COX2和VEGF与肝癌多细胞球体群集耐药性的关系_第1页
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-本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档,如需本文,请下载-COX2和VEGF与肝癌多细胞球体群集耐药性的关系本文从网络收集而来,上传到平台为了帮到更多的人,如果您需要使用本文档,请点击下载按钮下载本文档(有偿下载),另外祝您生活愉快,工作顺利,万事如意!【摘要】 目的: 探讨COX2和VEGF在肝癌多细胞球体(MCS)中的表达与肝癌群集耐药的关系. 方法 : 以liquid overlay技术获得肝癌HepG2多细胞球体为模型,采用透射电镜和扫描电镜比较单层细胞与MCS的形态学差异;采用MTT法和流式细胞技术比较ADM和5FU对单层细胞和MCS的生长抑制率和细胞凋亡率;采用免疫组化和图像 分析 技术比较COX2和VEGF在单层细胞和多细胞球体表达的差异. 结果: 与单层细胞相比,多细胞球体细胞间黏附广泛而紧密,可见中间连接和桥粒连接. 不同浓度的ADM和5FU作用48 h,MCS细胞的生长抑制率和细胞凋亡率均低于单层细胞,差异有统计学意义(P ). 免疫组化结果显示,COX2和VEGF在MCS上高表达(P ). 结论: 肝癌MCS具有群集耐药性,可能与其高表达COX2和VEGF有关. 【关键词】 肝癌;群集耐药;环氧化酶2;血管内皮生长因子 0引言 肿瘤细胞出现耐药现象是肿瘤化疗失败的主要原因之一. 三维细胞培养比平面细胞培养更能反映体内肿瘤的情况1. 我们检测肝癌多细胞球体(multicellular spheroids,MCS)对阿霉素(adriamycin,ADM)和5氟脲嘧啶(5fluorouracil,5FU)的耐药性以及环氧化酶2(cyclooxygenase2,COX2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肝癌群集耐药(multicellular resistance,MCR)中的表达的关系,探讨肝癌MCS的耐药机制. 1材料和方法 材料人肝癌HepG2细胞购自美国ATCC,由本室保存;RPMI 1640培养液购自Gibco公司;噻唑兰(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;Annexin VFITC试剂盒购自晶美生物公司;COX2鼠抗人mAb和VEGF鼠抗人mAb购自Santa Cruz公司. 透射电镜(Hitachi,H600);扫描电镜(JEOL,JSM840);高通量多功能微板测试系统(BMG,PolarStar OPTIMA);流式细胞仪(BD,FALS Calibar);图像信号采集与分析系统(LEica,Q550CW). 细胞平面培养采用常规方法,多细胞球体采用liquid overlay技术获得2,先将20 g/L琼脂糖 mL在6孔板上铺一薄层,冷却后接种HepG2细胞(1106/L) 2 mL,每48 h半量换液1次,4 d后形成MCS. 方法 细胞超微结构观察取平面细胞和MCS,置于25 g/L戊二醛固定液中4固定2 h,10 g/L四氧化锇固定液4后固定2 h,乙醇梯度脱水,置换,切片,喷金后用透射电镜和扫描电镜观察. 细胞抑制率的检测将细胞接种于96孔板中,在不同浓度ADM和5FU作用48 h后,每孔加入5 g/L MTT 20 L,继续孵育4 h后弃上清,每孔加入150 L DMSO振荡5 min,于492 nm波长处检测每孔A值,以不加药物组为空白对照, 计算 细胞抑制率. 细胞抑制率(%)=(1-实验组A值)/对照组A值100%. 细胞凋亡的检测单层细胞和MCS分别经不同浓度ADM和5FU作用48 h后收集,按照试剂盒说明书加入Annexin VFITC和PI,避光染色15 min后,上机检测细胞凋亡率. 检测COX2和VEGF的表达单层细胞制作细胞爬片,40 g/L多聚甲醛固定20 min后备用. MCS 40 g/L多聚甲醛固定1 h后,乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,常规切片后备用. 根据试剂盒说明进行免疫组化染色,阴性对照用PBS代替一抗. 用Leica Q550cw图像信号采集与分析系统在统一光强下随机选择10个视野(1020)计算平均灰度值,灰度值越小,阳性染色越强,表明免疫反应性越高. 统计学处理: 采用SPSS 统计软件进行统计学分析. 计量指标以xs表示,用COX2和VEGF的灰度值表示表达强度,组间比较用方差分析,P 有统计学差异. 2结果 单层细胞和MCS的形态学特点单层HepG2细胞贴壁生长,细胞表面有较多的微绒毛样突起,细胞间隙较大(图1A),细胞间连接少见,仅见一类似紧密连接样的结构(图1B). MCS悬浮生长,细胞相互聚集并迅速增殖,形成细胞数目不等的球形多细胞聚集体,具有三维的结构特征,于培养后4 d直径达到200 m左右(图1C),细胞间黏附广泛而紧密,可见桥粒连接和中间连接(图1D). 单层细胞和MCS细胞抑制率的比较MTT实验结果表明,除 mg/L组以外,经,和 mg/L的ADM作用48 h后,MCS的细胞抑制率低于单层细胞(P ,图2A);经,25,50和100 mg/L的5FU作用48 h后,MCS的细胞抑制率低于单层细胞(P ,图2B). 单层细胞和MCS细胞凋亡的比较经, mg/L ADM作用48 h后,MCS的细胞凋亡率低于单层细胞(P ,图3A);经40和80 mg/L 5FU作用48 h后,MCS的细胞凋亡率低于单层细胞(P ,图3B). 在20 mg/L 5FU组两者的细胞凋亡未见明显差异. 12下一页欢迎浏览更多论文联盟首页

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