仪器分析复习.doc

1 分析仪器的性能指标 精密度：分析数据的精密度指同一台分析仪器的同一方法多次测定得到数据间的一致程度 灵敏度：指区别具有微小浓度差异分析能力的度量，取决于校准曲线的斜率和仪器设备的重现性或精密度。 检出限：物质检出的最低浓度范围 动态范围（线性范围） 响应速度：指仪器对检测信号的反应速度，定义为仪器达到信号总变化量一定百分数所需的时间 分辨率：指仪器鉴别由两组近组分产生信号的能力，不同类型仪器分辨率的指标不同2 仪器定量校准方法：内标法和外标法 内标法：标准物质和被测定物质不是同一物质 外标法：标准物质与被测定物质是同一物质3 方法的可靠性 通过实验数据的统计分析来实现的，主要论证的参数有专一性、灵敏度（检出限）、定量限、精密度或稳定性、准确度、耐用性、线性范围、标准曲线、回归方程和回收率等 4 仪器分析的一般过程：取样 样品的采集：样品必须具有代表性，并且不能被污染，也不应有组分的损失； 根据实验目的合理设计取样时间及取样量以及样品保藏方式； 步步留样，样品完成分析后要保留一定时间，以便于出现问题后可以追溯分析 标签清晰：标明物料名称（What）、人（Who）、时间（When）5 仪器分析的一般过程：有效数字 有效数字：实际能测到的数字，反映测量的准确程度，有效数字保留的位数，应根据分析方法和仪器准确度来确定，应使数值中只有最后一位是可疑的； 数字“0”作为普通数字使用，是有效数字，作为定位数字使用，不是有效数字； pH，pKa，log等的有效数字:有效数字位数由小数部分决定，如pH =12.51是两位 有效数字的运算：绝对误差最大者为标准(加减按最少小数位数计算，乘除按最少有效数字位数计算)6朗伯比耳定律 分光光度法的定量依据是朗伯比耳定律（Lambert-Beers Law ） Alg（I0/I）KCL式中：I0为入射光强度； I为透射光强度； A为吸光度； L为液层厚度(即光程长度)； C为溶液浓度； K为吸光系数； 上式是朗伯比耳定律的数学表达式，其物理意义为：当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。 朗伯比耳定律不仅适用于有色溶液，也适用于其它均匀、非散射的吸光物质(包括液体、气体和固体)，是各类吸光光度法的定量依据。 分光光度法测定只适用于稀溶液:0.01M一 Proteome & Proteomics 定义Proteome (蛋白质组) :由1个细胞，或1种器官或组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。Proteomics（蛋白质组学）: 研究在某个时间或某种特定条件下细胞或组织的蛋白表达及其活动规律的科学。二 蛋白质组学的研究内容1.细胞或组织内蛋白质的表达模式及修饰（表达蛋白质组学） ：关键技术：2-D电泳2.蛋白质的胞内分布及移位（细胞图谱蛋白质组学）：确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等。3.蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。4. 蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）：蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用。三、蛋白质组研究的相关技术（一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：2-D电泳 操作（1）等电聚焦。（2）平衡胶条。（3）第二相SDS-PAGE。 （4）2-D胶上蛋白质鉴定 A 早期Western blot鉴定 B Edman降解法鉴定 C 肽质量指纹鉴定 D 蛋白质组信息学（二）研究蛋白质胞内分布及移位的方法1. 研究蛋白质组的高通量方法。分别收集细胞不同区域内蛋白质，然后进行2-D电泳和蛋白质鉴定。2. 将胞内特定蛋白质进行荧光标记，然后在荧光显微镜下进行观察蛋白质移位。（三）构象解析技术1. 实际测定具体蛋白质的三维结构：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。 X-射线单晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。运用原子力显微镜及多功能光学诊断技术深入研究蛋白质晶体生长的机理。2. 通过氨基酸序列知识去辨识和推引出其决定的三维结构（1）用分子力学、分子动力学的方法，根据理化的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。（2）通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新蛋白质空间结构的预测。 （四）研究蛋白质功能模式的技术 酵母双杂交系统 选择性噬菌体感染技术 质谱技术四 蛋白质组学研究中的困难1. 2-D电泳胶上的点只是细胞蛋白质中的一小部分，大部分不能被显示。 2. 2-D胶上显示的蛋白质有偏向性。3. 难溶于水或分子量大于18万的蛋白质难于在2-D胶上显示。 4. 质谱技术虽有较高的灵敏度，但对来自2-D胶上的许多低丰度的蛋白质仍不能鉴定。 五SDS 十二烷基硫酸钠：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白质变性，并且使蛋白质带上均一的负电荷。 DTT 二硫苏糖醇：还原剂，是变性的非烷基化的蛋白质处于还原状态 碘乙酰胺：是蛋白质巯基烷基化，防止它们在电泳过程中重新被氧化。电泳过程中蛋白质的氧化会产生拖尾和其他结果。碘乙酰胺并且能使残留的DTT烷基化，从而防止产生点拖尾和其他银染杂质。碘乙酰胺在进行第二次平衡步骤中加入。六 毛细管电泳1 原理 是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的产物.是离子或荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按其淌度或/和分配系数不同进行高效,快速分离的一种电泳新技术. 电泳淌度：单位场强下离子的平均电泳速度。因为电泳速度与外加电 场强度有关，所以，在电泳中常用淌度而不用速度来描述荷电粒子的电泳行为和特性2 进样方式 流体动力学进样:虹吸，加压，真空; 电动进样3 毛细管区带电泳，capillary zone electrophoresis ，CZE原理: 样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离,比值愈大,跑得愈快. 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。4 电泳和电渗电泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质:内表面带负电荷,溶液带正电荷,电渗流流向阴极;内表面带正电荷,溶液带负电荷,电渗流流向阳极;流式细胞仪1 流式细胞仪系统流程： 标本激光系统流动系统信号处理系统放大系统计算机系统结果打印 染过色的细胞(105-107细胞/ml)488激发(或其他波长激发) 光信号对数(FSC/SSC)或线性(荧光)检测直方图(单参数)，二维图(双参数) 统计学报告2 测量参数1）散射光信号（前向角散射和侧向角散射）：用于分辨颗粒的大小和颗粒的密度（细胞的物理固有参数）。 (1)前向角散射，即FSC与细胞的大小（直径的平方）相关，我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。 (2)侧向角散射，即SSC它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，提供了细胞内精细结构及颗粒性质的信息，反映了颗粒密度。散色光 :散色光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异，通常使用“散点图”来看散射光信号，散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据。2）.荧光信号：用于区分染色过的细胞的荧光结合量的高低。 两种荧光信号：自发荧光信号 特异荧光信号 通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。测量荧光信号的主要参数： （1）荧光信号的线性测量和对数测量模式 （2）细胞高度（一般做周期）、面积（一般做表达）和宽度的荧光信号测量 （3）光谱重叠的校正(调节荧光补偿电压)， 因FL1、FL2、FL3是来自于同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。4） 荧光信号线性测量和对数测量模式 线性测量：输出信号与输入信号成线性关系。适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA、RNA、总蛋白含量的测量。 对数测量：输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数测量。细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。离子色谱一、离子交换色谱基本原理 HPIC的分离机理主要是离子交换，是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷溶质离子之间进行的可逆交换，依据这些离子对交换剂（固定相）有不同的亲和力而被分离，这是离子色谱的主要分离方式，用于亲水性阴、阳离子的分离。二、阳离子、阴离子对固定相亲和力（保留时间）大小的顺序：碱金属的亲和力顺序为：Cs+Rb+K+Na+Li+ 碱土金属的亲和力顺序为：Ba2+Sr2+Ca2+Mg2+ 卤素离子的亲和力顺序为：I-Br-Cl-F-对无机和有机阴离子，一般是有机阴离子和一价无机阴离子先出峰，二价和三价的无机阴离子和有机酸后出峰，价数越高保留越强，出峰时间越长。（在特殊情况下，出峰顺序会发生变化）。 常见无机阴阳离子的出峰顺序： F-、Cl-、NO2-、 SO42-、Br- 、NO3-、PO43- Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+三、离子交换色谱系统中的主要部分： 1.分离柱 2.检测器 ：电化学检测器（电导、安培），光学检测器（紫外-可见、荧光）3.抑制器四、抑制器1 抑制器的原理 利用电场与离子交换膜的共同作用，使离子定向迁移、交换的原理，完成抑制过程，其再生液来自分析废液或外加水装置，可连续循环再生。2 抑制器抑制的结果:降低背景电导，提高待测离子电导以提高灵敏度3 抑制器的两个作用 1）降低淋洗液的背景电导 2）增加被测离子的电导值(增加灵敏度)，改善信噪比。五、离子色谱的流程 泵液进样分离检测记录六、离子交换的分离方式流动相： 阴离子交换：弱酸的盐、碱（Na2CO3/NaHCO3, KOH、NaOH） 阳离子交换：强酸（H2SO4、甲基磺酸） 检测方式：电导检测 可测定的离子：最佳的应用是在不同基质中对常见阴离子（F-、Cl-、Br-、NO2-、NO3-、SO42-、PO43-等），和常见阳离子（Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+等）及一些碳水化合物（低分子量有机酸）。气象色谱 GC1 GC的原理:气相色谱主要利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向与流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。2 GC的分析流程3 常用检测器 常用的浓度型检测器有：热导池检测器(TCD)、电子捕获检测器(ECD)常用的质量型检测器有：氢火焰电离检测器(FID)、火焰光度检测器(FPD)4 定量计算方法l 归一化法归一化法很直观，容易接受，计算简便、准确，当操作条件如进样量、流速等发生变化时，对计算结果的影响很小，是一种常用的计算方法。缺点是：必需所有组分都出峰。l 外标法利用标准品做标准曲线，在线型范围内，求得样品的浓度的一种定量方法。l 内标法当只需测定试样中某几个组分，或试样中所有组分不可能全部出峰时，可采用内标法。内标法是将一定质量的纯物质(非被测组分的纯物质)作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据被测物质和内标物的质量及其在色谱图上相应峰面积之比，求出被测组分的质量分数。高效液相色谱 HPLC1 HPLC的分类: 液-固色谱法q液液色谱法q离子交换色谱法q凝胶色谱法2 正相色谱和反相色谱v正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。质谱技术 MS1 质谱法是一种重要的定性鉴定和结构分析方法，但没有分离能力，这一点与色谱法刚好互补，后者是一种很好的分离方法，特别适合于复杂混合物的分离，但对组分的定性鉴别有困难。2 概念 质谱法是将被测物质离子化，按离子的质核比分离，测量各种离子峰的强度而实现分析目的的一种方法；质谱法灵敏度高于其他结构方法，如IR、NMR等。3 流程 样品离子化m/z质谱定性、定量4 离子源电子轰击电离源（EI）：利用一定能量的电子与气相中的样品分子相互作用（“轰击”），使分子失去电子，电离成分子离子。当分子离子具有的剩余能量大于其某些化学健的键能时，分子离子便发生碎裂，生成碎片离子。化学电离源（CI）：引入一定的反应气进入离子化室，反应气在具有一定能量的电子流的作用下电离或裂解，生成的离子和反应气分子进一步反应或和样品分子发生离子分子反应，通过质子交换使样品分子电离。电喷雾电离源ESI : 优点是软电离源，易得准分子离子峰，但样品要求易离子化。基质辅助激光解析电离源 MA