沙门菌的检验技术.ppt

沙门氏菌（Salmonella）的检验,DANIELELMERSALMON,(1850-1914)美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第一位兽医学博士。1884年任美国农业部畜牧局首任局长。他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门氏菌。在医学微生物中通用的沙门菌一词，就是为纪念他而以他的名字命名的。,沙门菌（Salmonella）,是一大群寄生于动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌,一、沙门氏菌生物学特性,大小0.61.023um，无芽孢，一般有鞭毛(鸡沙门菌除外)，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为3537，最适pH值为6.87.8。,1、沙门菌生物学性状,G-杆菌0.6-1.0um2-4um周身鞭毛，有菌毛。,形态大小,2、病原学,生化反应,不分解乳糖（亚利桑那菌除外），分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。,3、流行病学,易感动物：各种年龄的动物均感染，幼畜最易感传播途径：主要消化道、呼吸道、伤口等子宫内感染（垂直传播）内源性感染（带菌现象普遍),沙门氏菌属致病性,潜伏期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般12天或更长。感染剂量为1520个菌，死亡率达14%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的粪便可以存在于多类食品中,二、沙门菌病简介,目前至少有67种O抗原和2000个以上血清型，所致疾病称沙门菌病。肠热症-是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。急性肠炎（食物中毒）-是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。败血症-常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引起。,鸡白痢,三、沙门氏菌检验,中华人民共和国国家标准,GB/T4789.4-2010,微生物学检验,本标准代替GB/T4789.4-2008食品卫生微生物检验沙门氏菌检验。本标准与GB/T4789.4-2008相比，主要变化如下：修改了标准的中英文名称；修改了标准的范围；修改了培养基和试剂；修改了设备和材料；修改了附录A。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准所代替的历次版本发布情况为：GB4789.4-84、GB4789.4-1994、GB/T4789.4-2003、GB/T4789.4-2008,前言,本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。,范围,设备和材料,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他还有：,冰箱：25。恒温培养箱均质器振荡器电子天平：感量0.1g无菌锥形瓶:容量500mL，250mL无菌试管,无菌培养皿无菌吸管无菌毛细管pH计或pH比色管或精密pH试纸全自动微生物生化鉴定系统,培养基和试剂,缓冲蛋白胨水（BPW）四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液亚硫酸铋（BS）琼脂HE琼脂木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂沙门氏菌属显色培养基三糖铁（TSI）琼脂,蛋白胨水、靛基质试剂氰化钾（KCN）培养尿素琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基糖发酵管邻硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）培养基半固体琼脂丙二酸钠培养基沙门氏菌O和H诊断血清。生化鉴定试剂盒,操作步骤,1、前增菌第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。2、选择性增菌在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。3、选择性平板分离这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。4、生物化学筛选排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。5、血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。,检样,25g(ml)样品+225mlBPW,1ml+TTB10ml,1ml+SC10ml,361，8h-18h,BS,XLD(或HE、显色培养基),挑取可疑菌落,421，18h24h,361，18h24h,361，40h48h,361，18h24h,沙门氏菌检验程序,生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+,A1,A2,A3,反应结果与左侧描述不符,甘露醇+、山梨醇+,ONPG-,沙门氏菌，血清学试验,非沙门氏菌,报告,TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素（pH7.2），KCN,反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,综合以上生化实验和血清学鉴定的结果，报告25g（ml）样品中检出或未检出沙门氏菌。,结果与报告,前增菌：使食品加工过程中受伤的沙门菌细胞恢复活力未经加工过的食品，检验前不需要前增菌前增菌：25克（加工食品）+225毫升缓冲蛋白胨水37度培养4小时（干蛋品1824小时）。,（一）前增菌,沙门氏菌前增菌培养基,缓冲蛋白胨水(BPW)肉汤：,是基础增菌培养基，不含任何抑制成,分，有利于受损伤的沙门氏菌复苏。使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。2003版本标准仅用于加工食品或冷冻食品的前增菌。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,（二）选择性增菌,轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于421培养18h24h。同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于361培养18h24h。一种增菌剂不可能适合所有的沙门菌，所以，要同时使用两种以上的培养基增菌,同时使用TTB、SC2003版本国标还有MMAOAC：TT、SCFDA：RV、TTISO：RV、SC,选择性增菌的目的是最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种选择性分离增菌液，一种是抑制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,沙门氏菌的增菌液,l四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)：含有胆盐，抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与副伤寒沙门氏菌仍能生长。,l亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：可对伤寒及其他沙门氏菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,（三）分离培养,分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于361分别培养18h24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征,返回,使用BS、XLD、HE、沙门氏菌显色培养基,2003版本国标：BS、DHL（或HE、WS、SS）,FDA：BS、XLD、HEAOAC：BS、XLD、HE,ISO：phenolredbrilliantgreen琼脂、BS或HE,为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。,沙门氏菌分离培养基,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,沙门氏菌分离培养基,l亚硫酸铋琼脂（BS）：含有煌绿、亚硫酸铋能抑制大肠埃希氏菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长，但对伤寒、副伤寒等沙门氏菌的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门氏菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环，对光观察可见有金属光泽。该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用时配制，超过48h不宜使用。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,l沙门氏菌菌落形态：,黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,lHE琼脂：在保证细菌所需营养的基础上，加入了一些抑,制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去氧胆酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革兰氏阳性菌的生长，但对革兰氏染色阴性的肠道致病菌则无抑制作用。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,l沙门氏菌在HE琼脂上的菌落形态：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,lXLD琼脂：培养基中含有去氧胆酸钠作指示剂，在该浓度下的去氧胆酸钠也同时作为大肠埃希氏菌的抑制剂，而不影响沙门氏菌属和志贺氏菌属的生长。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,lXLD琼脂：粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,lXLD培养基分离沙门氏菌和志贺氏菌的敏感性超过了传统培养基，如：EMB、SS。因这些培养基尚有抑制志贺氏菌属生长的潜在因素，故本培养基是分离鉴定沙门氏菌及志贺氏菌属的可靠培养基。在,国外广泛使用。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,l沙门氏菌显色培养基主要用于快速筛选、分离沙门氏菌。其基本原理：利用沙门氏菌特异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离出来，沙门氏菌在培养基上呈紫色或紫红色。而大肠埃希氏菌等其他肠杆菌呈蓝绿色。,沙门氏菌辛酸脂酶,色原-特定结合物无色,色原特定结合物游离,显色PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,SS琼脂,上面的志贺氏菌和沙门氏菌,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,SS琼脂上面的沙门氏菌,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,DHL琼脂上面的沙门氏菌,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,BS琼,脂,上面的志贺氏菌和沙门氏菌,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,分离培养中的注意要点,l非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型或可疑沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。,lHE和XLD琼脂：非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和XLD平板经242h培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。显色琼脂另外。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,lBS琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养242h后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养242h。如果经482h培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。,分离培养中的注意要点,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,（四）革兰染色,沙门氏菌：革兰阴性杆菌,（五）五项生化试验,1、三糖铁琼脂试验2、靛基质试验（吲哚试验）3、尿素酶试验4、氰化钾试验（KCN）5、赖氨酸脱羧酶试验,自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于361培养18h24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,2003版本国标中生化鉴定是将可疑菌落同时接种于三糖铁（TSI）琼脂、蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基；,2010版本修改为：接种TSI琼脂和赖氨,酸脱羧酶试验培养基的同时增加一项营养琼脂（NA），经TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量，同时也满足了下一步生化鉴定的需要。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,三糖铁、赖氨酸反应情况,绝大多数沙门菌属，极少数为爱德华菌属甲型副伤寒（约10%的甲副HS呈阳性）伤寒杆菌（HS仅在穿刺线出现）沙门氏菌亚属伟劳地柠檬酸杆菌/变形杆菌，极少数为甲型副伤寒杆菌柠檬酸杆菌属,A1A2A3A4B1B2,判定,动力,赖氨酸,乳糖HS,葡萄糖,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,赖氨酸脱羧酶试验,注：本试验的阳性反应为培养基不改变颜色，而培养基变黄色者为阴性反应。本试验一定要设空白对照。培养基需用液体石蜡封盖，阻止空气的氧化作用。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,氰化钾试验l氰化钾试验培养基：蛋白胨、磷酸盐缓冲液、氯化钠、氰化钾。l原理：氰化钾是剧毒药物，可抑制某些细菌的呼吸酶系统，使这些酶失去活性，细菌的生长因此受到抑制。而某些细菌可对氰化钾产生抗性，能在氰化钾培养中生长。本试验常用于沙门氏菌与柠檬酸杆菌的鉴定。l沙门氏菌生长情况：阴性（不生长）。,l,注：本试验必需设置对照管（不加氰化钾），若对照管细菌生长良好，试验管细菌不生长，可判定为阴性。若对照管与试验管均无细菌生长，则应重复试验。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，生成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低细菌生长，呈假阳性反应。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,靛基质（吲哚）试验阴性（液面黄）阳性（液面玫瑰红）,尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）,ONPG试验阳性（黄）空白,丙二酸盐试验阳性（兰）阴性（不变）,ONPG试验阳性（黄）空白,（六）三糖铁琼脂(TSI)介绍,三糖铁琼脂(TSI)成分：蛋白胨20.0g牛肉膏3.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵(含6个结晶水)0.5g酚红0.025g或5g/L溶液5mL氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.5g琼脂12.0g蒸馏水1000.0mL,可疑菌落生化鉴定l三糖铁的主要成分：蛋白,胨、乳糖、蔗糖、葡萄糖、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠、酚红、琼脂。,l在TSI琼脂中有2个指示剂,体系：,l酚红：在碱性环境中呈红色；在酸性环境中呈黄色。,l硫酸亚铁铵：是硫化氢的指示剂，可与硫化氢反应生成硫化铁呈黑色。硫代硫酸钠可防止硫化氢氧化形成S-S基而影响反应。,PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建,TSI生化原理,斜面部分暴露于空气中，为有氧环境。而下部与空气隔绝是相对厌氧的环境。因此TSI时，最重要的是斜面部分和管下部琼脂的长度，两者均为3cm，以保证两部分相对应的有氧或厌氧环境。,测试时使用接种针先穿刺至底部，而后于斜面作划线接种，经培养18-24小时后，依情况判断糖类发酵情形。,观察结果：有三种类型,A.非发酵型：无碳氢化合物发酵，所以无酸产生，斜面上琼脂的肽降解产物是碱性物质导致斜面变红。这种类型的细菌称为非发酵型。,B.非乳糖发酵型:如果接种的是发酵葡萄糖不发酵乳糖的细菌，培养基内仅有0.1%葡萄糖可以产酸。开始阶段，培养8-12h时，产生的酸足以引起斜面和底部颜色变成黄色。在接下来的时间里，葡萄糖被完全消耗，斜面部分的细菌在有氧条件下开始氧化降解氨基酸，产生的胺类很快就中和斜面上存在的酸；到18-24h，整个斜面又转换成碱性PH，颜色有变成红色。深部（厌氧区域），氨基酸降解不足以中和形成的酸，培养基仍为黄色。,C.乳糖（蔗糖）发酵型,三糖铁（TSI）试验,肠道杆菌科为革兰氏阴性菌，可发酵葡萄糖产酸。利用糖类发酵之不同与硫化氢产生与否，加以区分。三糖铁琼脂斜面培养基含有1乳糖及蔗糖与0.1葡萄糖作为发酵基质，且以酚红作为酸碱指示剂，如培养基由橘红转为黄色，表示有糖类发酵,三糖铁（TSI）琼脂试验,本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。,制好的培养基,对照管,斜面红色，底面黄色,培养基全黄色,斜面、底部黄色，并产生H2S,斜面红色，底部黑色，产生H2S,底面黄色，并产生CO2,（1）斜面碱性（红色-）底部酸性（黄色+）产气或不产气（产气时会造成琼脂裂开）：表示仅葡萄糖发酵。因微生物优先分解葡萄糖产酸，使培养基变黄，但因葡萄糖含量低，于斜面产生之微量酸立即氧化而呈碱性反应，同时培养基中的蛋白质也随之利用而产碱，培养基底部则因氧张力较小，且微生物生长较慢，故仍维持酸性反应。（2）斜面酸性（黄色+）底部酸性（黄色+）产气或不产气：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖与（或）蔗糖也发酵。由于乳糖与蔗糖浓度高，经继续发酵，可维持培养基斜面与底部保持酸性反应。,（3）斜面碱性（红色-）底部碱性（红色-）或无变化（橘红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则于有氧或厌氧条件下进行代谢产生氨，而使培养基呈碱性反应，如有氧与厌氧均发生蛋白质分解，则斜面与底部均呈碱性反应。为使结果准确，应于接种培养18-24小时内观察结果，以确保糖类尚未用尽，且蛋白质分解之碱性终产物尚未产生。,培养基变黑,（4）三糖铁琼脂培养基中亦含有硫代硫酸钠若微生物有硫化氢产生，会与亚铁离子作用生成不溶性硫化亚铁之沉淀，进而使培养基变黑。,肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果,肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表,a）抗原的准备一般采用1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如23）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.550.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.30.4半固体琼脂的小玻管1次2次,自远端取菌培养后再检查。,(七）血清学鉴定,返回,b）多价菌体抗原（O）鉴定在玻片上划出2个约1cm2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。c）多价鞭毛抗原（H）鉴定同b）。d）血清学分型（选做项目）,返回,PDF文件使用pdfFactoryP