D X R 基因的c D N A 保守区的克隆与序列分析2 9 3 3 2 中国水仙D X R 基因c D N A 的R A C E 克隆及序列分析3 1 3 3 3 中国水仙D X Rc D N A 全长的获得与序列分析3 3 3 3 4 中国水仙D X R c D N A 序列的同源性分析3 5 3 3 5 中国水仙D X R 基因蛋白序列分析。3 6 3 4 讨论4 0 第四章中国水仙花香相关基因P A L 片段的克隆4 1 4 1 试验材料4 l 4 1 1 植物材料4l 4 1 2 仪器与试剂4 l 4 1 3 试剂盒、酶和M a r k e r j 4 1 4 I 4 菌株和质粒载体4 l 4 1 5 实验用具和耗材。4 1 4 1 6 引物合成与测序。4 l 4 2 试验方法4 1 4 2 1 中国水仙总R N A 的提取与检测4 1 4 2 2P A L 基因保守区片段的克隆4 1 4 2 3P A L 基因3 R A C E 的克隆4 2 4 3 结果与分析。4 3 4 3 1P A L 基因的c D N A 保守区的克隆与序列分析4 3 4 3 2 中国水仙P A L c D N A 3 R A C E 的克隆与序列分析4 4 4 3 3P A L 基因保守和37 端的拼接与序列分析4 6 4 4 讨论4 7 参考文献4 9 附j j 乏5 ：! 致谢：! ；：； H 福建农林大学硕士学位论文 缩略词 英文缩写 蛐 姆 A U A P b p C D N A d d H 2 0 D E P C d N T P D T T D X P S D X P s D X R 姗 E B I P P I P T G L B M V A O D P A L P A L P C R R A C E R N A R N a s e R T P C R X g a l 缩略词 英文全称 A m p i c i l i n A d a p e t e rp r i m e r A b r i d g e du n i v e r s a la m p l i f i c a t i o np r i m e r b a s ep a i r s C o m p l e m e n t a r yD N A D i s t i l l e dd e i o n i z e dw a t e r D i e t h y l p y r o c a r b o n a t e D i o x yn u c l e i o t i d et r i p h o s p h a t e s D i t h i o t h r e i t o l l - d e o x y x y l u l o s e - 5 一p h o s p h a t es y n t h a s e 1 - d e o x y x y l u - l o s e 5 - - p h o s p h a t es y n t h a s eg e n e 1 - d e o x y x y l u l o s e - 5 - p h o s p h a t er e d u e t o i s o m e r a s e 1 - d e o x y x y l u l o s e - 5 p h o s p h a t er e d u e t o i s o m e r a s eg e n e E t h i d i u mb r o m i d e I s o p e n t e n y lh o s P h a t 2 s l s o p r o p y l - - 1 - t h i o 1 3 - - D - g a l a c t o s i d e L u r i a - B e r t a n im e d i a r n e v a l o n i ca c i d O p t i c a ld e n s i t y P h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e P h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s eg e n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n R a p i dA m p l i f i c a t i o no f c D N Ae n d s R i b o n u c l e i da c i d R i b o n u c l e a s e R e v e r s e T r a n s c r i p t i o nP C R 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 i n d o l y l p - D - g a l a c t o s i d e I I I 中文名称 氨苄青霉素 接头引物 缩短的通用扩增引物 碱基对 互补D N A 双蒸水 焦碳酸二乙脂 脱氧核苷三磷酸 一 二硫苏糖醇 1 脱氧木糖5 磷酸合成酶 卜脱氧木糖- 5 - 磷酸合成酶基因 1 脱氧木糖一5 磷酸还原酶 1 脱氧木糖5 磷酸还原酶基因 溴化乙锭 异戊烯二磷酸 异丙基B D 半乳糖苷 L B 培养基 甲瓦龙酸 光密度 苯丙氨酸解氨酶 苯丙氨酸解氨酶基因 聚合酶链式反应 e D N A 末端快速扩增 核糖核酸 核糖核酸酶 反转录P C R 5 溴- 4 氯3 吲哚D 半乳糖苷 一 一 福建农林大学硕士学位论文 摘要 摘要 中国水仙( N a r c i s s u st a z e t t aL i n v a r c h i n e n s i sR o e m ) 为石蒜科水仙属植 物，多年生草本，是多花水仙的一个变种。福建漳州是中国水仙主要产地之一。 漳州水仙具有浓郁的香味，深受人们的喜爱。目前，一些高档的观赏植物因缺少 香味，不能完全满足市场需求，本实验对花香基因克隆的研究具有重大的意义。 本研究以漳州水仙品种金盏银台为材料，采用R T - P C R 和R A C E 技术， 克隆得出了中国水仙D X P S 、D X R 的e D N A 全长序列和P A L c D N A 片段序列，为 下一步利用花香基因进行遗传转化奠定基础，为缺少香味的植物遗传改良提供了 可能。主要研究结果如下： l 、克隆得到甲基赤藓糖醇( m e t h y l e r y t h r i t 0 1 ) 合成途径中的关键基因D X P S ( 登 录号为：G U 5 7 4 8 0 4 ) 的e D N A 全长。通过提取中国水仙总冠的总R N A ，反转录 为c D N A 二链，并以此为模板克隆得到D X P S 的e D N A 。D X P S 的c D N A 全长2 3 3 8 b p ，其中5 非编码区包含1 9 1b p ，3 非编码区包含2 4 2b p ，编码区为1 9 0 5b p ( 编 码6 3 4 个氨基酸，分子量为6 7 8k D a ) 。通过B L A S T 工具在线比对发现，中国 水仙D X P S 氨基酸序列与喇叭水仙( A J 2 7 9 0 1 9 1 ) 、巴西橡胶树( A B 2 9 4 6 9 9 1 ) 和侧 金盏花( E F 0 4 3 2 8 4 1 ) 的D X P S 氨基酸序列的同源性较高，分别为9 2 、7 5 和7 5 。 2 、克隆得到D X R 的e D N A 全长( 登录号为：G U 5 7 4 8 0 5 ) 。这个基因也是甲 基赤藓糖醇合成途径中的关键基因。中国水仙D X R 基因e D N A 全长为1 6 0 6b p 。 其中开放阅读框共1 4 1 0b p ，编码4 7 0 个氨基酸，分子量为5 lk D a ，57 非编码区 为1 1 9b p ，37 非编码区为7 7b p 。经B L A S T 分析，中国水仙D X R 氨基酸序列与 万带兰( E U l 4 5 7 4 4 ) 、大麦( A J 5 8 3 4 4 6 ) 、阳春砂( F J 4 5 9 8 9 4 ) 、薄荷( A F l l 6 8 2 5 ) 的D X R 氨基酸序列的同源性较高，分别为8 l 、7 5 、7 7 和7 6 。 3 、采用同样方法获的P A L c D N A 片段序列( 登录号为：G U 5 7 4 8 0 6 ) 。该片 段长1 9 7 1b p ，编码5 8 6 个氨基酸残基。该氨基酸序列与石蒜( A C M 6 1 9 8 8 1 ) 、 野芭蕉( B A G 7 0 9 9 2 1 ) 、葡萄( X P 0 0 2 2 6 8 7 3 2 1 ) 的P A L 氨基酸同源性为9 1 、 8 4 、8 3 。 关键词：中国水仙( N a r c i s s “st a z P t t 口L v a r c h i 刀P 刀s i sR o e m ) ；基因克隆； l - 脱氧木糖5 一磷酸合成酶( D X P S ) ；1 脱氧木糖5 磷酸还原酶( D X R ) ； 苯丙氨酸解氨酶( P A L ) 福建农林大学硕士学位论文 A b s t r a c t A b s t r a c t N a r c i s s u st a z e t t aL v a r c h i n e n s i sR o e m ，av a r i a n to fp o l y a n t h o u sd a f f o d i l s ，i sa k i n do fp e r e n n i a lp l a n t sa n db e l o n g st ot h ef a m i l yA m a r y l l i d a c e a e Z h a n g z h o uw h i c h i sae i t yo fF u J i a np r o v i n c ei st h em o s ti m p o r t a n tp r o d u c ea r e ao fC h i n e s en a r c i s s u s Z h a n g z h o un a r c i s s u s h a sar i c ha r o m a sa n d g e t sp e o p l e Sl o v e N o w , S o m e h i g h - q u a l i t yo r n a m e n t a lp l a n t sl a c kf r a g r a n c ea n dc a n n o tc o m p l e t e l ym e e tt h em a r k e t d e m a n d I t Sav a l u et ot h ef l o r a lg e n ec l o n e I nt h i ss t u d y ，w ec l o n et h ef u l ll e n g t he D N Ao f1 - d e o x y x y l u - l o s e 一5 一p h o s p h a t e s y n t h a s e ( D X P S ) a n d1 - d e o x y x y l u l o s e 5 - p h o s p h a t er e d u e t o i s o m e r a s e ( D X R ) a n da p a r t i a ls e q u e n c eo fP h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ( P A L ) f r o mC h i n e s en a r c i s s u s p e t a l sb yR T - P C Ra n dR A C E I tb e c o m e sap o s s i b i l i t yt oi m p r o v el a c ko ff r a g r a n c e p l a n tg e n e t i co ns u b s e q u e n tg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns t u d y T h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 T h ef u l l l e n g t he D N Ao f1 - d e o x y x y l u - l o s e 一5 - p h o s p h a t es y n t h a s e ( D X P S ) i s o b t a i n e d ( G e n B a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：G U 5 7 4 8 0 4 ) T h eR N Ae x t r a c t e df r o m N a r c i s s u sf l o w e rW a su s e df o rt h ei s o l a t i o nQ tD X P sb yR T - P C R I t jSak e yg e n ei nt h e m e t h y l e r y t h r i t o lS y n t h e t i ca p p r o a c h T h er e s u l t so fa n a l y s i so ft h ec o d i n gs e q u e n c e s o ft h eg e n ed e m o n s t r a t e dt h a tt h ee D N Ao fD X P Si s2 3 3 8b pl o n g ，i n c l u d i n ga5 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f191b pa n da3 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f2 4 2 b p I tc o n t a i n sa nO R F e n c o d i n g6 3 4a m i n oa c i dr e s i d u e s C h i n e s en a r c i s s u s Sa m i n oa c i ds e q u e n c eh a d9 2 ， 7 5 a n d7 5 i d e n t i t y 、i t ht h a to fN a r c i s s u sp s e u d o n a r c i s s u s ，H e v e ab r a s i l i e n s 括， A d o n i sp a l a e s t i n a 2 T h ef u l ll e n g t hc D N Ao f1 - d e o x y x y l u l o s e - 5 - p h o s p h a t er e d u e t o i s o m e r a s e ( D X R ) ( G e n B a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：G U 5 7 4 8 0 5 ) i so b t a i n e d I t Sa l s oak e yg e n ei nt h e m e t h y l e r y t h r i t o lS y n t h e t i ca p p r o a c h T h ef u l l l e n g t hc D N Ao fD X Ri s16 0 6b pl o n g ， i n c l u d i n ga5 u n t r a n s l a t e dr e g i o no fl19 b pa n da3 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f7 7 b p I t c o n t a i n sa nO R F e n c o d i n 9 4 7 0a m i n oa c i dr e s i d u e s C h i n e s en a r c i s s u s Sa m i n oa c i d s e q u e n c eh a d81 ，7 5 ，7 7 a n d 7 6 i d e n t i t y 、V i t ht h a to fV a n d ah y b r i d , H o r d e u m v u l g a r e A m o m u mv i l l o s u m , M e n t h 口 福建农林大学硕士学位论文A b s t r a e t 3 U s i n gt h es a m em e t h o d ，w ec l o n eap a r t i a ls e q u e n c eo f P h e n y l a l a n i n e a m m o n i a - l y a s e ( P A L ) f r o mC h i n e s en a r c i s s u s ( G e n B a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：G U 5 7 4 8 0 6 ) T h eL e n g t h o ft h ee D N Ai s1971b p I tc o n t a i n s586a m i n oa c i dr e s i d u e s C h i n e s en a r c i s s u s S a m i n oa c i ds e q u e n c eh a d91 ，8 4 a n d8 3 i d e n t i t yw i t ht h a to fL y c o r i sr a d i a t a ，M u s a a c u m i n a t a ，H t i sv i n i f e r a K e y w o r d s ：C h i n e s en a r c i s s u s ( N a r c i s s u st a z e t t aL V a r c h i n e n s i sR o e m ) ；g e n e c l o n e ；1 - d e o x y x y l u l o s e 一5 一p h o s p h a t es y n t h a s e ( D X P S ) ；1 - d e o x y x y l u l o s e - 5 - p h o s p h a t e r e d u e t o i s o m e r a s e ( D X R ) ；P h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ( P A L ) 福建农林大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 、中国水仙概况 水仙原分布在中欧、地中海沿岸和北非地区，按照德国分类法，将其分为六 大类：喇叭水仙类，明星水仙类，红口水仙类，多花水仙类，长寿花类，其他水 仙类。中国水仙( N a r c i s s u st a z e t t aL v a r C h i n e n s i sR o e m ) 属于多花水仙亚种的一 个变种，是我国著名的传统草本名花，因多为水养，且叶姿秀美，花香浓郁，亭 亭玉立水中，故有”凌波仙子”的雅号，又名金盏银台、玉玲珑、雅蒜等【l 】。在我 国，水仙原产于浙江福建一带，主要分布于福建漳州、厦门及上海崇明岛，根据 产地分为漳州水仙和崇明水仙，通常所说的水仙常指漳州水仙，现已遍及全国和 世界各地。 中国水仙主要有单瓣和复瓣两个品系：单瓣型称”金盏银台”，俗称”酒盏”，花 单瓣，花被乳白色6 瓣连接，副冠黄色筒状，形似酒杯，子房下位，柱头三裂， 雄蕊6 枚，花具清香；复瓣型：称”玉玲珑”，俗称”百叶”，花被复瓣，由雄蕊和 副冠变态而成，花瓣上轻黄色，下乳白色，香气较差。 1 2 、本研究的科学意义 福建漳州是全国最大的水仙生产基地，年产水仙花球6 4 0 0 万粒，占全国产量 的9 0 。2 0 0 8 年5 月，“漳州水仙花”文字和图案注册商标荣膺“驰名商标”称号， 成为全国花卉品种首枚驰名商标。中国水仙以花枝多，花香浓郁而有名。近年来， 随着销售渠道不断拓宽，花卉市场需求量增加，带动水仙花销售价格上涨，使种 植面积也在不断扩大，现已成为福建省出口创汇的重要花卉之一。 花香是园林观赏植物的重要指标之一，其产生的生化过程涉及多个酶基因。 D X R ( 1 - d e o x y x y l u - l o s e 5 - p h o s p h m er e d u e t o i s o m e r a s e ，l - 脱氧木糖- 5 一磷酸还原酶) 和D X P S ( 1 - d e o x y x y l u - l o s e - 5 - p h o s p h a t es y n t h a s e ，1 - 脱氧木糖一5 一磷酸合成酶) 是 萜类物质的前体异戊烯二磷酸( i s o p e n t e n y ld i p h o s P h a t e s ，I P P ) 合成的关键酶， 是单萜和双萜类芳香物质、类胡萝卜素( 四萜) 、V E 和叶绿素等重要物质合成的关 键调控位点。它们同为甲基赤藓糖醇( m e t h y l e t y t h r i t 0 1 ) 合成途径中的关键酶1 2 | ， 并且此合成途径在质体中进行，主要合成半萜、单萜和双萜。在中国水仙挥发性 福建农林大学硕十学位论文 第章文献综述 成分中，萜烯类占1 1 9 ，其中芳樟醇、柠檬烯、B 月桂烯、苏合香烯等是主要 的萜类物质。随着人们生活质量的提高，对花卉的品质要求越来越高，不仅要求 花色和花型好看、花期长，而且要求有花香。中国水仙花具有浓郁的芳香，如果 利用基因技术对其香气基因进行克隆，转化到其它没有芳香气味的植物中去，提 高观赏植物的整体观赏价值，对满足市场需求，促进整个花卉产业的发展意义重 大。 1 3 、本研究的国内外现状 1 3 1 观赏植物花香物质生物合成的研究进展 花香是花卉最重要的特征之一，一般来说植物花香物质主要分萜类、苯基 苯丙烷类、脂肪酸衍生物三大类别。 萜类化合物是植物花香物质所占比例最大的一类。大部分的萜类化合物是由 异戊烯二磷酸通过单萜或倍半萜合成酶的作用合成的【3 1 。根据萜类化合物生物合 成的先后顺序，可以分为4 步：( 1 ) 异戊烯二磷酸( i s o p e n t e n y lh o s P h a t e s ，口P ) 的合成。I P P 的合成途径包括两个：一是甲瓦龙酸( m e v a l o n i ca c i d ，M V A ) 途径。 该途径以乙酞辅酶A 为前体，在乙酞辅酶酰基转移酶( a c e t y l C o Aa c y l t r a n s f e r a s e ， A A C T ) 等酶的作用下合成甲瓦龙酸，最后合成I P P ；二是甲基赤藓糖醇途径。该 途径以丙酮酸( p y r u v a t e ) 和磷酸甘油醛( g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e ) 为底物， 在1 脱氧木糖5 磷酸合成酶、1 脱氧木糖5 磷酸还原酶、2 甲基赤藓糖- 4 磷酸 胞苷转移酶( 2 一C m e t h y l e r y t h r i t o l 一4 一p h o s p h a t e c y t i d y l t r an s f e r a s e ，M C T ) 等酶的 作用下合成I P P ，主要合成半萜、单萜和双萜，这条途径在质体中进行【4 】。这两 条合成途径间经常存在着物质交换【5 1 。( 2 ) I P P 在烯丙基转移酶( p r e n y l t r a n s f e r a s e s ) 等一系列酶的作用下，与其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸醋( d i m e t h y l a l l yd i p h o s p h a t e ，D M A - P P ) 结合，生成香叶基焦磷酸( g e r a n y l d i p h o s p h a t e ，G P P ) ，G P P 结合2 个I P P 最终转换成香叶基香叶基焦磷酸( g e r a n y l g e r a ny l d i p ho s p h a t e ，G G p p ) 等萜类化合物合成必需的中间体【6 1 。( 3 ) 这些中间体在萜类合成酶( t e r p e n e ss y n t h - a s e s ) 的催化下，最终形成半萜、单萜、倍半萜和双萜【7 】等萜类化合物。( 4 ) 合成的 这些萜类化合物通过细胞色素P 4 5 0 氧化酶( c y t o e h r o m e P 4 5 0 0 x i d a s e s ) 、氧化还原酶 ( N A D P r N p d 9 一d e p e n d e n to x i d o r e d u c t a s e s ) 和甲基转移酶( m e t h y l t r a n s f e r a s e ) 等各种 酶的氧化或甲基化作用，形成各种萜类化合物的衍生物。 2 福建农林大学硕士学位论文第一章文献综述 苯基苯丙烷类是另外一类植物的花香物质，属于肉桂酸( c i n n a r m i ca c i d ) 合成途径，主要调控酶为苯丙氨酸裂解酶( P A L ) 。此途径经过羟基化、酰基化 和甲基化等一系列反应，最后以L 苯丙氨酸为主要底物催化形成该类植物的花香 物剧引。 脂肪酸衍生物包括各种小分子的醇类和醛类，其合成途径中重要的调控酶为 脂肪酸氧化酶( L O X ) ，过氧化氢物裂解酶( h y d r o p e r o x i d e l y a s e s ，H P L S ) ，脱氢 酶( d e h y d r o g e n a s e s ) 等。植物脂肪代谢过程中的这些酶，催化以亚油酸、亚麻 酸等含有1 6 和1 8 个碳的不饱和脂肪酸为底物的异构过氧化反应，最终生成具有香 味的挥发性醛及相应的酣9 1 。 除了上面的三类合成途径以外，这种具有香味的萜类化合物也可以由类胡萝 卜素通过类胡萝卜素断裂双加氧酶( c a r o t e n o i d c l e a v a g e d i o x y g e n a s e s ) 的作用分解 产生【1 0 1 。以上花香物质合成路线图见附录图1 1 1 3 2 观赏植物花香基因的研究现状 D u d a r e v a 等】首次从仙女扇( C l a r k i ab r e w e r i ) 克隆得到花香相关基因c D N A 。 P i c h e r s k y 等 1 2 1 鉴定并分离纯化了单萜挥发性物质( S ) 芳樟醇的合成酶；随后， I E M T 、B E A T 、S A M T 、B A M T 、B E B T 、B S M T 和苯乙醛合成酶( p h e n y l a c e t a l d e h y d e s y n t h a s e ，P A A S ) 等关键酶基因从仙女扇、金鱼草( A n t i r r h i n u mm a j u s ) 和矮牵牛 ( P e t u n i a 坳，砌) 等植物中被克隆出来1 3 郴】。 随着基因组学的发展，C h a n n e l i e r e 等【1 9 】人通过利用表达序列标签对玫瑰花基 因表达情况进行分析，发现在花和雄蕊特异表达过程中存在几个与花香代谢有关 的基因。G u t e r m a n 等【2 0 】用大肠杆菌、酵母等表达系统分析了释放两种不同香气 能力的玫瑰( R o s ah y b r i d a ) 间基因表达的差异，发现了一些与挥发性物质合成相关 的基因。L a v i d 等【2 1 。2 4 】人利用功能基因组学分子生物技术，从玫瑰花中分离得到 O O M T l 、O O M T 2 、R c O M T l 、R c O M T 2 和P O M T 四个花香相关基因；N e g r e 等【2 5 2 刀 从矮牵牛中得到B A M T 的类似基因B S M T 、B P B T 和新的花香调控基因 O D O R A N T l _ _ 三个花香基因。信号分子茉莉酸甲酯合成酶基因也已被分离【2 8 1 。在 拟南芥基因组全序列中研究过程中，L e o n 等【2 9 3 1 】发现3 4 个挥发性的萜类合成酶 基因，可以分别催化1 3 一罗勒烯、月桂烯、芳樟醇和石竹烯的合成。研究结果表 明，拟南芥虽然缺乏浓郁的香味，但是也可作为研究植物挥发性物质代谢调控的 3 福建农林大学硕士学位论文 第一章文献综述 模式植物。 如果能够利用花香基因工程进行转基因育种，将会产生重大的经济价值，具 有广阔的市场前景。随着植物花香物质代谢途径的研究深入和相关基因的克隆， 以及现代分子生物技术的不断发展，植物花香基因工程在改造现有植物性状，培 育色香型俱佳的观赏植物的育种实践中将发挥越来越重要的作用。 1 3 3 中国水仙花香生理和花香基因的研究现状 A n o n i s 、黄巧巧、戴亮等【3 2 - 3 4 1 人报道过中国水仙花的香气组成，其主要成 分是苯甲醛，芳樟醇，乙酸苄酯，柠檬烯，1 3 一月桂烯、苏合香烯、乙酸苯乙酯 等。萜类化合物是植物花香物质所占比例最大的一类，也是众多植物香味物质的 主要成分，如芳樟醇，柠檬烯，B 月桂烯、苏合香烯等单萜。大部分的萜类化 合物是通过单萜或倍半萜合成酶的作用下结合异戊烯二磷酸生成的【3 5 1 。L i S 基因 编码S - 萜烯醇( S 1 i n a l 0 0 1 ) 合成酶，该酶可将栊牛儿焦磷酸( G P P ) ( 类萜合成的共同 成分) 转化成S 萜烯醇。该基因目前在中国水仙花瓣中还未被克隆。柠檬烯合酶， 1 3 月桂烯合酶、苏合香烯合酶相应的编码基因的克隆目前还未见报道。 在中国水仙花中，在乙酰辅酶A ：苯甲醇乙酰转移酶的作用下合成乙酸苄酯， 而编码此酶基因的c D N A 片段还未见报道，目前此c D N A 的全长只有在山字草中 被克隆3 6 1 。 1 3 4 D X P S 、D X R 和P A L 的研究现状 D X P S 和D X R 是萜类物质的前体异戊烯二磷酸合成的关键酶。它们是甲基赤 藓糖醇途径中的重要酶。D X P S 基因现已从长春花( D Q 8 4 8 6 7 2 ) 、喇叭水仙 ( A J 2 7 9 0 1 9 ) 、拟南芥( N M - 1 8 0 2 8 9 ) 、金鱼草( A Y 7 7 0 4 0 7 ) 、菊花( A B 2 0 5 0 4 4 ) 、 穿心莲( A Y 2 5 4 3 9 0 ) 、侧金盏花( E F 0 4 3 2 8 4 ) 等植物中克隆。D X R 基因已在薄 荷( A F l1 6 8 2 5 ) 、金鱼草( A Y 7 7 0 4 0 6 ) 、水稻( A F 3 6 7 2 0 5 ) 、海藻莲( X M0 0 2 2 9 5 5 6 1 ) 、 大麦( A J 5 8 3 4 4 6 ) 等植物上克隆。 P A L 是肉桂酸合成途径中的关键酬3 7 1 。该途径形成的反式肉桂酸( a m i c a c i d ) 经过甲基化或酰化，最后形成一系列的挥发性化合物。P A J L 基因现已从石蒜 ( F J 6 0 3 6 5 0 ) 、兰花( X 9 9 9 9 7 ) 、拟南芥( N M1 1 5 1 8 6 ) 、野芭蕉( E U 8 5 6 3 9 3 ) 、 柱花草( E U 4 0 4 1 6 0 )