基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的尿液代谢组学研究.docx

（中国图书资料分类法分类号：R917） 贵州医科大学2017届药学专业本科毕业论文 基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的尿液代谢组学研究学 生： 学 号： 年 级： 2013级 专 业： 药 学指导教师： 实习单位：贵州省药物制剂重点实验室2017年 4 月 20 日目录摘要1Abstract21.前言32.材料与方法52.1实验材料52.2实验方法63. 结果143.1大鼠神经行为学评分143.2脑梗死体积比153.3代谢物鉴定183.4尿液代谢物GC-MS分析结果194.讨论24参考文献26致谢27基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的尿液代谢组学研究学生：彭潇 导师：王爱民 教授 巩仔鹏 副教授摘要：目的 在明确辛芍组方有效组分及其治疗脑缺血再灌注损伤（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）大鼠有效性的基础上，采用代谢组学手段来探究辛芍组方在大鼠脑损状态下对其尿液中内源性代谢物的影响，为阐明该组方抗脑缺血再灌注损伤的作用机制奠定基础。方法 （1）随机将大鼠分为模型组、阳性药组、假手术组、辛芍组，MCAO大鼠模型选用改良Z-Longa方法制备。对各组大鼠进行神经行为学评价、脑梗死体积比的分析，并对辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤进行有效性评价。（2）采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析方法，建立尿液样品代谢指纹图谱，利用主成分分析法（PCA）、正交偏最小二乘判别法（PLS-DA）分析假手术组与模型组之间的差异代谢物，利用变量重要投影（VIP）值以及T检验筛选出差异代谢物，利用NIST11标准质谱数据库对差异代谢物进行快速鉴定分析。结果 辛芍组方能明显改善脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经行为功能，降低脑梗死体积比，并从尿液中筛选鉴别出19个差异代谢物。结论：辛芍组方能够调节脑缺血再灌注损伤后的代谢平衡，提示辛芍组方可能是通过相关代谢通路进行调节，从而达到抗脑缺血再灌注损伤的作用。关键词：辛芍组方；脑缺血再灌注损伤；代谢组学；气相色谱-质谱；差异代谢物Theurinemetabonomicsinvestigationofanti-cerebralischemiareperfusioninjuryfromtheXinshaoformulawasbasedonGas chromatography - mass spectrometryAbstract：Objective XinShao formula, which consists of Erigeron breviscapus and Paeonia veitchii, is widely of folk prescription used to treat stroke and hemiplegia. On the basis of confirming effective component and effectiveness of the treatment of middle cerebral artery occlusion (MCAO) of Xinshao formula, the change of endogenous metabolites and the action mechanism in MACO rats after orally giving Xinshao formula based metabolomics approach were investigated. Methods（1）The rats were randomly divided into four groups including:sham operation group, Xinshao group ,model group and positive drug group. The cerebral ischemia-reperfusion model of SD rats was duplicated with improved Z-Longa method. The pharmacodynamics of Xinshao treating cerebral ischemia-reperfusion injury was investigated by comparing the neurological behavior, cerebral infarction rate. (2)The serum fingerprint of MACO rats was established by gas-chromatography-mass spectrometry. PCA (Principal Component Analysis )and PLS-DA (partial least squares-discriiminate analysis) were utilized to reveal differences between the sham and model group. The potential differences metabolites were identified according to the variable importance in the projection (VIP) and t-test. NIST 11 was used to identify the detected differences metabolites. Results Xinshao formula could significantly-ameliorate the neurological behavior in MACO rat. Through metabolomics research, 23 kinds of potential biomarker correlated to cerebral ischemia-reperfusion injury in serum. Conclusion Xin shao formula can efficiently regulate the metabolic balance of MCAO rats with cerebral ischemia after reperfusion from the diseased condition, indicating the Xinshao formula play a role in cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating the related metabolic pathways. Key Words： XinShao formula; Cerebral ischemia - reperfusion injury; Metabolites; Metabolomics; Gas-chromatography-mass spectrometry; differences metabolites1.前言“辛芍组方”由灯盏细辛和赤芍配伍组成，通常将两者以汤剂煎服用于治疗偏瘫，具有活血化瘀、通经活络的功效，且疗效显著 1-4。注射用辛芍组方冻干粉针是一种新型中药，其采用现代技术进行提取纯化赤芍、灯盏的有效成分，即赤芍苷和野黄芩苷，并经过冷冻干燥工艺，从而制成注射制剂，该种制剂药物具有较好的临床基础。赤芍苷对于血浆黏度以及机体微循环状态都有改善和优化作用，对大鼠神经细胞缺血损伤有显著保护作用5-7。野黄芩苷可抑制髓过氧化物酶（MPO）活性表达，促进微血管开放和增加大鼠脑血流状态，并改善缺血脑组织局部脑血流量( rCBF )和模型动物的临床症状，对脑缺血性大鼠有明显保护作用 8-9。注射用辛芍能够消除MCAO大鼠行为障碍，降低或改善脑梗死率及缺血所致组织病理改变，降低一氧化氮合酶（NOS）活性及丙二醛（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）活力，其作用机制与增强病灶组织抗氧化和改善缺血模型动物脑微循环有关10。代谢组学(Metabonomics/Metabolomics) 11是通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如基因变异或环境变化后），其代谢产物（内源性代谢产物）数量、种类及其变化规律的科学。它强调将机体看做一个整体进行研究，这与多靶点协同整合作用、中药治病整体性极为相似，为中药复方研究提供了崭新的、强有利的技术手段12。作为一种后基因组学和蛋白质组学时代的新兴研究领域，代谢组学在各个领域得到了越来越多的关注13。气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术应用于代谢组学的研究不仅能够提供较高的分辨率和检测灵敏度，而且有可供参考、对照的标准谱图库，可重复稳定地检测到上百个代谢物，进而可方便地得到待分析代谢组分的定性结果13。此外，随着化学衍生化技术(derivatization)的发展，生物样本中氨基酸类、有机酸类和脂肪酸类等多种物质均可以通过衍生化而成为气态，从而使GC-MS能够进行分析和检测13。课题组前期对辛芍组方的化学成分与组方的合理性进行了系统的研究，结果表明辛芍组方可增强病灶组织抗氧化能力，增加脑血流量，抗脑缺血再灌注损伤作用明显6-8。但其抗脑缺血再灌注损伤的多靶点作用机制尚不明确，基于此，本文以病理状态下大鼠内源性代谢物的变化为切入点，利用代谢组学为研究手段，探究在病理状态下大鼠内源性物质变化，即给予辛芍组方后，大鼠内源性物质的相应改变。通过采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析方法，建立尿液样品代谢指纹图谱，利用主成分分析法（PCA）、正交偏最小二乘判别法（PLS-DA）分析假手术组与模型组之间的差异代谢物，以及利用变量重要投影（VIP）值与T检验筛选出差异代谢物和NIST11质谱数据库对差异代谢物进行快速鉴定分析，为辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的作用机制研究及该组方的深层次开发利用奠定一定基础。2.材料与方法2.1实验材料2.1.1实验试剂75%酒精（贵州利健消毒制品有限公司）；0.9 %氯化钠注射液（广西裕源药业有限公司）；水合氯醛（纯度0.99，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；2838型号线栓（北京西浓科技有限公司）；2,3,5-氯化三苯基四氮唑染料（TTC，购自美国Sigma公司）；PBS磷酸缓冲液（购自于Solarbio公司）；甲醇为色谱醇，购置于德国Merck公司；正庚烷为色谱纯，吡啶（无水级，纯度99.9%）、甲氧胺盐酸盐，购置于aladdin；丙酮为分析醇，购置于天津科密欧化学试剂有限公司；N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（MSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS）均购置于sigma-alorich；尼莫地平片（亚宝药业，批号：150444）；注射用辛芍组方冻干粉针由贵州省药物制剂重点实验室提供（批号20130527）。2.1.2实验仪器96孔培养板（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；大鼠脑切片模具(东莞市捷凯精工电子有限公司)；手术器械、缝合针、非吸收性缝合线（均购自新华手术器械有限公司）。代谢笼（意大利 Tecniplast公司），EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，-80冰箱（美国Thermo 公司），Allegra 64R低温高速离心机(美国Beckman Coulter 公司)，THZ-82 水浴恒温振荡器；Water purifier 实验室专用超纯水机（沃特尔水处理设备有限公司）；微量移液器（德国 eppendorf股份公司）；680型酶标仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）。Agilent 7890A/5975C-GC/MSD气相色谱-质谱联用仪，配备自动进样器，ChemStation工作站和NIST质谱数据库，B-5MS（30 m0.25 mm，0.25 m）气相色谱柱（Agilent Technologies，美国）； ZH-2涡旋混合器（天津药典标准仪器厂）；GZX-9240 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；ZDP-150培养振荡器（上海习仁科学仪器有限公司），ABSON TMC恒温孵育箱（美国）；氮气发生器（型号XYN-20L PSA，上海析友分析仪器有限公司）。2.1.3实验动物健康雄性SD大鼠，SPF级，体重为（280300）g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供（批号SCXK(湘)2014-0011）。实验前一周放入实验室（室温22 2，相对湿度（45%65%）饲养使其适应环境，实验过程中大鼠自由摄食和饮水。2.2实验方法2.2.1试液配制（1）10%水合氯醛溶液：称取1.0 g水合氯醛于10 mL容量瓶中，用0.9%的生理盐水，定容至刻度。（2）1 % TTC溶液：称取1.0 g TTC粉末置于棕色容量瓶中，用PBS缓冲液定容至100 mL，充分溶解，4 避光保存。（3）4 % 多聚甲醛：称取4.0 g多聚甲醛，加入PBS缓冲液100 mL，密封，于37 C水浴48 h，溶解，调pH为7.4，即得4 % 多聚甲醛，4 C保存。（4）甲氧胺吡啶：称取甲氧胺盐酸盐150 mg于10 mL的容量瓶中，无水吡啶定容至刻度，配制成浓度为15 mg/mL的溶液。（5）MSTFA(含1%TMCS)溶液：吸取MSTFA 990 L加TMCS 10 L，混匀即得。2.2.2 MCAO模型的制备采用改良的Zea-Longa14方法复制大鼠MCAO模型。健康雄性SD大鼠280300 g，术前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）。大鼠麻醉后，仰卧固定于手术台上。用75 % 酒精消毒皮肤，颈正中切开，将胸锁乳突肌、二腹肌和胸骨舌骨肌三肌肉交叉处钝性分离。用拉钩撑开三肌肉，将右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉（ICA）（注意避免伤到迷走神经）分离，用0号线结扎ECA和CCA近心端，用微动脉夹夹闭ICA。用维纳斯剪在CCA上开小口，将栓线自CCA小口插入，经分叉处通过ICA入颅至大脑中动脉（MCA），插入线栓深度约为1820 mm。用4号非吸收性缝合线固定插入中动脉的线栓，防止滑落。缝合肌肉和皮肤（术后适量头孢呋辛洒于伤口预防感染），回代谢笼饲养。1 h后缓慢外拉栓线使其球端回至CCA内，进行大鼠再灌注。恢复大脑中动脉的供血，中动脉缺血再灌注造模完成。整个过程保持大鼠体温在37 C。放回单独的代谢笼中（如图1），期间正常饮食，饮水。假手术组除不插栓线外其余步骤同上。以上过程均在室温（222）条件下进行。图1 代谢笼Fig.1 metabolic cage2.2.3实验分组（1）假手术组（Sham）：除不插栓线外，同制备MACO方法一致（分别给予等量生理盐水）；（2）模型组（Mod）：成功制备成MACO模型的大鼠（分别给予等量生理盐水）；（3）辛芍组（XS）：成功制备成MACO模型的大鼠，给药量（辛芍冻干粉针：12.5 gkg-1）；（4）阳性药组（Pos）：成功制备成MACO模型的大鼠，给药量（尼莫地平：12.6 mgkg-1）。MACO手术24h后进行神经行为学评分。2.2.4给药方法选取健康SD 大鼠，体重范围为280300 g，雄性，共分为4组，分别为假手术组、MCAO模型组、辛芍组、阳性药组，每组6只。放入代谢笼中进行观察，期间正常饮食及饮水。假手术组、模型组、辛芍组、阳性药组手术开始前两天开始给药，第三天给药30 min进行手术，每天给药一次，连续给药10天，假手术组、模型组予等体积的蒸馏水，予辛芍组（12.5 gkg-1），阳性药组（12.6 mgkg-1)。第3天给药30min后进行脑缺血再灌注损伤模型手术，假手术组除不插栓线外，其它步骤均和模型组一致。模型组、辛芍组、阳性药组于缺血1h后进行再灌注，缓慢外拉栓线使其球端回至CCA内，恢复大脑中动脉的供血，中动脉缺血再灌注造模完成后，放回代谢笼中进行饲养，在造模后连续给药7天。2.2.5样本收集收集大鼠（第0天）和手术后（第1、3、7天）24 h的尿液样品，离心10 min （4，3500 rpm），取上清液，快速分装为500 L/支，-80保存。2.2.6神经行为学评分参照Longa16的5级4分法，对缺血再灌注24 h后的大鼠进行评分，记录神经功能缺失症状，评分标准如下：0分，未观察到神经功能缺陷症状；1 分，手术对侧前爪不能完全伸展 ( 轻度局灶性神经功能缺陷) ； 2 分，向手术对侧转圈( 中度局灶性神经功能缺陷) ； 3 分，向手术对侧倾倒( 重度局灶性神经功能缺陷) ；4 分，不能自发行走，意识昏迷。评分为1 3 分为造模成功，纳入试验。2.2.7脑梗死体积比的测定收集完第7天的样品，大鼠股动脉取血后，立即开颅取脑，去除小脑和嗅球后，放置于冰箱-20下，15 min后取出，将大脑以冠状面均匀切成2 mm厚脑片，一共5片。迅速将脑片置于10 mL 1% TTC的磷酸缓冲液中，37水浴10 min，避光，其中每隔5 min翻动一次。TTC染色后，梗塞组织呈白色而正常组织呈玫瑰红色，界限分明。水浴后用4%多聚甲醛溶液固定，3天后将脑片照相。利用Image-proPlus 6.0进行梗死面积的计算，计算其正反面的梗死面积，及全脑的梗死面积，据此计算梗死体积百分率。2.2.8 QC样本制备取冻存后尿样在室温下解冻，分别取各组解冻尿液样品50 L于同一离心管中，涡混，以100 L每管快速分装至1.5 mL离心管中，-80保存，作为质控样本。2.2.9尿液样品前处理取冻存后尿样在室温下解冻，取尿样上清液50 L，加60单位（30U/10L）的脲酶，涡混30 s，在37恒温孵育箱中孵化15 min，加入180 L的甲醇，混匀，离心（13000 rpm，10 min，4)。取200 L上清液至GC进样瓶中，用氮吹仪吹干脱水。脱水后的样品加入50 L 15 mg/ml甲氧胺吡啶溶液，涡混30 s，在培养振荡器中肟化90 min（30，200 rpm）。加入有1%的TMCS的MSTFA 50 L，涡混30 s，在70 保持60 min。放冷，加入120 L正庚烷，涡混30 s，转移至1.5 mL的EP管中，混匀，离心（12000 rpm，10 min，4）。取上清液，待GC-MS分析。每次进行尿液样品处理时均带上QC样品，QC样本的制备方法与尿液样品的制备方法一致，以控制该批次样品处理的质量。2.2.10尿液样品色谱条件表1 气质联用仪（GC-MS）分析条件Tab.1 The GC-MS chromatographic conditions仪器型号Agilent 7890A/5975C-GC/MSD（美国）毛细管柱类型DB-5MS进样量1 L进样口温度270离子源230四级杆150电压70 eV分流模式不分流(0.75 min)载气氦气气流模式恒流（1 ml.min-1）溶剂延迟4 min扫描范围（Da）40-600传输线温度280表2 GC-MS 色谱柱升温程序Tab.2 GC-MS column temperature program速率（/min）温度保持时间min08025240101028021531032.2.11尿液方法学考察2.2.11.1日内精密度取一份尿液样品，按照“2.2.9”项下尿液样品前处理方法制备，连续进样六次（0、2、6、12、18、24h），将6次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图2)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD%)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.4 %-4.0 %之间。图2 尿液样品日内精密度考察Fig. 2 intra day precision of urine samplesS1-S6分别为：0、2、6、12、18、24 h GC-MS考察结果2.2.11.2日间精密度图3 尿液样本日间精密度考察Fig. 3 inter-day precision of urine samplesS1：第一天精密度考察TIC图 ；S2：第二天精密度考察TIC图；S3：第三天精密度考察TIC图取同一尿液样品，平行制备5份，按照“2.2.9”项下尿液样品前处理方法制备，分别在1、2、3天同一时间进样，即在每天进样一次，将每次进样后的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图3 )，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD%)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.8%-6.2%之间。2.2.11.3重复性考察取同一尿液样品，平行制备5份，按照“2.2.9”项下尿液样品前处理方法制备，将每次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图4)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD%)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.0%-3.9%之间。图4 尿液样本重复性考察Fig. 4 reproducibility of urine samples2.2.11.4冻融稳定性考察取一份尿液样品待冻融后吸取100 L于离心管中，平行5份，剩余尿液样品迅速放回-80超低温冰箱，如此往复三次，按照“2.2.9”项下尿液样品前处理方法制备，将每次进样后TIC图的色谱峰个数进行比较(见图5)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD%)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.9%-7.3%之间。图5尿液样本冻融稳定性考察Fig. 5 stability of frozen thawed urine samplesS1：第一次冻融TIC图 ；S2：第二次冻融TIC图；S3：第三次冻融TIC图2.2.11.5 QC样本的考察图6 QC样本考察结果Fig.6QC sample resultsS1：第一批次随行QC TIC图S2：第二批次随行QC TIC图;S3：第三批次随行QC TIC图S4: 第四批次随行QC TIC图S5: 第五批次随行QC TIC图;S6:第六批次随行QC TIC图随机抽取每批次随行处理的QC样品2个，进行分析，结果见图6，比较每次进样后得到的TIC图中色谱峰个数，及10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD%)，结果色谱峰个数均一致，RSD均在2.5%-6.5%之间。2.2.12数据处理脑梗死体积比的测定采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，结果用meanSD表示，组间比较采用单因素方差分析进行，P0.05为有统计学差异。在获得GC-MS数据后，利用Agilent MSD Chemstation分析软件将原始数据转换为通用的NetCDF格式，导入基于R编程软件的XCMS的软件进行色谱峰提取、去噪、峰匹配、保留时间的矫正、数据导出、保存，将得到的数据进行峰面积归一化处理，采用修正80%规则去除数据缺失值，将获得发数据进行多元统计分析。利用SIMCA-P13.0（Umetrics AB，瑞典）软件对导入尿液样品数据进行模式识别分析，使用PCA、PLS-DA方法建模，利用SPSS17.0进行T检验。3. 结果3.1大鼠神经行为学评分神经行为学评分为0分、4分的或者死亡的舍去，假手术组除外。实验结果表明，大鼠缺血再灌注24 h后，模型组、辛芍组、阳性药组大鼠提起鼠尾前肢弯曲，不能正常行走，向偏瘫侧转圈，严重者行走时向偏瘫侧倾倒。MACO大鼠行为学表现见图7。参照Longa16的4分法评分标准，假手术组大鼠神经行为学得分为0，无明显神经功能缺失体征。Mod组大鼠神经功能评分为2.67 0.25。XS组与Pos组与Mod组比较，XS组与Pos组大鼠神经功能评分均具有不同程度的减小，具有统计学差异（P0.01），结果表明，辛芍组方能够改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经行为学评分，有一定的脑保护作用。图7 MACO大鼠神经行为学评分Fig.7 Neurological deficits score of MCAO rats表3各组大鼠的神经行为学评分值 (s,n=6)Tab.3 neurological deficits score of the four groups（SD, n=6）GroupNeurological deficits Score(24h)Sham0Mod2.670.25#XS2.070.11*#Pos1.910.10*#P0.05 vs. Sham group; *P0.01 vs. Mod group图8 各组大鼠的神经行为学评分值Fig.8 neurological deficits score of the four groups（SD, n=6）#P0.05 vs. Sham group; *P0.05 vs. Mod group.3.2脑梗死体积比实验结果表明，Sham组未出现梗死灶，Mod组以及XS组，Pos组均出现不同程度梗死灶，经TTC染色后，未缺血部分显红色，缺血部分则呈现出白色。界限分明，Mod梗死体积占24.244.60%，XS组与Pos组梗死体积比分别为19.222.40%、18.982.82%，两组的梗死体积比均小于Mod组，具有显著性差异（p0.05），以上结果表明，辛芍组方可以明显缩小由脑缺血再灌注损伤造成的脑梗死体积。（见图9，10，见表4）Sham Mod XS Pos图9 大脑TTC染色结果Fig.9 The TTC stained result表4 各组大鼠的脑梗死体积比(s,n=6)Tab.4 neurological deficits score of the four groups（SD, n=6）GroupInfarct volume percentage(%)Sham0Mod24.244.60XS19.212.38*#Pos18.982.82*#P0.01 vs. Sham group; *P0.05 vs. Mod group;图10各组大鼠的脑梗死体积比(s,n=6)#P0.01 vs. Sham group; *P1，说明内源性差异代谢物对于各组别的差异贡献较大，而这种变化与分类密切相关，即这种物质可能是组间的潜在差异代谢物；同时结合T检验P700），进行分析鉴定，如图11。图11 代谢物的鉴定流程图Fig.11 The flow chart of metabolite identificationA为某个样品的TIC图；B指定色谱峰的解卷积的保留时间；C数据谱库和指定的色谱峰比较（白色为解卷积处理后提取的干净的质谱图，黑色为标准谱库里的质谱图）；D待匹配的质谱图；E与NIST数据库中的标准图匹配的匹配度；F匹配度最高的物质的结构式及质谱图；G确认的成分及分子式等信息。3.4尿液代谢物GC-MS分析结果代谢组学分析仪器主要有核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱联用（GC-MS、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、毛细管电泳-质谱联用（CE-MS，光谱等。其中GC-MS具有高分辨率、高灵敏度、选择性高、稳定性好等特点，并且具有可供参考、对照的标准数据库，被广泛应用于代谢组学研究中。本课题采用GC-MS对尿液样品进行检测分析，对尿液样品进行方法学考察，建立指纹图谱分析方法。3.4.1.假手术组与模型组的尿液样本PCA分析图12 基于GC-MS数据的二维PCA示意图Fig.12 PCA score plot of rats urine based on GC-MS用非监督的主成分PCA模型来考察Sham组、Mod组的分类趋势。观察在非监督的情况下，两组代谢谱的分布情况。反映组间离散程度的PCA得分图见图12，由图可以看出，Sham组与Mod组的样本点分离良好，并在95%的置信区间内聚集良好，说明MACO手术导致大鼠正常的代谢被干扰，从内源性代谢物变化认为MACO模型建立成功。3.4.2假手术组与模型组的尿液样本PLS-DA分析图13 基于GC-MS数据的二维PLS-DA示意图Fig.13 PLS-DA score plot of rats urine based on GC-MS相对于无监督的PCA来说，有监督的PLS-DA更关注对分类中做出显著贡献的化合物。为了更进一步的了解MACO导致的内源性差异代谢物含量变化，因此，本研究采用PLS-DA建模来筛选假手术组与模型组之间的差异代谢物，见图14，从PLS-DA图可以看出，模型组与假手术组之间的差异代谢物完全分离，说明通过对大鼠进行MACO手术，大鼠体内的代谢物发生显著性变化。根据PLS-DA模型中变量重要性投影分析VIP值，选择VIP1的物质，利用T检验对内源性代谢物含量变化差异显著性进行分析，同时满足VIP1，以及p0.05属于潜在差异代谢物。同尿液样本差异代谢物的鉴定方法一致，利用NIST 11数据库进行鉴定，最后鉴定出19个差异代谢物，各差异代谢物在信息如表5。表5 尿液中差异代谢物Tab. 5 differential metabolites in urine编号保留时间（min）差异代谢物名称元素组成VIP值P值112.33442-AminophenolC6H7NO1.36220.0402215.5066L-Pyroglutamic acidC5H9NO21.44940.0314317.80102-( methoxyimino) Pentanedioic acidC5H8O41.40640.0290425.6693Vanillic acidC8H8O41.48350.0197528.86023,5-Dihydroxybenzoic acidC7H6O41.41140.0413628.8700Citric acidC6H8O71.35480.0468728.9027D-PinitolC7H14O61.35490.0401829.5498Hippuric acidC9H9NO31.48740.0467932.6327MannitolC6H14O61.96120.00031033.1442MyoInositolC6H12O61.38660.03551134.3947D-Gluconic acidC6H12O71.67980.00701234.5867Glucaric acidC6H10O81.84250.00161335.7212Hexadecanoic acidC16H32O21.40060.03781437.0248Uric acidC5H4N4O31.87710.00561539.9502Octadecanoic acidC18H36O21.45220.02511641.6578D-RiboseC5H10O51.32970.04891741.6602Pseudouridine C9H12N2O61.37230.03931847.5282LactoseC12H22O111.69600.00531948.3358D-(+)-CellobioseC12H22O111.68140.00483.4.3.各差异代谢物的相对含量表6尿液差异代谢物相对含量变化趋势Tab. 6 variation of relative metabolites in urine差异代谢物名称保留时间（min）ShamModXSPos2-Aminophenol12.33440.380.330.060.030.380.27#0.360.03#L-Pyroglutamic acid15.50662.340.804.071.033.070.15#2.901.05#2-( methoxyimino) Pentanedioic acid17.80100.820.310.370.310.550.20#0.580.25#Vanillic acid25.66931.661.200.280.160.600.20#0.320.103,5-Dihydroxybenzoic acid28.86021.140.420.660.290.770.310.740.28Citric acid28.87000.130.040.070.030.110.02#0.100.01#D-Pinitol28.90271.700.690.810.201.020.171.210.32Hippuric acid29.54980.240.120.120.040.430.18#0.350.08D-Mannitol32.63272.990.501.400.491.610.821.750.66Myo-Inositol33.14420.040.020.010.000.290.00#0.030.00#D-Gluconic acid34.39472.240.301.430.141.630.12#1.720.15#Glucaric acid34.58670.580.050.300.150.420.180.440.20Hexadecanoic acid35.72120.550.090.760.190.620.140.600.15Uric acid37.02480.160.140.540.160.220.083#0.320.04#Octadecanoic acid39.95024.28 0.765.721.104.680.684.450.89D-Ribose41.65780.160.050.260.100.180.04#0.180.08#Pseudouridine41.66022.740.614.080.623.030.28#2.890.31#Lactose47.52822.810.841.440.442.080.44#2.210.23#D-(+)-Cellobiose48.33581.880.590.840.221.180.16#1.310.25#P700），进行鉴定分析。假手术组与模型组的尿液样本PCA分析表明Sham组与Mod组的样本点分离良好，说明MACO手术导致大鼠正常的代谢被干扰，从内源性代谢物变化表明MACO模型建立成功。PLS-DA分析表明假手术组与模型组之间的差异代谢物完全分离，说明通过对大鼠进行MACO手术，大鼠体内的代谢物发生显著性变化。利用NIST 11数据库对尿液样本代谢物进行鉴定得出19个差异代谢物，并测出尿液差异代谢物相对含量变化趋势。非监督的主成分PCA模型考察表明辛芍组的各时间点有分离趋势，说明MACO手术导致大鼠正常的代谢被干扰，给予辛芍组方后大鼠代谢紊乱状态发生改变，有向正常状态发展的趋势。有监督的PLS-DA模型表明辛芍组各时间点分离良好，说明通过对大鼠进行MACO手术，大鼠体内的代谢物发生显著性变化，给予辛芍组方后，差异代谢物发生回调，且有往正常状态发展的趋势。从内源性差异代谢物的变化可以看出辛芍组方抗大鼠脑缺血再灌注损伤的有效性，表明辛芍组方能够调节脑缺血再灌注损伤后的代谢平衡，这提示辛芍组方可能是通过相关代谢通路进行调节，以达到抗脑缺血再灌注损伤的作用，从而为阐明该组方抗脑缺血再灌注损伤的作用机制奠定一定基础。参考文献1 苏红,王爱民,王永林,等.注射用辛芍（冻干粉针）指纹图谱研究J.中国中药杂志,2007,32(15）:1515-1517.2 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