国家重点基础研究发展计划（973计划）项目申报书-植物免疫机制与作物抗病分子设计的重大基础理论

项目名称：植物免疫机制与作物抗病分子设计的重大基础理论首席科学家：何祖华 中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2011.1至2015.8依托部门：中国科学院 农业部二、预期目标（一）项目总体目标深入阐明重要粮食作物的免疫机理、建立我国主要农作物重大病害抗病机制为模式的创新研究体系，结合我国转基因新品种培育的重大战略需求，建立作物抗病分子设计的理论与技术体系。本项目将系统分离并鉴定重要粮食作物水稻和麦类新的抗病基因（包括QTL）、病原菌致病因子的寄主靶标、模式植物拟南芥的重要调控基因及其在作物中的相应功能等，建立我国特色的分子植物病理学前沿理论研究模型，开辟植物免疫研究的国际前沿，前瞻性地布局国际前沿的创新研究领域与技术体系。在植物新的免疫机制、作物广谱持久抗病的分子遗传机制、作物重要腐生病（如纹枯病）的抗病性等方面获得重大突破，并以此为基础建立重要粮食作物抗病分子设计的重大基础理论和技术体系。本项目将在农作物抗病性的基础理论上做出创新性贡献，为作物抗病育种提供具有自主知识产权的新策略、新技术和基因资源。本项目的实施将在高水平研究论文发表、专利申请和优秀人才培养与团队建设等方面做出重大贡献，大幅提高我国的农业科学理论与技术水平，实现跨越式发展，显著增强我国农业科学自主创新的能力，为国家“转基因新品种培育重大专项”的高效实施提供理论与技术体系的保障。（二）五年预期目标1. 建立水稻和麦类作物免疫研究的前沿体系以水稻为代表的农作物与拟南芥相比，它们的免疫分子机理既有相似性，但在抗病基因的结构和功能、对病原菌PAMP和effector识别应答及其调控网络的结构等方面存在重要差异，并存在较多的技术障碍，重要的研究体系也没有很好建立。本项目将立足于领域前沿与国家需求，分别把水稻和小麦的重要抗病系统的研究进一步发展成为全面、成熟、具有国际前沿水平的植物抗病分子机理研究的模式体系；并初步建立对顽拗性腐生病原菌纹枯病（立枯丝核菌）和赤霉病（禾谷镰孢）免疫研究的技术平台与重要的抗病相关基因资源，全面揭示宿主农作物对腐生性病原侵染的应答网络和免疫机制，为分子植物病理学科的发展和作物抗病分子育种提供新的理论和途径。2. 深化植物免疫研究的模式和内容，开辟国际领先的研究新领域本项目课题组在近几年已在拟南芥的PTI和ETI，SAR，及其交互作用（cross-talk）做出了系列的国际水平的研究成功，项目的实施将进一步建立合作团队，凝练主攻方向，在植物ETI的新机制、ETI-PTI交互作用、新的SAR调控因子上建立国际领先的研究领域，获得系列重要研究成果。3. 创建植物免疫表观遗传调控研究新体系目前植物免疫的表观遗传机制研究刚刚起步，若干重要问题亟待解决。本项目将利用相关课题组已经建立的国际前沿植物RNA沉默及抗病毒分子机理的研究水平的基础上，鉴定新的表观遗传因子与作用机制，系统研究植物中RNA沉默介导的表观遗传机制在植物免疫中的新的调控功能；建立重要作物病害如黄单胞菌（白叶枯病）对水稻siRNA的调控的全基因组网络，阐明植物miRNAs是否通过调控R基因直接参与植物抗病反应，在新的层面上认识植物免疫的RNA沉默途径的应答机制，建立创新的植物免疫研究理论与技术体系，在农作物抗病的理论和转基因抗病新技术上取得新的突破。4. 剖析作物抗病性与产量性状关联的分子机制，建立学科交叉领域以水稻抗病反应与发育的交互作用为模式系统，阐明水稻SAR基因OsNPR1如何调控生长素发育途径，从而调节水稻产量性状的分子机制；阐明ET发育途径参与水稻稻瘟病抗性的分子机理；阐明以水稻病毒病（RDV和水RBSDV)侵染植物导致植物矮化的分子机理，为病毒防治寻找新的途径；建立新的作物抗病与发育交叉研究领域，在学科创新上有持续的生命力。5. 系统发掘作物重要抗病新基因，解析新的抗性机制目前从水稻和小麦中克隆的抗病基因数量非常有限，极大部分抗病基因还未知。 这对于全面理解作物与病原菌的相互作用及抗病机制是主要的限制因素。尤其是对广谱持久抗病性的分子机制基本上是空白。此外，对于类似纹枯病这样的水稻病害，其危害已越来越严重，但在水稻中迄今尚未鉴定有重要抗性的基因位点。本项目将系统克隆30-50个水稻抗病基因（尤其是广谱持久抗病基因）、麦类慢锈病抗病主效QTL等、以及重要的抗病调控基因，系统剖析这些新抗病基因的抗性机制，尤其将在克隆水稻广谱抗病基因ROD1、Pigm、小麦慢条锈苗期主效数量抗性基因Yrq1及大麦慢叶锈成株期主效数量抗性基因Rphq4的基础上，确定其在免疫反应网络中所承担的功能，提出植物广谱持久抗病性遗传与分子机理的模型，也为接续的分子设计育种奠定基础。6. 创立并实践作物抗病分子设计的基础理论与技术体系本项目将整合上述基础理论和基因资源，解决抗病分子设计育种的关键科学问题，包括：优异等位或同源抗病基因的开发、基因簇内复等位基因的重组和功能评价；新型抗病基因的分子设计和功能评价；抗病基因的聚合转化/转育及其功能评价。本项目将率先建立水稻和小麦抗病分子设计的实践模型，发展2-3种农作物抗病改良的新策略，为广泛开展作物抗病分子设计育种奠定理论与技术基础。通过科学的分子手段，结合传统育种手段对农作物栽培品种进行遗传改良，得到抗病性显著改良和广谱抗病的水稻、小麦等农作物的品系7-10个，获得2-3个能够抗水稻纹枯病、病毒病等疑难病害的农作物品（株）系。7. 创造系列高水平的研究成果，大幅提升我国在本领域的国际地位在国内外核心刊物上发表研究论文100篇左右。其中，在国际一流学术期刊（IF 8.0）上发表论文1015篇，申请发明专利2030项，授权专利710个，主办一次大型专业国际学术会议，大幅提升我国科研团队在国际上的研究地位。8. 全面推进优秀人才培养和创新团队建设依托项目实施，进一步凝练我国在植物免疫和作物抗病分子领域的战略目标，培养一批具有科学创新精神和在专业领域具有较高国际显示度的中青年学科带头人，建设具有国际一流水平的研究队伍。培养博士后和研究生150名左右，为我国现代农业生物技术的发展奠定人才基础。三、研究方案（一）总体学术思路本项目紧密结合农业生物学学科前沿，并为保障我国粮食生产安全和支撑国家转基因新品种培育等重大战略需求，建立以我国主要农作物重大病害抗病机制为模式的创新研究体系。在研究思路上强调顶层设计与整合，以“一线四点六面” 的格局组织项目的实施，即：1条主线，4个关键科学问题，6方面研究内容。在具体研究体系上，针对重要的作物-病害体系包括水稻和麦类病害的新抗病基因和调控基因的克隆与功能机制，并整合与创新模式植物拟南芥的前沿免疫研究体系。在技术路线上广泛采用正向、反向遗传学和表观遗传学，并结合生物信息学、蛋白-蛋白相互作用、蛋白组学、现代生物化学与细胞生物学等研究技术。在目标集成上，剖析作物对重要病原菌的识别机制与应答的信号网络，研究作物广谱与持久抗性尤其是数量性状（QTL）抗性的分子机制，分析与整合作物抗病性与产量性状的互作途径，并紧密结合作物遗传育种，建立作物抗病分子设计的理论、应用基础和共性技术体系。（二）总体技术途径目前组学和复杂性状的研究方法已贯穿到生物学研究的各个方面，根据总体研究目标和目前学科的发展趋势，本项目将针对农作物与病原微生物相互作用过程中的关键环节，充分利用遗传学和表观遗传、植物病理学、分子生物学、蛋白质相互作用、细胞生物学、生物化学等现代生物学研究手段，将植物-病原菌的功能基因组学、蛋白组学、转录组学和生物信息学等精密结合，以严密的设计和精准的实验分析，解析和阐明植物免疫的细胞、生化与分子过程。因此，本项目将发展和利用以下相互交织的技术平台：1. 充分运用遗传学与基因组学平台，鉴定重要的抗病或免疫调控因子。利用作物抗病资源和大规模突变体筛选，定位克隆重要的抗病基因（包括QTL）和关键调控基因，分析抗病等位基因的结构与功能差异，并利用植物转化和基因敲除（knockout/knockdown）等验证基因功能；利用蛋白质互作和蛋白组学等技术，鉴定重要的互作蛋白或靶蛋白等；利用表达组学结合基因功能分析，分离鉴定重要的免疫调节基因。2. 建立表观遗传分析技术体系和遗传资源，分析表观遗传机制对植物免疫的调控，鉴定有调控功能的sRNA及其靶标基因。3. 利用生物信息分析平台，对大规模植物和病原菌基因组数据库进行序列分析和基因挖掘鉴定重要的免疫/抗病调控因子、响应因子和路径节点等，分析重要病原的致病性基因簇结构及其寄主靶标，预测抗病蛋白的结构和互作模式，并根据重要的免疫信号转导途径建立基因调控网络。4. 利用激光微切割技术结合基因芯片和生物信息学分析平台，精确分离鉴定细胞特异和侵染早期的寄主响应基因，尤其是对腐生菌(小麦赤霉病)的抗病相关基因，建立防卫反应网络。5. 建立和利用细胞生物学和生物化学平台，包括各种显微观察方法、标记与跟踪技术、免疫共沉淀、体内外生化活性分析等技术，验证重要的植物免疫细胞学过程，分离重要的活性小分子，抗病的激素途径及其与产量性状等的关联。6. 将分子遗传、转基因技术和作物育种学结合，进行抗病分子设计育种，选育广谱抗病水稻和小麦品系，建立分子设计育种的理论与技术体系。遗传学途径 表观遗传途径 生化途径 生物信息途径作物抗病分子设计的理论与技术体系作物抗病资源,拟南芥突变体基因定位克隆与功能分析植物抗病机制与信号途径抗病育种分子标记与分子设计抗病等位基因和功能分化抗病TGS途径, sRNA表达谱miRNA,RdDM调控R基因RNA沉默与水稻抗病性水稻sRNA靶标与抗性途径植物新抗病理论与技术体系蛋白互作,关键基因鉴定致病因子新靶标与功能免疫调控关键节点激素途径和产量性状抗病高产育种基础理论重要数据库分析与发掘腐生菌侵染与表达谱分析重要调控基因鉴定与分析蛋白互作的分子特征与预测重要免疫途径基因调控网络主要农作物重大病害抗病机制为模式的植物免疫创新研究体系（注：本设计为技术流程的主要途径，相互之间有交织）（三）创新性与特色植物免疫与作物抗病性研究是国际植物生物学研究的前沿热点领域，研究的问题复杂、涉及的学科范围和技术方法广、学科发展快、国际竞争大。目前我国在这方面的研究与技术体系与欧美等国家相比，还具有很大的的差距。但是，我国在作物应用基础研究以及相关领域人才队伍建设方面具有明显优势。本项目根据学科发展和本国农作物病害的特点，立足于创新、突出研究重点、发挥自身优势，做出跨越式的发展并提升我国在本领域的研究水平和地位。本项目在以下方面具有创新性和特色：1. 新的总体研究思路。围绕国际学科发展趋势，以系统阐明植物包括重要粮食作物的免疫机理为目标，结合我国转基因新品种培育中抗病分子育种这一重大需求。以作物对重要活体寄生（biotroph）与腐生（necrotroph）病害的免疫应答及其互作为主线，强调顶层设计与整合；建立以我国主粮作物重大病害抗病机制为模式的创新研究体系。2. 从农业生产和学科发展中提炼关键科学问题，创建特色研究体系。本项目紧密结合学科创新和国家重大需求，以我国重要农作物病害抗性为研究重点，借鉴以拟南芥为主要模式的研究方法与研究成果，提出了4个关键科学问题，重点研究作物广谱持久抗性的分子基础；植物抗病性的表观遗传学机制；抗病性与产量性状的关系，及抗病育种分子设计新思路。为此，在相关领域设置了6个相互交叉的研究课题，并把主要研究方向集中在水稻和麦类抗病分子机理，推动以水稻抗病性为主要模式体系的转换，建立我国特色的植物免疫和作物抗病育种基础理论的前沿领域。3. 新的前瞻性研究部署。国际上植物免疫的研究已经进入更高层次的研究领域。本项目密切结合学科发展动向，前瞻性地部署前沿研究领域，重点包括植物基础免疫与专化性免疫的交互作用（cross-talk）、表观遗传机制对于植物免疫的调控功能和新的抗病性研究策略、作物广谱持久抗病性的机制等。尤其是植物免疫的表观遗传机制是植物生物学的新兴研究领域，存在若干重要的科学问题亟待阐明。国际上，包括RdDM途径的表观遗传学研究主要集中在植物自身的开花发育调控和非生物胁迫应答。抗病RNA沉默的研究也主要集中在拟南芥和烟草上。表观遗传机制应答生物胁迫和作物的抗病沉默机制的研究的报导寥寥无几。以植物免疫的表观遗传机制为主线，从模式植物到我国主要粮食作物，结合项目各课题组已建立起来、各具特色的实验体系和工作平台，拓展表观遗传机制调控抗病（病毒、细菌和真菌）应答研究领域。本项目对植物免疫的表观遗传机制的创新研究，将为农作物抗病从理论和应用实践上开辟新的研究体系。4. 利用和创制特色研究材料。为实现项目目标，本项目将广泛收集和创制新型的研究材料，如作物广谱抗病和QTL遗传资源、抗腐生病害遗传资源、抗病基因抑制（suppressor）突变体。并以已经定位克隆的、有自主知识产权的一批重要广谱抗病基因如xa13、Xa30，Pigm、Pid-2、ROD1、OsNPR1、等为研究的重要出发点，紧密结合作物遗传育种，建立作物抗病分子设计的理论、应用基础和共性技术体系。5. 新的技术路线集成。本项目广泛采用组学和复杂性状的研究方法，利用正向、反向遗传学和表观遗传学，并结合生物信息学、蛋白组学、现代生物化学等研究技术，系统剖析作物对重要病原菌的识别机制与应答的信号网络，并整合作物抗病性与产量性状的互作途径，创建抗病分子设计育种体系。尤其将开展水稻抗瘟性复等位基因的簇内重组，创造新的广谱抗病基因位点，在抗病遗传理论与育种实践上都是一个有重大创新意义的课题。6. 新的目标视野。本项目除了要在植物免疫学科领域上创立我国的高水平前沿研究优势，取得系统性的研究成果，同时也要在作物广谱持久抗性尤其是数量性状（QTL）抗性的分子机制、腐生菌（如纹枯病）的抗病基因资源、作物抗病育种的分子设计理论与实践等方面建立国际领先的研究体系与技术平台。创新性研究成果（如水稻广谱抗病性基因）的应用有可能为农作物抵抗类似于水稻纹枯病这样的疑难病害做出重大贡献。从而为推动抗病新策略、新技术的发展提供直接的指导。7. 新的研究队伍建设。依托本项目的实施，将进一步凝练我国在植物免疫和作物抗病分子领域的战略目标，培养一批在专业领域具有高国际显示度的中青年学科带头人，建设具有国际一流水平的创新研究团队。（四）取得重大突破的可行性分析在植物免疫和作物抗病性研究领域，虽然要全面超越国际一流研究水平还要进行长期、艰苦的研究与探索，但是本项目的实施也存在诸多有利因素，其中包括研究资源、研究基础、人才队伍和仪器装备等几方面的有利条件，本项目具备圆满完成预定计划的能力和工作条件。1. 项目有广泛共识：本项目已经经过3年多的筹备，尤其通过2009年5月第349次香山科学会议植物先天免疫机制、2010年2月第9次中国科学院上海交叉学科论坛植物免疫与作物生产，与会专家与项目组骨干进行了广泛的讨论，根据学科的发展与国家农业的重大需求，凝练了关键的科学问题与重点研究方向，研究思路明确，目标集成可行性强。2. 具有丰富的研究资源。我国主要农作物栽培历史长，栽培区域差异大，抗病性资源丰富，并具有较高的抗病育种水平。这为本项目通过功能基因学的方法，研究不同农作物品种抗病分子机理，在以水稻为主的重要农作物的抗病分子机理研究，可以做出创新性和有特色的研究成果。3. 技术路线成熟。近年来植物分子生物学研究飞速发展，拟南芥及水稻基因组已相继完成测序，小麦基因组454高通量序列的丰富，基因定位克隆已经实现日常化。其它相关的平台, 如表观遗传、蛋白组学、表达组学、生物信息学、植物病理学、生物化学、蛋白质相互作用、细胞生物学等现代生物学研究手段均已建立并不断改进。这些成熟的技术平台为顺利开展本项目并完成目标提供了可靠的保障。4. 研究基础较好。通过承担国家863计划、国家基金重大研究计划和重点项目、国家转基因新品种培育重大项目等多项研究的积累，本项目组各个课题已经在科学研究思路、实验材料、研究实验体系、数据分析能力、国际学术交流等方面打下了较好的研究基础。一些前期研究已经处于稳步开展阶段，多个作物主要抗病基因和拟南芥免疫关键调控基因已经克隆，植物表观遗传机制已有重大新发现，为本项目的顺利实施提供了有力保障。项目的实施将依托7个国家和3个部门重点实验室（详见工作条件部分），具有先进的仪器设备和国内一流的工作条件。在植物免疫途径（PTI，ETI）及其互作、植物免疫的表观遗传调控、SAR调控、作物广谱抗病基因的功能机制及其育种应用、水稻抗纹枯病等方面可望有重大的突破性成果。5. 研究队伍具备国际竞争力。本项目组织的骨干队伍集中了国内优势的研究单位，研究方向全面、合理，分别涉及到农作物抗病、真菌病害、细菌病害、病毒病害等本领域重点分支，在多个研究领域如水稻功能基因组学、植物免疫、作物抗病性、病原菌基因组学、表观遗传等方面做出了一系列突破性的研究成果，。在过去数年间，本项目骨干作为第一或通讯作者的多篇研究论文发表于国际重要学术期刊如Cell及其系列, Nature系列, Science, Plant Cell, PNAS, Genome Research, EMBO J, Cell Host & Microbes, PLoS Pathogens，Journal of Virology, Plant Journal, Plant Physiology, Molecular Microbe-Plant Interaction等。具备进行创新研究的团队基础和较强的国际竞争实力。此外，项目组大部分骨干都曾在国际上著名的实验室中从事植物分子生物学和植物病理学工作多年，在国内建立了优秀的实验室，并和国际权威人士建立了良好的交流与合作关系。这些条件均对本项目的开展是一个有力的支持。四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 拟南芥PTI相关突变体的筛选；PRR受体蛋白酵母双杂交库的构建；抗病蛋白系列置换突变体构建与功能分析；水稻抗病蛋白与病原菌效应蛋白基因的克隆。2. Xoo鞭毛蛋白基因/解毒蛋白基因及突变体的克隆；构建Xoo/Xoc鞭毛蛋白等PAMPs编码基因的缺失突变体；构建多个水稻基因变量表达的双元载体；效应蛋白基因转基因；建立纯化EPS天然寡聚体的技术平台以及EPS寡聚体生物活性检测系统。3. 对bir1,snc1,snc2,snc4，mkk1 mkk2这5个组成型抗病的突变体做抑制子筛选；对抑制子进行表型分析及初定位；建立SAR筛选体系，分析SARD1及SARD2的生化功能；拟南芥MEKK1结合蛋白酵母双杂交筛选。4. 利用-ray辐射诱变和EMS化学诱变抗病品种GM4(Pigm)，筛选Pigm基因的抑制因子spi（suppressors of Pigm）；利用体内和体外方法筛选水稻EMS诱变F2群体，获得对Xoo LPS敏感性发生改变的突变材料，创建该突变材料的分离群体并开始进行图位克隆；。建立分离LPS结合蛋白的生物化学标记体系。5. 采用激光显微切割，结合禾谷镰孢活体荧光标记、基因组芯片等，揭示宿主作物细胞在禾谷镰孢侵染中、晚期的动态转录组；研究宿主作物-禾谷镰孢互作细胞学过程；病毒侵染拟南芥，microarray高通量表观遗传途径相关蛋白基因表达检测；抗病TGS蛋白目标基因筛选、及其表达谱检测。6. 建立病毒侵染水稻的研究体系，构建针对水稻RNA干扰途径主要基因的转基因RNAi突变体株系，包括RDR1,RDR6,AGOs,PolIV,PolV,DCL2等；利用酵母双杂交方法，筛选受RDV病毒侵染前后水稻基因表达谱的变化并对其进行生物信息学预测。7. Xoo诱导水稻小RNA的Solexa测序建立miRNA与siRNA表达谱。RNA-seq测序，建立mRNA表达谱。 8. 获得乙烯耐受水稻株系，对多种致病稻瘟病菌进行感病分析；利用MCP处理，分析抗性水稻在丧失乙烯反应后对相应的稻瘟病菌发生的抗性变化；将乙烯耐受基因导入抗性的水稻品种；将造成组成性乙烯反应将有转入感病水稻品种以及抗病水稻品种中，获得相关的组成性乙烯反应水稻材料；分析过表达OsNPR1基因不同株系的抗病性及其它与生长发育有关的表型。9. 完成对Pigm基因的功能鉴定工作；水稻抗ROD基因的克隆；水稻抗白叶枯病基因或QTL的定位；小麦抗锈病QTL的定位工作；抗黄萎病相关基因的定位工作；新型等位基因的克隆：克隆水稻PID3基因以及小麦Yr10、Yr18和Yr36的新型等位基因；小麦EDR1和EDR2基因的获得；10. 构建xa5-Xa21-Pid2-Pid3 聚合载体和Yr10-Yr18-Yr36 聚合载体（自然表达，即使用自身启动子）；开展广谱抗病品种的转基因及分子育种工作，水稻抗病基因的分子标记聚合育种：利用基因标记，将水稻xa5、Xa21、Pid2 和Pid3 基因转育我国超级杂交稻的恢复系亲本93-11和明恢系列的品种；水稻Pigm 与Pi9 基因重组位点的创建；小麦抗条锈病基因的分子标记聚合育种： 利用基因标记，将小麦Yr10、Yr18 和Yr36 基因转育我国小麦主产区品种“济麦19”和“郑麦9023”。1. 分离鉴定PTI途径基因1-2个；分离鉴定ETI途径基因1-2个；克隆病原菌效应蛋白基因1-2个；得到与MEKK1结合的候选蛋白；鉴定抗病蛋白下游组份1-2个；明确植物抗病蛋白结构与功能的关系。2. 明确两种Xoo/Xoc PAMPs突变体对水稻致病性的变化；明确Xoo/Xoc鞭毛蛋白和另外一种PAMPs诱导水稻的防御反应的能力；构建3-5个水稻转基因载体。3. 筛选到5个组成型抗病突变体的相关抑制子；建立SAR筛选体系；完成对SARD1及SARD2的生化功能分析；筛到多个spi感病突变单株。4. 得到宿主作物细胞在禾谷镰孢侵染中、晚期的动态转录组；利用基因组方法分析RDV病毒感染后水稻基因组的变化。5. 明确拟南芥中参与抗病的表观遗传途径相关蛋白；明确Xoo诱导或抑制水稻表达的特异小RNA和mRNA；获得针对RDR2，DCL3，DCL1，DCL4，AGO1和AGO4等的RNAi突变体株系。6. 筛选并获得水稻LPS非敏感型突变体；建立筛选LPS结合蛋白的生化体系并开展筛选工作。7. 分析乙烯对水稻抗抗病性的作用，构建相应的水稻研究株系。8. 构建水稻OsNPR1基因的遗传学研究株系并进行表型鉴定；获得水稻抗ROD基因转基因功能验证材料；定位克隆2个以上水稻抗白叶枯病基因或QTL；发表关于Pigm基因功能的相关论文。9. 精细定位抗锈病QTL；克隆2个抗黄萎病相关基因。10. 获得小麦EDR1 和EDR2 基因各1个；克隆水稻 PID3 和小麦Yr10、Yr18 和Yr36 新型等位基因3-5个。11. 获得一批广谱抗病转基因或分子育种品系；获得1000份携带水稻PID3 或小麦Yr10、Yr18、Yr36 等基因的材料。12. 构建xa5-Xa21-Pid2-Pid3 聚合载体和Yr10-Yr18-Yr36 聚合载体各1个。13. 获得有10万个体的F2 群体，筛选获得鉴定Pigm 和Pi9 基因的菌株2-3个，特异鉴别这两个基因的PCR分子标记2-3个。14. 发表SCI文章10篇左右。15. 申请专利5-6个。第二年1. PTI通路新基因的克隆、鉴定；PRR受体蛋白互作蛋白筛选。2. Xoo鞭毛蛋白/解毒蛋白的分离纯化及生化分析；效应蛋白对宿主信号通路的作用分析；抗病蛋白不同结构域间互作分析，及这种互作与蛋白功能和下游信号通路之间的关系分型；构建大麦表皮细胞富集百分病菌转录本的酵母双杂交cDNA文库的构建。3. 利用图位克隆和高通量测序技术鉴定bir1, snc1, snc2, snc4，mkk1 mkk2的抑制子所在的突变位点；对SAR突变体进行表型分型及初定位；进行MEKK1免疫共沉淀。4. 鉴定BBI1（E3 ligase），OsRAR1,OsNPR1,OsSGT1的感病纯合突变单株,分别与含有Pigm转基因日本晴株系杂交。5. 采用激光显微切割，基因组芯片等，揭示宿主作物细胞在禾谷镰孢侵染早期的动态转录组；分析其免疫应答与作物细胞本身能量、物质代谢途径交叉互作的结点/关键分子；通过转录组学方法筛选活性EPS寡聚体诱导表达的宿主植物基因。6. 进行抗病TGS目标蛋白作用关键靶基因筛选、及其DNA的作用模式分析、同时进行病毒侵染关键靶基因表达谱改变分析；探索病毒侵染对水稻包括miRNA在内的内源RNAs表达的影响。7. 利用生物信息学方法对Xoo侵染水稻获得的小RNA进行分类，预测小RNA的靶基因；mRNA表达谱分析。8. 鉴定及获得带有乙烯耐受基因的抗性水稻株系；分析在阻断乙烯反应后对稻瘟病菌的抗病变化。鉴定及获得组成性乙烯反应的水稻材料株系；分析在组成性乙烯发育水稻株系中，具有抗性或是具有感病性水稻对病原菌侵染的反应及病斑程度。利用microarray等技术，分析OsNPR1基因介导的SAR与生长素信号途径等之间具有cross-talk功能的候选基因。9. ROD基因功能的鉴定工作；水稻抗白叶枯病基因（QTL）的功能鉴定工作；新广谱抗病基因（QTL）的定位工作；抗锈病QTL的定位工作；研究抗黄萎病相关基因。对上年度获得的新型抗病等位基因（PID3、Yr10、Yr18 和Yr36 等），构建自然表达载体并转化到水稻或小麦中；小麦EDR1 和EDR2 同源基因的功能验证。10. 分别将xa5-Xa21-Pid2-Pid3 聚合载体和Yr10-Yr18-Yr36 聚合载体导入水稻品种明恢系列或小麦品种济麦等系列。11. 通过突变、剪切或重组，创建PID3、Yr10、Yr18 或Yr36 基因的新型设计抗病基因；水稻Pigm 与Pi9 基因重组位点的创建；继续水稻xa5、Xa21、Pid2 和Pid3 基因的回交转育；利用基因标记，继续小麦Yr10、Yr18 和Yr36 基因的回交转育。1. 再分离鉴定PTI途径基因1-2个及ETI途径基因1-2个，并明确这些基因的功能。再克隆病原菌效应蛋白基因1-2个，并认识病原效应蛋白基因的功能，分离其植物体内的靶标基因3-5个；鉴定抗病蛋白复合体组份2-3个，明确植物NB-LRR类抗病蛋白分子间的相互作用及对其功能的影响；找到bir1, snc1, snc2, snc4，mkk1 mkk2的抑制子基因3-4个。2. 明确水稻OsFLS2对鞭毛蛋白的感知能力；获得涉及2个基因的变量表达的突变体株系；构建获得2个水稻病原菌诱导表达的cDNA文库。3. 初步定位1-2个SAR突变体；解析MEKK1结合蛋白；初步建立鉴定Pigm的抗病防卫反应基础信号网络体系。4. 得到宿主作物细胞在禾谷镰孢侵染早期的动态转录组；揭示其与作物细胞本身能量、物质代谢途径交叉互作的结点/关键分子。5. 明确病毒-参与抗性TGS目标蛋白-靶基因DNA甲基化的作用三者互作关系和调控模式；得到一整套针对水稻RNA干扰途径主要基因的稳定的RNAi突变体株系。6. 对LPS受体基因进行遗传和物理定位；构建候选LPS结合蛋白的水稻遗传学研究株系。7. 分析乙烯反应被阻断后对水稻抗病性的影响及相关表型变化。8. 鉴定与RDV P2蛋白互作的水稻蛋白并分析其可能的生化功能。9. 筛选并获得水稻OsNPR1基因调控的信号途径下游成分并对其进行遗传分析。10. 完成ROD基因功能鉴定工作；完成水稻抗白叶枯病基因（QTL）的功能鉴定；获得Pigm/ROD的supprosser的稳定突变；定位克隆一个抗锈病QTL；11. 分别获得4-10个xa5-Xa21-Pid2-Pid3 或Yr10-Yr18-Yr36 阳性的转基因株系4-10个 。12. 创建PID3、Yr10、Yr18 或Yr36 基因的新型设计抗病基因2-5个。13. 筛选5万个F2 个体，获得 Pigm 和Pi9 重组的F2 单株2-3株。14. 发表SCI文章10-12篇。15. 申请专利7-8个。第三年1. PTI通路新基因的生化和分子生物学分析；PRR受体蛋白互作蛋白的功能鉴定。2. Xoo鞭毛蛋白/解毒蛋白的糖基化分析及表型分析；效应蛋白靶蛋白的分离鉴定；抗病蛋白互作蛋白的筛选；抗病基因和无毒基因互作的分子机制研究。3. 对bir1, snc1, snc2, snc4, mkk1 mkk2这5个突变体做进一步的抑制子筛选，克隆更多的基因；利用图位克隆和全基因组测序技术筛选到SAR突变体的突变位点；MEKK1结合蛋白及FLS2介导的磷酸化蛋白的功能验证; 水稻MAPK突变体，RNAi植株纯合及抗病分析。4. 利用图位克隆的方法鉴定spi基因。分析LPS结合蛋白和LPS受体在病原识别和植株发育过程中的功能。5. 综合运用各种生物手段具体研究禾谷镰孢应答基因在植病互作中起重要作用；用不同的EPS寡聚体处理宿主植物，接种病源菌，观察其侵染能力的变化。6. 构建关键靶基因过表达和敲除突变体，并进行病毒侵染性的分析；研究水稻RNA干扰途径对病毒侵染的抵抗作用；实验验证小RNA与潜在靶标的调控关系；在水稻dcl4突变体中受Xoo诱导的水稻小RNA的表达是否依赖dcl4基因。7. 利用RNAi和过表达方法对SA与生长素途径之间具有重要作用的基因进行分析，阐明其遗传学功能。8. 继续ROD基因研究工作；水稻抗白叶枯病基因（QTL）的功能鉴定，克隆2个新的广谱抗病基因（QTL）；Pigm/ROD的supprosser突变基因的定位工作；新的抗锈病QTL的定位；继续克隆抗黄萎病相关基因。利用携带新型等位基因（PID3、Yr10、Yr18 和Yr36 等）的转基因植株，确定转基因在受体基因组的整合和表达模式；小麦EDR1 和EDR2 同源基因的功能验证。9. 评价xa5-Xa21-Pid2-Pid3 聚合载体对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性特征；评价Yr10-Yr18-Yr36 聚合载体对小麦条锈病的抗性特征。利用突变、剪切或重组等手段获得的新型PID3、Yr10、Yr18 或Yr36 基因，构建各自的自然表达载体并转化到水稻品种明恢系列或小麦品种济麦等系列；水稻Pigm9 新位点的功能评价。10. 利用基因标记，继续水稻xa5、Xa21、Pid2 和Pid3 基因的回交转育。11. 利用基因标记，继续小麦Yr10、Yr18 和Yr36 基因的回交转育。1. 认识PTI途径相关基因编码蛋白的生化和分子生物学特性；明确ETI途径相关基因编码的抗病蛋白的生理生化特性；明确病原菌效应蛋白靶标基因的功能及分子特性。2. 克隆1-2个新的bir1, snc1, snc2, 等的抑制子基因。3. 明确1-2个RLKs、 WRKYs或ERFs在水稻抗病性中的作用；筛选获得一批与RLK、WRKY或ERF互作的候选蛋白；初步确定PTI中受调控的基因。4. 确定1-2个SAR突变体的突变位点；解析连接MEKK1与PRR受体FLS2的蛋白组份。5. 克隆到1个Pigm的抑制子spi。6. 明确3-5个在宿主作物-禾谷镰孢互作中起作用的重要基因；初步揭示活性EPS寡聚体对宿主植物抵抗病源菌入侵的作用；明确靶基因对病毒侵染的应答效应，及其参与的抗性途径机制和调控作用。7. 找出参与抗病毒的水稻关键的RNA干扰途径的主要组份；明确候选小RNA的靶标基因，及Xoo诱导的水稻小RNA是否依赖RNA沉默途径。8. 分析候选水稻LPS受体及结合蛋白的功能及在病原识别和发育调控中的分子功能。9. 对乙烯途径与水稻抗稻瘟病反应中的关键基因进行功能分析。10. 研究P2蛋白影响GA合成途径的关键因子及影响机制。11. 分析OsNPR1介导的SA与生长素途径之间的crosstalk及关键因子功能；发表关于ROD基因研究工作的论文；发表水稻抗白叶枯病基因（QTL）功能相关的论文；克隆2个新的广谱抗病基因（QTL）；克隆至少一个Pigm/ROD的supprosser突变基因；克隆一个新的抗锈病QTL。12. 确定 EDR1 和EDR2 转基因在受体基因组的整合和表达模式；获得具有新型抗性特征的基因1-2个；确定多基因聚合载体在受体基因组的整合和表达模式； 确定多基因聚合载体赋予受体植株的抗病特征。13. 筛选5万个F2 个体，获得 Pigm 和Pi9 重组的F2 单株2-3株；获得Pigm9 位点纯合的单株2-3个。14. 发表SCI收录论文18-24篇。15. 申请专利10-12项。第四年1. PTI通路新基因在植物抗病途径信号传导途径中作用及位置分析；PRR受体蛋白互作蛋白下游信号通路研究。2. Xoo鞭毛蛋白/解毒蛋白作用及机制分析；效应蛋白靶蛋白的功能分析；抗病蛋白互作蛋白的功能鉴定及分子生物学研究；抗病基因和无毒基因互作的分子机制研究。3. 荧光互补与免疫共沉淀研究PTI基因网络中至少2个蛋白间的相互作用；构建从酵母双杂交或免疫沉淀筛选到PTI基因网络中的重要组分的过量表达与RNAi转基因植株，人工接种鉴定其抗病性。4. 利用酵母双杂及免疫共沉淀技术，寻找其他参与R蛋白下游传导的蛋白及其他参与SAR下游传导的蛋白；深入解析MEKK1结合蛋白、FLS2介导的磷酸化蛋白的功能。水稻MAPK上下游蛋白元件分析。5. 从蛋白生化反面分析Pigm与OsSGT1，BBI1，OsRAR1，OsNPR1是否存在互作，结合遗传的数据，建立Pigm的基础抗病防卫反应网络。6. 采用激光显微切割，基因组芯片等，揭示宿主作物细胞在活体/半活体病原侵染早期的动态转录组；通过分离、纯化获得活性寡聚体；应用分离到的活性EPS寡聚体处理拟南芥，接种丁香假单胞菌。7. 进行病毒侵染前后靶基因相关siRNA northern blot、测序检测；靶基因DNA甲基化测序、Southern blot检测和信息学分析；和上述在目标突变体的研究结果相比较，研究突变体和病毒侵染对靶基因甲基化改变的相关性；根据第1-3年的研究结果进一步研究RNA干扰的作用机理及其在抗病毒中的作用；利用过表达人工miRNA等转基因方法对2-3个水稻小RNA介导的抗病反应进行验证。8. 阐明LPS结合蛋白和LPS受体的信号转导途径及其与细菌表面分子相互作用的功能机制，建立病原信号识别与发育之间的联系途径；鉴定及获得上述转基因水稻株系，分析其对病原菌抗病或是感病的变化，对上述水稻材料分别进行乙烯和MCP处理，揭示在该相关基因表达背景下，乙烯与MCP的作用对于感病过程是否依然重要。9. 阐明病毒侵染与植物GA信号途径之间的分子互作关系。10. 利用转基因手段对抗病及激素cross-talk通路进行设计和改造，培育既增强抗性，又不影响生长发育的水稻株系；完成2个水稻抗白叶枯病基因（QTL）的工作；新广谱抗病基因（QTL）的功能鉴定工作；Pigm/ROD的supprosser突变的功能鉴定工作；完成抗锈病QTL研究；抗黄萎病相关基因的研究。11. 在课题执行过程中发掘或创建的新型抗病基因，包括等位基因（PID3、Yr10、Yr18 和Yr36 等）、同源基因（EDR1 和EDR2）、和新型抗病位点（Pigm9）等，开展有关基因之间的聚合转化和分子标记聚合育种，结合抗病评价，获得高抗水稻稻瘟病、小麦条锈病或小麦白粉病的株系；水稻Pigm9 新位点的功能评价及应用。 12. 利用携带xa5-Xa21-Pid2-Pid3 或Yr10-Yr18-Yr36 聚合载体并呈现新型抗病特征的转基因植株，综合评价多基因的聚合表达对受体产量和品质等性状的影响。13. 利用携带新型设计基因（PID3、 YR10、YR18 或YR36）的转基因植株， 确定转基因在受体基因组的整合和表达模式，开展对水稻抗病病或小麦抗病评价。14. 利用基因标记，开展水稻回交转育过程的四亲本双交（具有相同回交亲本的个体之间），获得同时携带xa5、Xa21、Pid2 和Pid3 基因的杂合种子。15. 开展小麦回交转育过程的三亲本双交（具有相同回交亲本的个体之间），获得同时携带 Yr10、Yr18 和Yr36 基因的杂合种子。1. 明确PTI途径相关基因在植物PTI信号传导途径中的位置及作用；明确ETI途径相关基因编码的抗病蛋白的下游靶标基因，确定其在ETI信号传导途径中的作用；确定病原菌效应蛋白靶标基因的识别机制及其激活下游信号传导的途径及机制；确定植物抗病蛋白抗病复合的组分，明确植物抗病蛋白的作用机制及信号传导机制；确定R蛋白下游传导的蛋白与已知蛋白的关系；明确水稻PTI途径中至少2个关键组分间的互作关系；明确至少一个PTI中关键组分在植物免疫中的功能。2. 找到SAR信号通路相关分子；确定新蛋白与已知蛋白的关系；阐明一个完整的参与抗病的MAPK蛋白激酶级联。3. 筛选验证Pigm互作蛋白。4. 得到宿主作物细胞在活体/半活体病原侵染早期的动态转录组；建立体外酶促产生苜蓿根瘤菌EPS胞外寡聚体的技术方法。5. 明确病毒侵染改变靶基因siRNA和DNA甲基化是病毒干扰表观遗传途径的作用结果。6. 获得具有潜在育种前景的水稻材料或株系2-3个。7. 阐明LPS受体及结合蛋白作用的功能机制，建立病原识别及生长发育调控之间的功能联系。8. 进一步阐明乙烯在水稻抗稻瘟病中的功能及与产量性状之间的关系。9. 阐明病毒侵染与植物GA信号途径之间的分子互作关系；对水稻SA途径及生长素途径之间发挥重要作用的信号基因及蛋白进行功能机制分析；发表水稻抗白叶枯病基因（QTL）的相关论文；完成新广谱抗病基因（QTL）的功能鉴定；完成Pigm/ROD的suppross er突变的功能鉴定；发表抗锈病QTL研究的相关论文。10. 设计另外两套多基因聚合转化或分子标记聚合育种的模式；获得高抗水稻稻瘟病、小麦条锈病或小麦白粉病的株系5-10个；获得新的Pigm9 抗病位点2-3个；用以改良感病高产水稻品种10个。11. 确定多基因转化的聚合表达对小麦产量和品质等性状的影响；确定新型设计基因在受体基因组的整合和表达模式；获得具有新型抗性特征的设计基因1-3个。12. 获得同时携带xa5、Xa21、Pid2 和Pid3 基因的水稻杂合种子。13. 获得同时携带 Yr10、Yr18 和Yr36 基因的小麦杂合种子。14. 发表SCI收录论文20-24篇。15. 申请专利8-10项。第五年1. 构建植物PTI调控网络；明确PRR受体蛋白及互作蛋白的信号传导途径。2. 明确Xoo鞭毛蛋白/解毒蛋白的作用机理；明确抗病蛋白识别效应蛋白并激活下游信号传导通路的机制；明确抗病蛋白抗病复合体的作用机制及下游信号传导机制；解析抗病基因和无毒基因互作的分子机制。3. 利用遗传学分析把筛选到的基因和已知基因做上下位分析，把基因放在信号通路的特定结点上。初步建立R蛋白介导的病原菌免疫反应的信号网络。鉴定至少1个转录因子的顺式元件，验证功能；定点突变与区域置换研究受体蛋白的结构与功能的关系；评价所研究的基因资源在植物抗病育种中的应用价值。4. 通过生物化学手段阐明SAR过程中重要组分的生化功能；研究FLS2下游的信号传递元件在其它不同PAMP识别中的作用。水稻MAPK上下游蛋白元件分析。5. 构建spi的超表达，分析其抗病功能。6. 腐生病原菌同活体寄生病原菌的免疫反应比较，鉴定共同的节点基因。7. 通过转录组学方法筛选活性EPS寡聚体诱导表达的拟南芥基因。8. 提出病毒干扰植物表观遗传途径的作用机理，和作用模式，及水稻参与抗病表观遗传机制；探讨Xoo 参与水稻RNA沉默的分子机制。9. 继续完成有关广谱抗病基因的工作；重点于广谱抗病品种的育种应用；继续开展有关抗病基因之间的聚合转化和分子标记聚合育种，结合抗病评价，获得高抗稻瘟病、小麦条锈病等病害的株系，同时考察高抗聚合株系产量和品质等重要性状；水稻Pigm9 新位点的应用：考查Pigm9 改良株系新品系的田间性状。10. 对于携带xa5-Xa21-Pid2-Pid3 或 Yr10-Yr18-Yr36 聚合载体的转基因水稻或小麦，继续评价多基因的聚合表达对植株抗病、产量和品质等性状的影响；创制高抗高产优质的水稻和小麦新种质。11. 获得在相同回交亲本背景下携带纯合xa5、Xa21、Pid2 和Pid3 基因的水稻株系，开展抗病特征分析以及对产量和品质等重要性状的评价；并用以创制高抗水稻白叶枯病和稻瘟病的新种质。12. 获得在相同回交亲本背景下携带纯合Yr10、Yr18 和Yr36 基因的小麦株系，开展抗病特征分析以及对产量和品质等重要性状的评价；并用以创制高抗小麦条锈病的新种质。13. 根据情况整理上述工作结果，完成补充实验，准备论文发表和课题结题报告。1. 建立植物PTI信号传导通路；建立作物ETI模式系统；明确植物PTI与ETI途径间的交互作用。2. 确定筛选到的抑制子的通路定位；鉴定一个转录因子的顺式元件；初步了解受体蛋白的结构与功能的基础；确定以上所研究基因在育种中的应用价值；确定SAR过程中重要组分的生化功能；建立spi调控Pigm的信号转导模型。3. 提出综合改善植物抗病性的新思路和方法。4. 在新的层面明确病毒和寄主互作机制；和表观遗传调控途径的抗病新机制；期望获得抗12个流行水稻病毒的转基因株系；明确水稻RNA沉默参与抗细菌的新功能。5. 建立水稻抗病性与激素调控途径之间相互关系的基本理论框架。6. 创制高抗水稻白叶枯病、稻瘟病或小麦条锈病，产量和品质性状优良的新种质5-10份。7. 获得Pigm9 改良的水稻高抗高产优良品系23个。8. 明确多基因聚合转化对抗病、产量和品质等性状的影响；创制高抗高产优质的水稻和小麦新种质10-15份。9. 阐明xa5、Xa21、Pid2 和Pid3 基因杂交聚合赋予受体水稻的抗病特征及其对产量和品质等性状的影响；创制高抗水稻白叶枯病和稻瘟病的新种质10-15份；阐明Yr10、Yr18 和Yr36 基因杂交聚合赋予受体小麦的抗病特征及其对产量和品质等性状的影响；创制高抗小麦条锈病的新种质10-15份；初步建成水稻和小麦抗病分子设计模式体系。10. 发表SCI文章24-26篇。11. 申请专