三角帆蚌Nacrein蛋白对珍珠晶体成型的影响及Nacrein基因表达特征-硕士论文

学校代码： 1 0 2 6 4 研究十学号： M 0 7 0 1 0 7 1 7 7 上海海洋大学 硕士学位论文 题 三角帆蚌N a c r e in 蛋白对珍珠晶体成型的 影响及N a c r e i n 基因表达特征 T h eE f f e c to fN a c r e i nP r o t e i no nC r y s t a l 英文题目：G r o w t ha n dE x p r e s s i o nC h a r a c t e r i s t i c so f 专业： 研究方向： 姓名： 指导教师： N a c r e i nG e n ei nH y r i o p s i sc u m i n g i iL e a 动物遗传育种与繁殖 分子遗传育种 韩健 施志仪教授 二。一。年六月 0 眦m I I I I I I I I I l Y 18 2 18 2 3 上海水产大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：韩位 日期：) 一年6 月矽日 上海水产大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 ， 不? 密必 锄之 学位论文作者签名：韩他指导整师签名：。 日期：函f D 年细以日 日采口，口年奇筛 渔渔主芏太堂博硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名工作单位职称备注 罗祖玉复旦大学生命科学学院 教授主席 吴超群复旦大学生命科学学院教授委员 黄青山复旦大学生命科学学院教授委员 上海海洋大学水产与生命 赵金良教授委员 学院 上海海洋大学水产与生命 沈和定教授委员 学院 委员 委员 上海海洋大学水产与生命 张俊玲讲师 秘书 学院 上海海洋大学水产与生命 2 0 10 年6 月 答辩地点 学院C 楼2 17 室 ， 答辩日期 2 1 日上午 上海洵洋人。学颂I j 论文 三角帆蚌N a c r e in 蛋白对珍珠晶体成型的影响及N a c r e i n 基因表达特征 摘要 生物矿化的研究表明，珍珠质巾基质蛋白对壳和珍珠的生长形成起重要作 用，其中N a c r e i n 足目前发现的重要基质蛋白之一。为了研究N a c r e i n 蛋白对三 角帆蚌珍珠生长的促进作用，本论文通过细胞培养及分了生物学技术对N a c r e i n 蛋白对晶体成型的影响及组织表达差异进行分析，这对于阐明珍珠形成机理，提 高珍珠质量有着重要意义，可推动育珠业的快速发展。 论文包括以下两部分内容： 一：三角帆蚌N a c r e i n 蛋白分离纯化及其对珍珠晶体成型的影响 本试验采用三角帆蚌所产无核珍珠，通过水提法初步分离出的珍珠质水溶性 基质蛋白，采用快速蛋白液相色谱( F P L C ，F a s t p r o t e i nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 分 离提纯三角帆蚌N a c r e i n 蛋白，并采用配对实验设计( 其巾实验组和对照组各为6 个 组织培养样品) ，对实验组外套膜组织培养样品加入N a c r e i n 蛋白，研究N a c r e i n 蛋 白对品体成型的影响。 研究结果湿示，经过F P L C 分离出N a c r e i n 蛋白分了量约为6 0k D a ，组织培养巾 加入N a c r e i n 蛋白的试验组结晶成棱形状，而未力l l N a c r e i n 蛋白的对照组结品成雪花 状，而且在晶体形成的时问上，实验组也较之对照纽要早。该研究表明，N a c r e i n 蛋白能加速外套膜组织分泌的钙质形成棱状结晶，从而对晶体成型产生影响。 二：三角帆蚌N a c r e i n 基因3 端克隆及其约l 织表达差异分析 试验选取健康1 龄三角帆蚌，采集外套膜组织样提取总R N A ，通过3 - R A C EP C R 技术获取N a c r e i n 基因3 端序列，并进行生物信息学分析，利用荧光R e a l t i m eP C R ， 上海浙洋人学倾t ：论文 分析N a c r e i nm R N A 在外套膜外膜、腮、内脏团、斧足中表达水平的差异。 结果表明：试验所得N a c r e i n 基因3 端序列长度为8 5 0b p 碱基，包含3 个O R F 。 利用D N A M A N 软件分析其与合浦珠母贝同源基因序列相似度为5 6 ，与马氏珠母 贝相似度为5 0 。N a c r e i n 基因m R N A 在未捅核的三角帆蚌外套膜外膜表达量最高， 与其他组织比较，差异显著( P O o s ) 。在插核的三角帆蚌各组织的表达中，外套 膜外膜上靠近珍珠生长的部位N a c r e i n 基因m R N A 表达量最高( P 0 o s ) ，鳃组织中 表达降低f 尸 0 o s ) ，外套膜内膜组织、斧足中表达增加，与对应的为插核组织中 N a c r e i n 基因m R N A 水平差异显著( 尸 0 o s ) 。 本论义研究表明，N a c r e i n 参与并调控了晶体成型、珍珠生长的过程，而三角 帆的珍珠培育显著的影响- J N a c r e i n 基因在各个组织中表达。本研究为进一步研究 基质蛋白对生物矿化的作用提供实验依据，对珍珠培育生产有一定指导意义。 关键词：N a c r e i n 基质蛋白，珍珠，晶体成型，N a c r e i n 基因，表达特征 l l 上河湘 _ 人。坝I 论文 T h eE f f e c to fN a c r e i nP r o t e i no nC r y s t a lG r o w t ha n d E x p r e s s i o nC h a r a c t e r i s t i c so f N a c r e i nG e n ei nH y r i o p s i s A BS T R A C T B i o m i n e r a l i z a t i n gs t u d i e ss h o wt h a tn a c r em a t r i xp r o t e i n sp l a ya ni m p o r t a n tr o l e i nt h ef o r m a t i o na n dt h eg r o w t ho fp e a r la n ds h e l l N a c r e i ni so n eo ft h ei m p o r t a n t m a t r i xp r o t e i n sf o u n da tp r e s e n t I no r d e rt or e s e a r c ht h er o l eo fn a c r e i np r o t e i no nt h e g r o w t ho fp e a r l ，t h ep r e s e n ts t u d y ，i n f l u e n c eo fc r y s t a lf o r m a t i o no fN a c r e i np r o t e i na n d d i f f e r e n c eo fg e n ee x p r e s s i o ni nt i s s u ew e r er e s e a r c h e db yc e l lc u l t u r ea n dm o l e c u l a r b i o l o g yt e c h n i q u e s I th a sag r e a ts i g n i f i c a n c eo nc l a r i f yt h ef o r m a t i o na n df o r m a t i o n m e c h a n i s mo fp e a r l s I tC a np r o m o t et h er a p i dd e v e l o p m e n to fp e a r li n d u s t r y T h et h e s i si n c l u d e st h ef o l l o w i n gt w op a r t s ： 1 ：N a c r e i np r o t e i np u r i f i c a t i o na n de f f e c to fn a c r e i np r o t e i no nc r y s t a ls h a p e T h en u c l e a r - f r e ep e a r lo f 脚r o p s sc u m i n g i iL e aw e r eu s i n g ，a n dw a t e rs o l u b l e m a t r i xp r o t e i no fp e a r lw e r es e p a r a t e db yt h em e t h o do fw a t e re x t r a c t i o n t h en a c r e i n p r o t e i nw a si s o l a t e da n dp u r i f i e db yt h eF P L C ( F a s tp r o t e i nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) ， F u r t h e r m o r e ，t h ec o m p a r a t i v et e s tw a sd e s i g n e d ( t r e a t m e n tg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p ) t o s t u d yr e l a t i o n s h i pb e t w e e n n a c r e i np r o t e i na n dc r y s t a lg r o w t h T h et o t a lo f12m a n t l e t i s s u e sw e r ec u l t u r e d ( 6d i s h g r o u p ) ，a n dt h et i s s u e so ft r e a t m e n tg r o u pw e r ea d d e dt h e n a c r e i np r o t e i ni nc u l t u r em e d i a , w h i l et h e r eo fc o n t r o lg r o u pw e r en o ta d d e dt h e m 上f f ：河 ￥人：0 倾I ? 论文 T h er e s e a r c hs h o w e dt h a tn a c r e i np r o t e i n sw e r ei s o l a t e da n dm o l e c u l a rw e i g h tw a s a b o u t6 0k D ab yF P L C F u r t h e r m o r e 。n a c r e i np r o t e i na c c e l e r a t e dt h e g r o w t ho f p r i s m a t i c - s h a p e dc r y s t a lb yt h ea c t i n go ns e c r e t i o no fm a n t l et i s s u e ，w h i c hp r o v i d e dt h e f o u n d a t i o n sa n dc e r t a i ns i g n i f i c a n c eo np e a r ld e v e l o p m e n ta n dp r o d u c t i o nf o rf u r t h e r r e s e a r c ho nb i o l o g i c a lm i n e r a l i z a t i o nm a t r i xp r o t e i nf u n c t i o n 2 ：T h ec l o n eo fn a c r e i ng e n e3 e n ds e q u e n c ea n da n a l y s i so ft h ed if f e r e n c eo f g e n e e x p r e s s i n gi nt i s s u el e v e l si nH y r i o p s & c u m i n g i iL e a T h eh e a l t h y1y e a s o l dH y r i o p s & c u m i n g i iL e aw e r es e l e c t e d ，o u t e rm a n t l ew e r e s a m p l e da n de x t r a c tt o t a lR N A T h e3 e n ds e q u e n c ew e r eo b t a i n e db yR A C EP C R a n d t h es e q u e n c ew e r ea n a l y s i s e db yb i o i n f o r m a t i c ，R e a l - t i m e P C Rt e s t i n gt e c h n o l o g yw i t h d o u b l et h es t a n d a r dc u r v em e t h o d ，n a c r e i ng e n em R N Ai nt h eo u t e rm a n t l e ，g i l l s ， v i s c e r a lm a s s ，f o o ta xe x p r e s s i o nl e v e lw e r es t u d i e d T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et a r g e ts e q u e n c e ( a b o u t8 5 0b p ) w a so b t a i n e d ，w h i c h c o n t a i n i n gt h r e eO R F T h es e q u e n c ew a sa n a l y z e du s i n gD N A M A Ns o f t w a r e ，a n d r e s u l t ss h o w e dt h a ti th a d5 6 a n d5 0 s i m i l a r i t yc o m p a r e dt oh o m o l o g o u sg e n ei n P i n c t a d af u c a t aa n dP i n c t a d am a r t e n s i LN a c r e i ng e n em R N Ao fo u t e rm a n t l ew a st h e h i g h e s te x p r e s s i n gl e v e la m o n ga l lt i s s u e ，t h ed i f f e r e n c e sw e r es i g n i f i c a n t ( P 0 0 5 ) I n t h eH y r i o p s & c u m i n g i iL e aw i t hp e a r lc u l t u r e ，n a c r e i nm R N Al e v e lf r o mm a n t l en e a r b yt h ep e a r lw a sh i g h e s t ( P 双重蒸馏装置( 上海玻璃仪器一J 额定功率3 k W ) 低速离心机( T D Z 4 W S 台式自动平衡离心机) 高压蒸汽灭谪锅( 上海三申) 超净工作台( Y J 8 7 5 吴江净化设备总J ) 8 上海渐洋人学倾I j 论文 电热烘箱( D H G 上海华连医疗器械) 解剂 i 五微镜( O l y m p u sI M ，带自动曝光照棚系统) ! 4 实验方法 1 4 1 水提法妇们初步分离水溶性基质蛋白 L 以1 2 5m L 超纯水( 含0 5ME D T A ，p H8 O ) 溶解5 0g 珍珠层粉，4 C 搅拌7 2h ， 1 2 ，0 0 0r p m m i n 离，1 二, 3 0m i n ，上清液冻干。冻干后的样品溶解在5m L 超纯水巾，4 透析除去E D T A 后，样品冻干。 1 4 2 F P L C l 3 7 】分离纯化N a c r e i n 蛋白 F P L C ( F a s tp r o t e i nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 全称为快速蛋白液相色谱，本实 验仪器为A m e r s h a m 公司生产的高效液相色谱仪，其原理是经典液体柱层析引入气 相色谱理论，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装 置和微机等发展起来的现代液相色谱。技术参数为：流速0 7 5m L r n i n ，耐受压1 3 M p a ，梯度精确度为2 个泵，U V 临视为1 个波长滤波器确认。平衡柱为M i l l i Q 水， 2 0m i n 柱平衡后，上样2m L 蛋白样品，1 0 1 5m i n 后出现2 8 0m n 处蛋白吸收峰。 1 4 3S D S - P A G E 口町凝胶电泳鉴定纯化后粗蛋白 S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白的原理是根据大多数蛋白都能与阳离予 表面活性剂十二烷基硫酸钠( S D S ) 按重量比结合成复合物，使蛋白分了所带的负电 荷远远超过天然蛋白分了的净电荷，消除了不同蛋白分了的电荷效应，使蛋白按 分子大小分离。 ( 1 ) 制胶用3 0 丙烯酰胺溶液一分离胶缓i f f 一液一2 0 十二烷基硫酸钠溶液一1 0 过硫酸铵溶液( 新鲜配制) 四甲基K , - - - - 胺水( 5 O ：1 5 ：0 0 8 ：0 1 ：O 0 l ： 5 3 ) 制成分离胶液，灌入模具内军一定高度( 剩余体积留作制备浓缩胶用) ， 用水封顶，聚合完毕，倾去水层。 再用3 0 丙烯酰胺溶液浓缩胶缓冲液2 0 十二烷基硫酸钠溶液10 过硫酸馁溶液四甲基乙二胺水( O 8 ：1 3 ：0 0 2 5 ：0 0 5 ：0 0 0 5 ：2 4 ) 制成浓 缩胶液，灌在分离胶上，插入样品梳( 用水封顶) ，待浓缩胶液聚合后， 小心除去样品梳或水。 9 上洵淘洋人学恸if j 论文 ( 2 ) 电泳垂直板电泳：恒压电泳，初始电压Y , j 8 0 v ，进入分离胶时调至1 5 0 - 2 0 0 V ， 当澳酚蓝迁移胶底处，停止电泳。 ( 3 ) 考马斯亮蓝染色电泳完毕，取出胶片，置固定液巾3 0 分钊，取出胶片，冠染 色液巾1 - 2 d , 时，用脱色液脱色罕凝胶背景透明后保存在保存液巾。 1 4 4 外套膜组织培养与钙结晶观察 1 4 4 1 三角帆蚌外套膜组织培养汹】 将3 只三角帆蚌J 钉清水冲净，切断闭壳肌，将撕好的外套膜外膜在酒精下迅 速浸过，用单蒸水里冲洗，再放入盛有D H a n k s 的培养皿里，D H a n k s 冲洗组织 2 3 次。然后分别用P B S + 2 0 0I U 双抗、P B S + 1 0 0 0I U 双抗、P B S + 2 0 0I U 双抗各 冲洗组织一次，最后再用D H a n k s 冲洗。将处理过的组织剪成1r n l T l 3 大小的组织 块，D H a n k s 冲洗2 次。取小片放入培养皿里贴壁，2 7 培养箱倒置4 小时后， 正置后加入少量培养液( 含2 0 胎牛血清、1 双抗的R P M I 1 6 4 0 ) 于培养箱内 培养，共培养组织1 2 组( 1 2 个培养皿) ，置于相同条件下培养。 1 4 4 2 钙结晶结果观测 组织培养6 天后，将培养的组织随机分成2 组( 实验组及对照组) ，各6 个培养 皿。实验组在第6 天后的培养过程巾培养液换为含终浓度为O 1g m L 的N a c r e i n 蛋白 培养液，对照组培养液仍保持原有培养液，并使两组培养皿置于相同条件下培养， 每2 天换一次培养液，每天在倒置显微镜下观察组织生长与结晶形成情况，并拍照 加以分析。 2 结果 2 1 F P L 0 分离纯化N a c r e i n 蛋白 三角帆蚌水溶性基质蛋白在2 8 0n m 处有吸收峰，在单一峰值处收集，回收冻 干浓缩后，再次进柱，N a c r e i n 术l l 蛋白检测为单一峰值，如阁2 1 。 l O 上海i f ：洋J c 7 ：硕I ：论文 魄一冉 一：张 m A U 詹： 氍 嚣j j ? ； 钲 ； ；4 “： 拦j；l 靠? ! 藏o 一 。!t ( 删 瓤_ _ _ _ - - _ _ _ - _ - _ _ ；= 罱籼- - _ 唧_ _ _ _ - 一 图2 1N a c r e i n 蛋白在2 8 0 h m 处的紫外吸收峰 F i g 2 1A b s o r p t i o np e a k so f p r o t e i n so f N a c r e i na t2 8 0n mb yF P L C 注：横坐标为保留时间( m i n ) ；纵坐标为N a c r e j n 蛋白质在2 8 0n m 处紫外吸收值( m A U ) N o t e ：A b s c i s s af o rr e t a i n e dt i m e ( m i n ) ，O r d i n a t ef o rv a l u eo fu l t r a v i o l e ta b s o r p t i o n ( m A U ) o f N a c r e i np r o t e i ni n2 8 0n m 2 1 1 基质蛋白的回收率及N a c r e i n 粗蛋白的纯度 ， 经测定纯化前基质蛋白共约1g ，纯化后基质蛋白共约O 4 9g ，经计算柱纯化回 收率为4 8 5 2 。 2 2S D S - P A G E 验证N a c r e I n 蛋白的纯度 纯化前基质蛋白车l l 品有多条杂带，经柱纯化后只有一条带，S D S P A G E 结果( 图 2 2 ) 表明纯化后只有一条带，且此带的分了量约为6 0k D a 。由近缘生物N a c r e i n 蛋 白研究资料表明，N a c r e i n 蛋白分了量约在6 0k D a l 4 叭，并_ R N a c r e i n 蛋白分了量变化 较小，因此术试验收集的单峰蛋白为N a c r e i n 蛋白。 一 上洵渐洋人学硕f j 论文 9 9 6 6 4 4 2 9 2 0 1 4 l 6 0 如a 图2 2N a c r e i n 蛋白的S D S P A G E 电泳检测图 F i g 2 - 2D e t e c t i o no fn a c r e i nb yS D S - P A G Ee l e c t r o p h o r e s i s 注：1 为蛋白M a r k e r 条带：2 为N a c r e i n 粗蛋白条带 N o t e ：lf o rt h em a r k e rp r o t e i nb a n d s 2f o rn a c r e i nc r u d ep r o t e i nb a n d 2 3N a c r ein 粗蛋白对三角帆蚌外套膜组织培养钙结晶观测与分析4 1 1 三角帆蚌外套膜组织培养6 天后，在组织培养实验组样品巾加入了N a c r e i n 蛋 白，对照组未加入N a c r e i n 蛋白。在第9 天，两组组织块边缘形成明显层片的膜状结 构，并自少量结晶体出现。第1l 天，实验组的组织周围出现类似雪花状的明显结 晶( 图2 3 ：1 1 ) ，结品触角较大，呈四周发散状。而对照组第1 3 天组织块周围才 出现类似的雪仡状结晶( 图2 3 ：1 2 ) ，而且结晶体模糊，结品触角较小。第1 8 天 时，实验组培养皿巾出现棱形状结晶，形状比较规整( 图2 3 ：2 1 ) 。对照组培养 皿内雪化状结晶触角变小，巾问发散状形状变稀( 图2 3 ：2 2 ) 。实验观测结果湿 示：两组都出现了雪化状结品体，而添力l l N a c r e i n 蛋白的处理组出现雪化状结晶的 时间要早于对照组，此外添) J H N a c r e i n 蛋白的处理组出现杆状和棱7 侈状结品体，表 明添；t J l l N a c r e i n 蛋白对三角帆蚌外套膜组织培养- 1 1 的品体生长及成型有影响作用。 1 2 上洳淞洋人一誓坝I j 论史 3 讨论 3 1 采用F P L O 方法分离蛋白的研究 F P L C 是专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，是H P L C 近年来的一 项重要革新，随着H P L C 的发展，出现了两利t 新型填料：薄壳型填料和双扩散灌流 型填料，它们对大分了物质的分离具有独特的优越性，F P L C 不但保持了H P L C 的 快速、高分辨率等特性，而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分了 失活等特降。因此在近年来在分离蛋白质、多肽及寡核苷酸等方面得到了广泛应 用。 一 多 = 鹣 护； 。 一 一 飞。；0 侈M p，。t， p ； 锈 ：一，：_，。 。 ；， 。k 一 黔础 一 如 一 o 、舭 L + 。 。藏旷舅。；敬酝髟眵彰驴旷嚣獬致隧 - 上_ f ： f ：J 洋人学颂I ：论文 3 2 基质蛋白对晶体生长的影响 贝壳和珍珠有机基质由外套膜表皮细胞分泌的蛋白质和糖类物质组成。研究 表明，所有的基质蛋白巾都仃( A s p Y ) n 的重复序列结构，Y 主要是S e r 或G l y l 4 4 1 。 透射电镜显示水溶件基质蛋白多分布在水不溶性基质蛋白表面，与品体表面直接 接触1 4 5 1 ，水不溶性基质蛋白硬化后构成晶体生长的网架状三维窄间结构，各利一贝 类的水溶性基质蛋白在贝体内、外都对碳酸钙晶体的形成有重要的调节作用1 4 6 1 。 贝壳有机基质结合钙的能力及其与钙化的关系，发现在正常生理离了强度下，水 溶性基质蛋白在体内、外对碳酸钙晶体的亲和力都远远高于对C a 2 + 的亲和力1 4 7 】。使 用高效液相层析技术发现水溶件基质蛋白巾含有许多明显分段的组分，其一级结 构巾主要氨基酸顺序是( A s p Y ) n ，此外，一级结构巾还包括疏水件氨基酸区域 和多聚丝氨酸，这利t 序列类似于胶原和蚕丝等结构蛋白质的序列特征。红外光谱 技术发现此类蛋白质大多呈B 折叠结构。体外实验还证明，水溶性基质蛋白能引起 核化作用的发生。 本试验外套膜组织培养分为2 个组，实验组和对照组：实验组为加入提取的 N a c r e i n 蛋白，对照组为未加入提取的N a c r e i n 蛋白。结果表明，两组在早期都有晶 体的形成，这是因为无论是实验组还是对照组，外套膜组织自身都有内源P 串N a c r e i n 蛋白，这利一内源性N a c r e i n 蛋白启动了晶体生长，但结果又表明，加入外源件N a c r e i n 蛋白能促进钙晶体成型，加入N a c r e i n 蛋白的实验组的晶体成型为棱形状，未加入 N a c r e i n ，( 1 l 蛋白的对照组的晶体成型为模糊的雪仡状，而且加入N a c r e i n 蛋白的实验 组出现钙晶体时间也较之未加入N a c r e i n 蛋白的对照组要早。由此可见，N a c r e i n 蛋 白基质对三角帆蚌外套膜组织钙品体成型自影响作用，它不仅启动I 弱体生长，而 且在已形成的珍珠质晶体的基础上加速钙晶体成型。在生理条件下，这些离了簇 或珍珠质晶体反复地溶解与形成，最后稳定下来，形成品核。近年来，随着研究 的深入进行，越来越多的实验表明壳自机基质是不同碳酸钙结晶系形成的决定性 因素【4 8 】。 3 3 基质蛋白调控晶体生长的意义 有机基质在晶体的成核、定向、生长、形态控制等方面起调控作用，同时可 能还具仃控制离了运输的功能，作为生物矿化的构架蛋白，为晶体的核化、生长 提供结构支撑。在河蚌禽珠的生产过程中，c a 2 + 的吸收和转运对于珍珠的产量和质 量提高起着重要作用，加快在C a 2 + 珍珠囊r f l 的沉积，是促进珍珠快速生长和提高 1 4 上淞_ f ：J 汀人学钡l j 论文 珍珠质j 最的重要手段。有关钙代谢的调控闪子可能通过钙的吸收、转运、贮藏及 沉积从而参与调控贝壳和珍珠的形成。研究贝类钙代谢，特别是外套膜组织的钙 代谢，对进一步l 列明贝壳以及珍珠形成机理，提高优质珠的产量都仃着重要意义。 上海渐洋人学硕I j 论文 第三章三角帆蚌伽砌基因3 端克隆及其定 量表达分析的研究 本论义第二章研究结果表明：N a c r e i n 基质蛋白对外套膜组织介导的晶体生长 有显著的影响，主要表现为加速细胞外结晶的生长速度。因此进一步从分子上研 究N a e r e i n 基质蛋白的基因结构和基因表达情况，对实现珍珠生长的调控具有重 要作用。 本章采用生物信息分析和分子生物技术对N a c r e i n 基质蛋白基因序列和组织 表达进行分析，为进一步开展珍珠生长研究提供理论基础。 1 材料和方法 1 1 实验样品的采集 用于本研究的三角帆蚌由浙江诸暨市实验基地提供，所有的三角帆蚌放在室 内玻璃缸巾暂养两周，充氧，以小球藻投喂，每两天换水一次。 1 2 主要试剂 D N AM a r k e r 胶回收试剂盒 感受态细胞D H 5 Q t X - g a l I P T G R N A i s oP l u s D N A L A - T a q D N a s el ( R N a s e - f r e e ，5U g L ) R N a s e f r e e 水 R N a s eI n h i b i t o r ( 4 0 U g L ) T I A N G E N 公司，北京 T I A N G E N 公司，北京 T I A N G E N 公司，北京 T I A N G E N 公司，北京 T I A N G E N 公司，北京 T a k R r aB I O T E C H 公司，大连 T a k a r aB I O T E C H 公司，大连 T a k a r aB I O T E C H 公司，大连 T a k a r aB 1 0 T E C H 公司，大连 T a k a r aB l O T E C H 公司，大连 1 6 上河_ f ：洋人学颂l j 论文 S Y B RP r e m i xE xT a q P M D T 载体 T 4D N A L i g a s e L B 培养基 抗生素 焦碳酸二乙酯( D E P C ) 1 3 主要仪器设备 P C R 扩增仪 荧光定量P C R 仪 H 1 6 5 0 R 台式高速冷冻离心机 S i g m a 3 K 18 高速冷冻离心机 V D 6 5 0 型桌上式洁净工作台 U l t r o s p e c 2 0 0 0 分光光度计 数显鼓风干燥箱 紫外凝胶成像系统 超纯水仪 D Y Y - I I l 8 A 稳压稳流定时电泳仪 1 4 方法 1 4 1 总R N A 提取和纯度鉴定 1 4 1 1 总R N A 的提取 T a k a r aB I O T E C H 公司，大连 生工生物科技公司，上海 生工生物科技公司，上海 生工生物科技公司，上海 生工生物科技公司，上海 S i g m a 公司，美国 e p p e n d o r f 公司，德国 B i o R a d 公司 长沙湘仪离心机仪器有限公司 B M H 公司，德国 苏州净化设备有限公司 P h a r m a c i aB i o t e c h 公司 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 B i o s t e p 公司 上海沪西分析仪器J 有限公司 北京六一仪器厂 制备R N A 的关键是要抑制细胞r f l 的R N A 分解酶和防止所用器具及试剂巾的 R N A 分解酶的污染，所以实验凡涉及R T - P C R 实验的所有用品均严格按消除R N a s e 的常规方法处理。玻璃器l l l l J 1 - J 酸浸泡2 4h 后，洗净，1 8 0 烘烤4h ，一次性用品 以无R N a s e 水眦制的0 1 D E P C 液浸泡过夜( 1 2h ) 后，高温高压蒸汽灭菌3 0m i n 。 溶液则加入D E P C 罕其1 1 1 浓度为0 1 ，过夜后高温高压蒸汽灭菌。在本实验r 1 1 采用 R N A 操作专用实验台，除酶的枪头和离心管，用R N A i s oP l u s 试剂提取总R N A 。 1 7 上河湘洋人学顾l ：论文 1 4 1 2 总R N A 的纯化 定量P C R 要求具有高质量的R N A ，捉取的R N A 一般都存在D N A 污染，为 了防止污染造成的假阳性，木实验巾每个样品的R N A 都经过了D N a s eI 纯化处 理。 ( 1 ) 在微量管巾配制下列反应液，伞量5 0 儿 总R N A 2 0 5 0g g 10 x D N a s eIB u f f e r5p , L R N a s eI n h i b i t o r ( 4 0U 91)05“L D N a s eI ( R N a s e - f r e e5U l a l ) 2l a L D E P CH 2 0 u pt 05 0 肛L ( 2 ) 3 7 反应2 0 3 0m i n ，加入5 0 此的D E P C 处理水 ( 3 ) 加入1 0 0l x L 的苯酚氯仿异戊醇，并充分混匀 ( 4 ) 离心，取上层( 水层) 移至另一微量离心管巾，加入1 0 斗L 的3 MN a O A C ( P H 5 2 ) ( 5 ) 加入2 5 0g L 的冷无水乙醇，2 0 。C 放置3 0 6 0m i n ( 6 ) 离心回收沉淀，用7 0 的乙醇清洗沉淀，真窄干燥 ( 7 ) 用适量的D E P C 处理水溶解后，进行电泳确认是否除去D N A ( 8 ) 将提纯后的R N A 及稀释后的R N A 保存于8 0 。C 冰箱巾以备用 1 4 1 3 总R N A 的鉴定 从所提取的各种R N A 中各取1 止，稀释至6 0 “L 后，利用分光光度计测定其浓 度以及在2 6 0n m $ 1 1 2 8 0n m 波长处的吸光度。总R N A 的完整性利用k 2 的琼脂特凝 胶电泳进行鉴定，用紫外分光光度计O D 2 6 0 2 8 0 的比值进行纯度分析。当两者比值 在1 8 2 O 时，说明提取的R N A 纯度高，无蛋白质和D N A 的残余。 利用1 的琼脂耕i 凝胶电泳，电压8 0V ，时问1 5 2 0m i n ，紫外灯下观察，进 行R N A 完整性鉴定。将提纯后的R N A 保存在8 0 冰箱中备用。总R N A 在 M M L V 反转录酶的作厢下进行R T - P C R 反应，产物经f l - a c t i n 基因验证后贮存于 2 0 冰箱中。 1 4 2 外套膜基质蛋白N a c r e i n 蛋白3 端克隆 1 4 2 。1 引物的设计与合成 1 8 I 上海海洋人一学硕l j 论文 根据已有的合浦珠母贝、马氏珠母贝、夜光蝾螺、鲍鱼、江珧等物种的N a c r e i n 基因序列，在相对保守的区域设计两对巢式P C R 引物( 引物由上海英俊生物科技 公司合成) ：F - O u t e rp r i m e r ：5 - G C A A T A A C G G T G A A A A C G G - 3 ：F - I n n e rp r i m e r ： 5 - G A G A G T T C A A GA AA G T T G G A G A - 3 。 1 4 2 2R N A - P C R 本实验使用的试剂盒巾A M V 反转录酶将R N A 合成e D N A ，并可在同一反应 管巾使用T a K a R aE xT a qH S 扩增此e D N A 。O l i g od T - A d a p t o rP r i m e r 适用于本 Y - R A C E 实验。 5 广、 ，、广、 ，、厂、八厂、八 厂、厂、厂、厂、八厂、厂、八八厂厂八3 m R N A I 扣彳= 蕊嗣5 o S y n t h e s i so lf i r s ts t r a n dc D N A w i t hr e v e r s et r a n s c r i p t a s e A M V ) c D N A P C Rc o m p o n e n t sa d d e d ： S e c o n ds t r a n de D N As y n t h e s i z e dw i t h T a K a R aE xT a qH SD N A P o l y m e r a s e a 21 1 1 1 = = = = ：= = = = = = = = = = = = = = = = ：= = = i 兰三三三翕。5 o _ 、- _ S t i i i i 一一 ! 竺竺竺 3 。 掣一! = = = = = 三= = = = = = = = = = = = = = = = i 三三三三暮 3 l c 3 ，= ， I t i 墨5 ： J ， 5：!曼=葛三三三三三3：3 5 ”1 。 。“。_ 1 4 2 3m R N A 的制备 使用A M V 反转录酶，配制反转录反应液合成c D N A 的第一条链。按以下条 件进行反转录反应： 3 0 1 0m i n 4 2 5 5 1 5 3 0m i n 9 9 5m i n 5 5m i n 在反转录反应管巾加入T a K a R aE xT a qH S 和其它P C R 反应用试剂合成c D N A 的第二条链，并进一步进行P C R 扩增。按以下条件进行P C R 反应： 1 9 - 上沏洳汀人剐贝I j 论文 9 4 2m i n1C y c l e 9 4 * ( 2O 5m i n 2 5 - 3 5C y c l e s 5 0 6 0 0 5m i n2 5 - - 3 5C y c l e s 7 2 1 5m i n2 5 - 3 5C y c l e s P C R 扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析P C R 扩增产物。 1 4 2 4 反转录反应 按下列组成配制反转录反应液。 M g C l 2 1 0 x R TB u 毹r R N a s eF r e ed H 2 0 d N T PM i x t u r e ( 各1 0m M ) R N a s eI n h i b i t o r R e v e r s eT r a n s c r i p t a s e O l i g od T - A d a p t o rP r i m e r 总R N A ( 5 0 0 n g “1 ) T o t a l 按以下条件进行反转录反应。 3 0 1 0m i n 5 0 3 0m i n 9 9 5m i n 5 5m i n 2p t L 1l x L 3 7 5 此 1p L 0 2 5 此 0 5 此 0 5 此 1 此 1 0 此S a m p l e 按以下组成配制P C R 反应液。 5 x P C RB u f f e r1 0l a L 灭菌蒸馏水2 8 7 5 止 T