若干辣椒防御反应相关基因转化烟草及转基因植株的获得-硕士论文

研究方向： 研究 生： 指导教师： 蔬菜生物技术 奎藏 J ，、 何水林教授 完成时间：二O 一0 年四月 C a t e g o r yC o d e ： S e c r eD e g r e e ： C o l l e g eC o d e ：1 0 3 8 9 S t u d e n t - N u m b e r ：10 7 0 610 M S T h e s i so fF u j i a nA g r i c u l t u r ea n dF o r e s t r yU n i v e r s i t y S o m eD e f e n s eR e s p o n s eG e n eo f P e p p e ri nT r a n s f o r m i n gT o b a c c oa n d G o tT r a n s g e n i cT o b a c c oP l a n t s C l a s so f D i s c i p l i n e ：A g r o n o m y F i r s tG r a d eD i s c i p l i n e ：H o r t i c u l t u r e S e c o n dG r a d eD i s c i p l i n e ：O l e r i c u l t u r e R e s e a r c hf i e l d ：V e g e t a b l eB i o t e c h n o l o g y P o s t g r a d u a t e ：L iY a n S u p e r v i s o r ：P r o f S h u i L i nH e S u b m i t t e dt i m e ：A p r i l ，2 010 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 1 3 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 意奠奠日期：加f 。6 、f 指导教师亲笔签名：胁 日期：列玑6 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 目录 摘要1 A b s t r a c t 2 一前言3 1 前人研究进展和存在的问题3 1 1 简述植物防御反应与转录因子的概念4 1 1 1 植物防御反应4 1 1 2 转录因子的概念及结构类型4 1 2 W R K Y 转录因子家族研究进展4 1 2 1W R K Y 转录因子家族的结构特点4 1 2 2W R K Y 转录因子的调控功能5 1 2 2 1W R K Y 转录因子对自身表达的调节作用6 1 2 2 2W R K Y 转录因子在植物防御反应及其在信号转导中的作用7 1 2 2 3W R K Y 转录因子对植物发育和物质代谢的调节作用9 I 3D R E B 转录因子的研究进展9 1 3 1D R E B 转录因子的结构特点9 1 3 2D R E B 转录因子的调控功能10 1 3 3D R E B 转录因子在逆境应答中的作用一l0 2 目前存在的的问题l l 3 研究目的和意义l2 二材料与方法- l3 l 实验材料1 3 2 试验方法一l3 2 1 设计W R K Y 基因的引物及扩增目的基因一1 3 2 2 利用G e t w a y 克隆技术构建植物超表达载体一l3 2 2 1 纯化a n B P C R 产物13 2 2 2 入门载体和目的载体的准备。1 4 2 2 3 相应植物超表达在的的农杆菌转化及P C R 鉴定16 3 转化烟草17 3 1 转基因苗的获得1 7 3 2 转基因苗的鉴定l8 三结果分析1 9 l 载体构建1 9 1 1 扩增W R K Y 目的基因一l9 1 2B P 反应结果1 9 1 3L R 反应获得表达载体2 0 2 农杆菌检测2 l 2 1 农杆菌P C R 检测2 l 2 2 转基因苗的分子检测2l 2 2 1D N A 提取结果2l 2 2 2P C R 分子检测2l 2 2 3R N A 提取和R T - P C R 检测2 2 四讨论2 3 4 1D R E B 转录因子在响应渗透胁迫中的可能作用及后续研究2 3 4 2 烟草遗传转化中存在的问题2 3 4 3 烟草转基因植株假阳性检测过程中存在的问题2 4 4 4 烟草转基因受体材料的选择2 4 4 5B P 、L R 反应中存在的问题及操作优化2 5 参考文献2 5 附录1 缩略词及英汉对照3 4 附录2 主要实验仪器3 5 附录3 试验所用主要试剂3 6 附录4M S 基本培养基配方3 7 附录5 实验所需缓冲液及试剂的配制3 8 附录6D H 5 a 感受态细胞制备及转化过程3 9 附录7 本文涉及M a r k 图谱4 0 附录8 本文涉及的质粒图谱4 1 附录9T r i z o i 法提取烟草叶片R N A 4 2 致谢4 3 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 摘要 辣椒( C a p s i c u mo n ，7 u u m ) 是容易发生病害的茄科作物，病害的发生常导致 产量和品质的降低。在提高植物对逆境的抗性，改善病虫害的危害方面目前常用 的方法主要以喷施农药，化学防治为主，但是化学防治为环境带来长期的危害， 对人体健康产生严重威胁。开展辣椒防御反应的功能基因组学研究是进一步阐明 辣椒抗逆分子机制，促进其抗逆遗传改良的重要基础性工作。本研究在实验室前 期研究的基础上，选择可能在辣椒抗逆防御反应中起重要调节作用的4 个 C a W R K Y 候选基因及1 , b C a D R E B 候选基因的表达载体，应用农杆菌介导的遗传 转化方法转化烟草，分别获得其转基因植株，并对转基因植株进行了鉴定。主要 结果如下： l 、构建获得了5 个候选基因的转化载体； 2 、利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，分别获得W R K Y l 、W R K Y 2 、 W R K Y 3 、W R K Y 4 及D R E B 载体各2 9 、1 6 、2 0 、1 5 、1 5 株转基因烟草 植株。并分别对上述转基因植株进行了P C R 验证。 以上结果为进一步通过在烟草中超表达分析上述4 个辣椒W R K Y 候选基因 和辣椒D R E B 候选基因的功能奠定了基础。 关键词：转录因子：C a W R K Y ；C a D R E B ；遗传转化；烟草红花大金元 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 A b s t r a c t P e p p e r ( C a p s i c u ma n n u u m ) i sb e e ne a s y - i n f e s t e d i nS o l a n a c e a ec r o p s ，t h e o c c u r r e n c eo fd i s e a s eo f t e nl e a d st or e d u c e dy i e l da n dp o o rq u a l i t y I nr a i s i n gt h e r e s i s t a n c eo fp l a n ts t r e s s ，i m p r o v ep e s ta n dd i s e a s eh a z a r d s ，a tp r e s e n tm a i n l yb a s e d o nc h e m i c a lc o n t r 0 1 b a s e dm e t h o dt oc h a n g i n gi t ，b u ti th a sl o n g t e r mh a r mt o e n v i r o n m e n t ，as e r i o u st h r e a tt oh u m a nh e a l t h P e p p e rd e f e n s er e a c t i o nc a r r i e do u t f u n c t i o n a lg e n o m i c ss t u d i e si st of u r t h e rc l a r i f yt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m so fs t r e s s r e s i s t a n c e p e p p e r , t op r o m o t e t h e i rr e s i l i e n c ea l l i m p o r t a n t b a s i s f o r g e n e t i c i m p r o v e m e n tw o r k T h i ss t u d y , p r e l i m i n a r ys t u d i e si nt h el a b o r a t o r y , b a s e do nt h e c h o i c em a yr e s i l i e n c ei nt h ed e f e n s er e s p o n s eo fp e p p e rp l a y sa l li m p o r t a n tr e g u l a t o r y r o l eo ft h ef o u rW R K Yc a n d i d a t eg e n e sa n dac a n d i d a t eg e n eD R E Be x p r e s s i o n v e c t o r , t h ea p p l i c a t i o n o f g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nb yA g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o nm e t h o dt o b a c c o ，r e s p e c t i v e l yo fi t st r a n s g e n i cp l a n t s ，a n dt r a n s g e n i e p l a n t sw e r ei d e n t i f i e d M a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 、Ac o n s t r u c to b t a i n e df o u rc a n d i d a t eg e n e so ft h et r a n s f o r m a t i o nv e c t o r 2 、U s i n gt h em e t h o do f A g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o nw e r eg i v e nt h e a b o v e m e n t i o n e d ，g e t st h ef i v ec a r r i e r st r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t sn u m b e ri s ：2 9 、1 6 、 2 0 、l5 、15 R e s p e c t i v e l y , t h e s et r a n s f o r m e dp l a n t sw e r eP C R v a l i d a t i o n T h e s er e s u l t sf u r t h e rb ye x p r e s s i o na n a l y s i si nt o b a c c oS u p e rW R K Yt h e s ef o u r c a n d i d a t eg e n e s ，a n dc h i l ip e p p e r sD R E Bf u n c t i o no fc a n d i d a t eg e n e sl a i d t h e f o u n d a t i o n K e y w o r d s ：t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s W R K YD R E B g e n et r a n s f o r m a t i o n T o b a c c o 2 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 一、日盯青 1 、前人研究进展和存在的问题 1 1 简述植物防御与转录因子的概念 1 1 1 植物防御反应 植物生长在千变万化的自然界中，受到很多逆境的影响，如调节生长发育和 对逆境的诱导反应等【1 捌，在自然选择的过程中植物也对各种环境因子做出积极 的应答。植物主要通过防御反应基因的转录激活与抑制从而应对外界环境的变化 及进行防御反应【2 1 。在外界环境刺激之下，通过一系列信号网络转导过程，最终 诱导植物防御反应相关基因的表达。而在自然选择过程当中，转录因子通过与其 它相关蛋白之间的相互作用从而激活或抑制防御基因的转录，进而调控下游基因 的表达最终导致植物生理生化上的变化，在植物应答环境刺激过程中起着重要的 作用【l 2 3 1 。 1 1 2 转录因子的概念及结构类型 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，T F ) 也称为反式作用因子，即D N A 结合蛋白， 能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性相互作用，或者是具有已 知D N A 结合域结构特征的蛋白质分子。当植物感受外界如干旱、高盐、病害等 因素刺激时，通过一系列信号传递，激活或抑制转录，启动特定基因的转录表达， 最终通过基因产物的相互作用对内、外界信号做出的调节反应【4 】。 研究表明在拟南芥中，至少存在1 5 3 3 个编码转录因子的基因，约占基因总数 的5 9 5 【5 1 。运用蛋白结构分析，发现典型的转录因子D N A 结合区( D N Ab i n d i n g d o m a i n ) ，转录调控区( t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o nd o m a i n ) ( 包括激活区和抑SJ J 区) 、寡 聚化位点( o l i g o m e r i z a t i o ns i t e ) 以及核定位信号( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ，N L S ) 这 四个功能区域组成，但是不同的转录因子可能不具备某一功能域比如核定位信号 或者是寡聚化位点【5 1 。转录因子通过这些功能区域与目标基因中顺式元件相互作 用或通过寡聚化位点与其他转录因子的功能区域相互作用而调控基因的表达。研 究表明其中与植物胁迫反应有关的转录因子家族主要有：A P 2 E R E B P 、b Z I P 、 W R K Y 、M Y B 等【6 。 1 2W R K Y 转录因子家族的研究进展 福建农林大学2 0 10 届硕士毕业论文 W R K Y 是最近在植物中发现的一类锌指型转录因子，最早是从甜薯中发现 【刀，随后陆续在其他植物中发现了大量的W R K Y 转录因子【4 5 一。其蛋白高级结 构中含有保守的6 0 个氨基酸的W R K Y 结构域，在此结构域中N 端含有极为保守的 W R K Y G Q K 氨基酸序列而被命名为帆K Y 转录因子【6 】。几乎所有的W R K Y 蛋白 与W 盒( W - b o x ) ( ( T ) ( T ) T G A C ( C f f ) ) 都具有结合特性，而该结合性更多的存在于与 衰老、抗病、损伤相关基因和水杨酸诱导基因的上游调控区域中，通过一系列相 互作用从而调控靶基因的表达【7 J 。 1 2 1W R K Y 转录因子家族的结构特点 W R K Y 蛋白结构最主要的特征即每个成员都至少含有一个高度保守，由6 0 个氨基酸组成的锌指结构，其N 端具有高度保守的W R K Y G Q K 七肽区域，但该氨 基酸序列并非一成不变的。近来研究表明，该N 端七肽区域通常由Q 突变为E ( 谷 氨酸) 或K ，如在水稻中Q 在大多情况下变成E 或K ，R 变成I 、K 或S ，这些变异往 往会导致W R K Y 蛋I 刍D N A 结合活性的丧失或减弱【7 1 。而在其C 端是由一个 C 2 H C ( 组成模式为C X 7 C X 2 3 H X 1 C ) 或C 2 H 2 ( 氨基酸的组成模式为 C X 4 - 5 - C X 2 2 2 3 - H X l - H ) 的锌指结构组成，该结构也可能会发生一些变异【2 , 3 , 6 】。 W R K Y 域的另一个特征是均有内含子插入的保守位点【7 1 ，其存在的意义可能是参 与调节转录后力n i t T 。按照W R K Y 结构域的数目及锌指结构的类型将W R K Y 蛋 白分为三类：I 类W R K Y 蛋白具有两个W R K Y 结构域，其C 端的W R K Y 域具有 结合D N A 的能力，而N 末端W R K Y 区单独不能与D N A 结合【6 7 ，引，但是N 端的 W R K Y 结构域功能尚不清楚，可能会增强转录因子与目标序列结合的亲和性与识 别特异性，这类W R K Y 蛋白如S P F l 7 1 、Z A P l 8 、P c W R K Y l 9 1 及烟草中的N t W R K Y 7 以及辣椒中的C a W R K Y 等。I I 类和I 类都只含有一个W R K Y 结构域( H I 类中除 O s W R K Y 9 3 ，O s W R K Y 9 4 有2 个W D 夕b ) ，但它们的锌指结构不同，锌指类型为C 2 H 2 型的为I I 类，锌指类型为C 2 H C 型的为I 类【1 0 】。多数W R K Y 转录因子属于I I 类， 只包含一个W R K Y 域，如P c 2 W R K Y 4 、P c W R K Y 3 、A f A B F 2 和N t W I Z Z 等；I 类W R K Y 转录因子只在高等植物中存在，能响应多种生物胁迫反应【l ，如 M W R K Y 4 、N t W R K Y 5 和凡W R K Y 5 等。极少数彳f W R K Y 蛋白不好归于上述三类。 如A t W R K Y l 0 ，只具有一个W R K Y 结构域，但其更接近于第1 类蛋白【1 2 】。 W R K Y 蛋白质能够通过特异地与靶基因启动子区域的W 盒或S U R E ( s u g a r 4 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 - r e s p o n s i v ee l e m e m ) 结合而实现其分子生物学功能【1 2 , 1 3 】。W 盒即( T ) ( T ) T G A c ( C T ) 序列，各种W 盒中均包含不变的T G A C 核心序列，这对于行使W 框的功能以及 与W R K Y 蛋白的特异结合是必须的；同时，Z n 2 + 等金属离子的参与和磷酸化作 用等也利于W R K Y 转录因子与W 盒的结合【14 1 。W 盒常成簇存在于启动子序列中， 主要用于启动与损伤、抗病、衰老等相关基因的表达，W R K Y 转录因子参与植物 生物与非生物胁迫的应答【15 1 。 W R K Y 蛋白高级结构具有另一个重要的特征是在其W R K Y 结构域中含有位 置高度保守的内含子【1 6 17 1 ，如水稻W R K Y 结构域中具有R 型( 属p h a s e 2 内含子) 和V 型( 属p h a s e 0 内含子) 两种内含子。而在其他一些W R K Y 中不含有内含子， 比如水稻的W R K Y 3 、W R K Y 8 、W R K Y 2 0 、W R K Y 5 3 和拟南芥的W R K Y 5 3 、 W R K Y 6 2 、W R K Y 6 5 等，内含子的丧失是W R K Y 基因进化过程中的重要事件【1 8 】。 内含子存在的作用不是很明确，其可能暗示着这类转录因子存在转录后加工的调 节作用【18 1 。 1 2 2W R K Y 转录因子的功能 矾肽滕录因子的精确网络调控机能并不是特别的清楚，但研究结果表明 W R K Y 转录因子广泛地参与植物对生物与非生物胁迫诸如高盐、低温、干旱、损 伤等的防御应答反应及与植物新陈代谢、植物衰老、果实成熟及种皮和毛状体发 育等相关的一系列生理活动【1 9 】。 1 2 2 1W R K Y 转录因子对自身表达的调节作用 形肽躇白同W 盒的特异结合性使得所有启动子中含W 盒的基因都可能成为 它们的靶基因，包括W R K Y 基因自身【2 0 1 。W R K Y 基因表达往往发生在诱导发生 的早期，且一般不需要蛋白质的重新合成，因为蛋白质合成抑制剂环己亚胺对 W R K Y 的合成不具抑制作用。大多数的W R K Y 转录因子对目的基因的表达具有 正调节作用，但也部分存在着抑制作用如在拟南芥中A t W R K Y 6 对W R K Y 4 2 及 自身的表达起抑制作用【2 。以爿f 凇K 场基因的启动子驱动G U S 报告基因在超表 达的C a M V 3 5 S ：W R K Y 6 原生质体中检测不至U G U S 活性，而在基因敲除的W R K Y 突变体中则发现了报告基因的表达。这种自身抑制作用可能是W R K Y 6 与其他转 录调节因子竞争或相互干扰的结果，因为如果再将个活性更强的转录调节因子 V P l 6 引入上述转基因体系中，贝J A t W R K Y 6 的抑制作用完全消失，并且w 盒对这 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 一逆转过程也是必须的【2 2 】。 1 2 2 2W R K Y 转录因子在植物防御反应及信号网络转导中的作用 植物生长在千变万化的自然环境中，通过长期的自然选择及自身进化，至少 形成了两套生化防御体系用以抵御外界刺激伤害。一套防御反应是由外来生物侵 袭而引起的，如由病原菌的侵染而引发，通过产生局部过敏反应而封闭损伤位点 达到自我保护的目的以预防病原菌的进一步侵染，即系统获得性抗性( S y s t e m i c A c q u i r e dR e s i s t a n c e ，S A R ) ；另一套防御反应主要是植物表现出对生物胁迫的抗 性，即通过各种信号分子激活植物体内防御基因的表达【2 3 2 4 1 。研究表明各种生物 和非生物胁迫可诱导W R K Y 转录因子的表达，参与植物的胁迫应答反应。 W R K Y 蛋白在防御反应信号转导途径中“基因对基因”理论的诞生【1 1 , 2 5 】， 揭开了植物对病原体防御反应分子机制研究的序幕。大量研究显示虽然防御基因 的转录表达在抵抗病害危害的过程中起关键作用，但是能直接证明W R K Y 蛋白 参与此过程的证据还是很有限的，其作用机制还远不清楚。当W R K Y 蛋白参与 植物M A P K ( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，M A P K ) 信号传递过程这一事实被发 现，则证明W R K Y 蛋白在抵抗病害危害中起到一定的作用【l2 1 。M A P K 是近年来 被广泛研究的信号转导分子，其将外界信号逐步放大并传递到细胞内，引起生理 生化反应的过程是通过一系列的磷酸化反应而实现的【2 6 1 。在植物体内有3 种类 型的M A P 激酶，即M A P 激酶( M A P K ) 、M A P K 激酶( M A P K K ) 和M A P K K 激酶 ( M A P K K K ) ，构成M A P 激酶级联反应( c a s c a d e ) 。在拟南芥中已发现了2 0 种 M A P K 、1 0 种M A P K K 和6 0 种M A P K K K 的编码基因0 3 , 14 】。M A P 级联可参与多 种信号转导途径1 3 ，1 4 27 1 ，M A P 激酶级联反应受病原体及其诱发因子、水杨酸 等的激活【2 8 ，2 9 1 。A s a i 等例研究发现M A P 激酶通过一系列的磷酸化反应，可能使 W R K Y 蛋白特异的抑制剂失活，从而激活W R X r 基因表达。活化的W R K Y 因子 作为其它调节基因( ! 1 1 N P R l ) 的激活剂，参与抗病信号转导，最终导致防御反应蛋 白( P a t h o g e n e s i sr e l a t e dp r o t e i n s ，P R s ) 的合成，介导植物对病原体的抗性【3 1 1 。研究 表明转录因子A t W R K Y 2 2 ，A t W R K Y 2 9 是在M A P K 通路中能够抵抗细菌和真菌 病原物的重要下游基因的产物。A t W R K Y 2 9 的转录表达能够降低拟南芥叶片的 病症【3 2 】；在烟草中的3 个W R K Y 转录因子，M A P K 激酶基因和N t N T F 6 都受到对 T M V 的抗性是由抗性基因产物的调节【3 2 , 3 3 】。以上研究结果表明，W R K Y 转录 6 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 因子在同等抗性基因的反应通路中起重要作用。研究表明W R K Y 转录因子受各 种生物及非生物胁迫的诱导表达，参与植物的胁迫应答反应。M a r e 等【3 4 】从大麦中 分离到了一个新的W R K Y 转录因子H v W R K Y 3 8 ，该转录因子参与植物对冷胁 迫和干旱胁迫等非生物胁迫的应答反应。L i u 等【3 】研究发现机械伤害、防卫信号 分子S A 、A C C 、M e J A 与病原体侵染等均能诱导O s W R K Y 7 1 转录因子表达的上 调，此结果说明在水稻的生物胁迫应答中O s W R K Y 7 1 转录因子普遍发挥作用， 进一步研究结果表明O s W R K Y 7 1 基因的超表达转基因水稻对致病菌 ( X a n t h o m o n a so r y z a e p v o r y z a e ( X o o ) 1 3 7 5 1 ) 的抗性有显著的提高，此现象表 明O s W R K Y 7 1 转录因子增强水稻抗逆性是通过在转录水平通过调节水稻抗逆 信号途径中的相关功能基因的表达而提高水稻的抗逆性【3 4 】。Y o d a 等从烟草中 克隆出一个H Z Z 基因，研究发现此基因是与W I Z Z 基因具有高度同源性的W R K Y 转录因子，而且研究发现转乃Z 2 基因的烟草感染烟草花叶病毒后能诱导T I Z Z 基 因的表达，但进一步的研究发现此过程并无S A 的积累，此现象说明在植物中存：t 在一种不依赖于S A 的超敏反应信号( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，I - m ) 转导途径， 在植物防御反应激活的过程中T I Z Z 转录因子对起着重要作用；K a l d e 等【3 6 】研究 发现与W R K Y 基因结合的启动子附近序列的不同而导致其处于不同的信号转导 途径中【2 6 1 。X i e 等吲从水稻中鉴定T 8 1 个O s W R K Y 转录因子，在水稻糊粉细胞 中O s W R K Y 2 4 、O s W R K Y5l 、伽W R K Y7 1 、O s W R K Y7 2 均能受A B A 的诱导， 表达，利用瞬时表达分析系统研究表明A B A 诱导的H V A 2 2 启动子活性的表达受 到仇W R K Y 2 4 、O s W R K Y4 5 的抑制，而O s W R K Y 7 2 、O s W R K Y 7 7 能与A B A 协 调作用进而激活该启动子的活性，此研究结果说明单子叶植物中的W R K Y 转录 因子参与植物对A B A 的应答；P a r k 等【3 8 】从拟南芥c D N A 文库中筛选到一个能 与C a M 结合的转录因子A t W R K Y 7 ，其结构中含有一个钙调蛋白结合域 ( C a l m o d u l i n b i n d i n gd o m a i n ，C a M B D ) ，说明在C a M 介导的C a 2 + 信号转导过程中 A t W R K Y 7 起重要作用，且A t W R K Y 7 转录因子所属的I I d 类W R K Y 转录因子均 具有保守的钙调蛋白结合域，此研究结果表明在C a M 介导的C a 2 + 信号转导过程 中该类W R K Y 转录因子起一定作用；Z o u 等【”1 从旱生常绿植物L a r r e at r i d e n t a t a 中分离克隆出L t W R K Y 2 1 转录因子，研究发现该转录因子能激活A B A 诱导基因 启动子H V A 2 2 的活性，而进一步研究发现L t W R K Y 2 l 转录因子可能与A B l 5 、 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 V P l 结合形成一个位于A B l l 下游的功能复合物进而影响A B A 调节基因的表达。 “等f 加】以超表达W R K Y 7 0 拟南芥转基因植株和W R K Y 7 0 基因敲除的拟南芥 突变体为植物材料，通过利用真菌病原体E r y s i p h ec i c h o r a c e a r u m 和A l t e r n a r i a b r a s s i c i c o l a 侵染植物材料，研究结果表明超表达W R K Y 7 0 序嫩基因植株能显著 提高S A 介导的E r y s i p h ec i c h o r a c e a r u m 抗性，但与此同时也会降低J A 介导的 A l t e r n a r i a b r a s s i c i c o l a 抗性；而下调W R K Y 7 0 的表达或基因敲除脓K 】，加则会降 低植物对S A 介导的E r y s i p h e c i c h o r a c e a r u m 抗性。由此说明W R K Y 7 0 转录因子抑 f 1 t J J A 信号转导途径可能部分是通过S A 信号转导途径中的N P R l 途径来实现的，由 此也可以得出W R K Y 7 0 是平衡植物J A 、S A 防御信号途径的一个重要决定因子【3 I 】。 1 2 2 3W R K Y 转录因子对植物发育和物质代谢的调节作用 W R K Y 转录因子除了对植物的防御反应起调节作用之外，还参与植物衰老及 发育等一系列生命活动。研究表明拟南芥W R K Y 类转录因子T T G 2 基因至少控 制三个不同的植物形态发生过程，诸如：毛状体的发育、内种皮中单宁酸的生成 和外种皮中植物黏液的产生，还有可能与根的发育有关8 , 1 1 , 1 4 , 4 1 1 。J o h n s o n 等【4 2 J 在拟南芥突变体中发现一种T T G 2 ( T R A N S P A R E N TT E S T AG L A B R A 2 ) 基因，该 基因编码一种W R K Y 转类录因子，并揭示出这种W R K Y 类转录因子的表达参 与植物的形态发育，能影响植物毛状体及种皮的发育【4 , 4 3 】。在胡椒中C a W R K Y l 在红色水果中受到强烈的上游调控并表达，可能在水果成熟的过程中起重要作 用。在植物的花序和胚胎组织的c D N A 文库中存在大量的W r k y 基因片段，这可 以说明W R K Y 转录因子在这些组织中有重要的功能。W R K Y 蛋白还参与调节 植物的一些代谢过程。大麦中含有一个S U S I B A 2 转录调控因子，具有典型的 W R K Y 结构和特征，可与异构淀粉酶基因I S 0 1 启动子区域中的蔗糖信号反应 因子( S U R E ) 和W b o x 序列特异地结合从而调节淀粉的合成【8 1 。L u o 等【删通过研究 发现：转录因子W R K Y l 0 可能通过与I K U 启动子中的W 盒的结合进而调节I K U 基因的表达而参与种子的发育过程【4 5 】晰】。另外，棉花中倍半萜烯的合成依赖于 G a W R K Y l 【3 2 1 。W R K Y 转录因子除了参与植物的防御反应、发育过程之外，当植 物被病毒、细菌等物质感染之后，体内w R K Y 因子m R N A 、蛋白质及其D N A 结 合活性的水平都有提高【4 7 1 。研究还发现W R K Y 转录因子的表达还能提高拟南芥、 烟草对丁香假单胞杆菌( P s e u d o m o n a ss y r i n g a e ) 、T M V 的抗性。目前，一般遗传学 8 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 方法不能说明单独的W R K Y 基因为何能发挥其功能。此外，W R K Y 转录因子下 游目标基因在不同W R K Y 基因转基因植株中的超量表达，说明一定程度上与各 自因子的特异性相关。 1 3D R E B 转录因子的研究进展 1 3 1D R E B 转录因子的结构特点 D R E B ( D e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n g ) 转录因子属于A P 2 E R E B P ( A P E T A L A 2 e t h l e n er e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ，A P E T A L A 2 乙烯应答元 件结合蛋白) 转录因子家族，是一类在植物中特有的、与植物的生长发育调控及参 与非生物逆境胁迫的转录因子【4 8 4 9 1 。其典型特征是D N A 结合区均为由5 7 7 0 个A A 组成的A P 2 E R E B P 保守结构域。根据保守结构域数目的不同，分为A P 2 和E R E B P 两个亚族；D R E B 转录因子属于其中的E R E B P 亚族，特异性地和 D R E 顺式作用元件结合，调控在启动子区域存在该元件或其核心序列 A P G C C G A C 5 0 , 5 1 , 5 2 】的一些逆境诱导基因的表达。同时D R E B s 类转录因子序列中 有一段富含S e r T h r 的区域，在基因间的磷酸化及相互作用中起重要的作用【5 2 1 。 一个D R E B 转录因子可以调控下游的多个抗逆基因，从而使植物产生抗逆性。 1 3 2D R E B 转录因子的调控功能 1 3 2 1D R E B 转录因子在逆境应答中的作用 利用D R E B 转录因子来激活一系列抗逆功能基因的表达，综合提高植株的抗 逆性已成为植物抗逆基因工程的重要方法。L i u 等3 l r - 和K a s u g a 等5 3 】将 C a M V 3 5 S ：A t D R E B l A 转入拟南芥，转基因植株对干旱、高盐和低温的耐受力显 著提高。与C a M V 3 5 S ： 4 t D R E B l A 转基因拟南芥相比，C a M V 3 5 S ：O s D R E B l A 转 基因拟南芥植株的胁迫耐受力以及生长迟缓的程度都相对低一些。D u b o u z e t 等【5 6 】 通过研究发现O s D R E B l A 只与G C C G A C 有效结合，耐t D R E B l A 能够与 p L G C C G A C 皆有效结合，推测出C a M v 3 5 S ：么缈尺肋朋的拟南芥转基因植株与 C a M V 3 5 S ：O s D R E B l A 的拟南芥转基因植株在表型上的差异可能是由于诱导的 胁迫应答基因的个数不同引起的。J a g l o 等5 4 】把拟南芥的D R E B l A C B F 3 、 D R E B l B C B F l 、D R E B l C C B F 2 基因分别导入油菜，可组成型的提高转基因油 菜的耐寒性。S a v i t c n 等【5 5 I B N C B F D R E B l 不仅能够提高转基因植株的冷耐受力， 且增强光化效率和光合能力。2 0 0 2 年H s i e h 等【5 6 】将拟南芥中C a M V 3 5 S ：C B F l 9 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 基因转入番茄后转基因番茄对冻害的耐性增加，同时抗旱和抗氧化能力也明显提 高，并且这种抗性可以稳定遗传。D u b o u z e t 掣5 7 】发现O s D R E B l A 拟南芥转基因 植株对冷胁迫的耐受力和耐盐性都有显著提高。目前研究表明在拟南芥中约有4 0 个基因受到D R E B n 转录因子的正调控，其产物包括一些转录调控因子、碳水化 合物代谢相关蛋白、冷诱导蛋白、渗透保护生物合成蛋白等，通过这些基因产物 的表达以及协同作用以提高植物对逆境的抵抗能力【4 8 4 9 5 0 , 5 s 】。 2 目前存在的问题 现今阐明转录因子的调控功能已成为分子生物学研究的热点。随着模式植物 基因组测序的完成，越来越多的转录因子被发觉，如何运用分子生物学、遗传学 等方法明确及运用这些转录因子的功能成为目前研究的首要目标。一个转录因子 就可通过调控网络促使多个功能基因发挥作用，从而使植株性状获得综合改良的 效果。那么在提高作物抗逆性的分子育种中，与改良个别功能基因来提高抗性的 方法相比，导入一个转录因子是提高作物抗逆性更为有效的方法。 研究结果表明W R K Y 转录因子参与植物很多重要的生理生化过程，如参与 物质代谢、调控植物生长发育、防御应答反应等多种重要的生理生化活动。目前 的研究主要集中在对W R K Y 转录因子的基因克隆、结构分析等初步阶段【1 0 1 。然 而，W R K Y 转录因子所介导的植物逆境应答的具体网络信号过程仍不是很清楚， 比如W R K Y 转录因子的上、下游结合蛋白仍不能十分确定，W R K Y 转录因子在 各种抗逆信号转导途径中的交叉调节作用也有待迸一步研究。而且转录因子功能 的研究大多是在模式植物如拟南芥、水稻等中的研究，而在诸如小麦、辣椒中的 研究较少。 综述所述，与模式植物相比，茄科植物辣椒的W R K Y 和D E R B 家族成员的 功能鉴定方面开展的工作还不多，很多基因的功能及辣椒抗逆的分子机制还不清 楚，有必要进一步研究。而烟草与辣椒同属于茄科植物，研究转录因子在烟草中 的表达有助于以后转录因子在辣椒中表达、调控功能的研究。 3 、研究目的和意义 二十世纪依赖于石油能源的农业发展在取得了巨大成果的同时也带来较为 严重的资源短缺、环境污染等问题。其中作物生产过程中为防治病虫害而频繁地 施用农药导致的病虫抗药性和农产品农药超标已经引起了人们的高度关注，成为 1 0 福建农林大学2 0 10 届硕士毕业论文 当前必须解决的重要课题。强化植物抗病虫能力的遗传工程是人们解决上述问题 的最为有效的技