不同地理种源鹅掌楸的ISSR遗传分析-硕士论文

At h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e R e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f M a s t e ro fA g r i c u l t u r e 1 n F o r e s t r yG e n e n t i c sa n dB r e e d i n g l n C e n t r a lS o u t hU n i v e r s i t yo fF o r e s t r ya n dT e c h n o l o g y 4 9 8S h a o s h a nS o u t hR o a d ，T i a n x i nD i s t r i c t C h a n g s h aH u n a n 410 0 0 4 ，P R C H I N A S u p e r v i s o r P r o f e s s o rX uG a n g b i a o M a y ， 2 010 I I R I l I I l l l f P I l l l l r f r l x l l l l l r l l f f l l l l P u f lIIIll Y 18 4 814 5 崤 下独立进行 研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容 外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果 作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学 位或证书所使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人 和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明 的法律后果由本人承担。 作者签名：导立一岛 沙卜年s 玛丛E l 中南林业科技大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件 或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。 本学位论文属于： 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、 不保密口。 ( 请您在以上相应方框打“ ) 作震签睾：占忌转导师签名：彳z H_ oH_ 一_ H H Hooo H_ H H HoHoHH Ho HH _ _H HoH , F w 4H Ho H H_H H Hw - - oH H Hoo _ C )H HH H H H_ H HH H H_ 一 _H HHH H_ H C ) Ho HH HoH H_ H Ho Ho HH_HoH H H Ho H _HHHHC _HH_o HH HHHH HH HHHo H C ，HH H _ H HHH _ _H HHH H_H HHp - , iHHo HoHH HH_oH H Ho HHoH _ 一o o oo o oo Hn寸 l n卜o o小2=2 卜n 婚一 n 一 ! n H N _ 一H o H A 卜 崎 n 寸 1 0 l d A o A H o A A l d A D I d d o d A o A H o l d d o d A o A A o A H 0 d A o A A o A A o A N H 妒 A o A A o A 蜂 D矗蠕o口一_Il!JQ-o玉H之厶iI 世嵌举搽鞍隧卜僻 毒剐留匣海 议智辽扑_千隧 硕士学位论文 不同地理种源鹅掌楸的I S S R 遗传分析 3 3 2 鹅掌楸微卫星多态性 从7 0 条引物中筛选出8 条条带清晰、重复性好的I S S R 引物，对2 0 个来自 不同地理种源的鹅掌楸群体共2 0 0 个鹅掌楸个体进行扩增。部分引物如U B C 8 2 5 扩增结果电泳图见图8 ，共产生7 0 条条带，平均每个引物扩增出9 条条带，其 中多态性条带有4 3 条，多念性比率( 竹为6 1 4 3 ( 见表6 ) 。说明对2 0 0 个鹅掌楸 个体的I S S R 标记存在比较高的遗传多样性。引物U B C 8 2 5 扩增出的条带最多为 1 2 条，最少者均为8 条；其中引物U B C 8 2 5 扩增的条带多态性最高( 7 5 0 0 ) ，引 物U B C 8 6 7 扩增的条带多态性最低( 5 0 0 0 啪。 3 3 3 鹅掌楸群体遗传多样性 根据“0 ，1 矩阵，利用P O P G E N E l 3 1 软件计算2 0 个不同地理种源的鹅 掌楸群体遗传多样性参数( 见表8 ) ，结果表明：鹅掌楸在物种水平上拥有相对较 高的遗传多样性，多态位点百分率P = - 7 6 9 2 ，1 8 号种源最高为P = 7 9 3 2 ，其 次为1 7 号种源( 7 6 2 3 ) ，最低的则是1 0 号种源( 4 9 8 7 ) ；基因多样性指数( I - 0 为0 1 7 1 7 ，在2 0 个种源中最高者为1 1 号种源( 日= O 1 8 7 6 ) ，最低的则是1 号种源 旧= O 1 2 6 3 ) ；S h a n n o n 信息指数I = 0 2 7 2 2 ，其中3 号种源最高( I - - 0 2 9 8 7 ) ，最低者 为1 号种源C ，_ O 1 9 1 5 ) 。 硕士学位论文 不同地理种源鹅掌楸的I S S R 遗传分析 表82 0 个种源遗传多样性分析( 括号里为标准差) T a b 8G e n e t i cv a r i a b i l i t yo ft w e n t yp o p u l a t i o n s ( s t a n d a r dd e v i a t i o n si np a r e n t h e s e s ) 群体样本数平均观察等位平均有效等位多态位基因多样性指S h a n n o n 信息 S a m p l e基因数( N a )基因数( e ) 点百分数( 何) 指数( D 率( P ) l1 0 1 4 0 0 0 ( O 4 9 2 0 )1 2 1 2 6 ( 0 3 3 0 4 ) 5 2 0 0 0 1 2 6 3 ( 0 1 8 3 1 ) 0 1 9 1 5 ( 0 2 6 5 2 ) 21 0 1 4 7 5 0 ( 0 5 0 1 5 )1 2 6 9 1 ( o 3 6 9 6 ) 5 2 6 7 0 1 4 6 1 ( 0 1 9 6 1 ) 0 2 3 3 5 ( 0 2 8 1 7 ) 3101 5 917 ( 0 4 9 3 6 ) 1 2 5 3 8 ( 0 3 6 6 8 ) 6 8 2 40 15 9 8 ( 0 19 6 6 ) 0 2 9 8 7 ( 0 2 9 9 7 ) 41 0 1 5 1 6 7 ( 0 5 0 1 8 )1 2 7 4 9 ( 0 3 6 9 1 ) 5 2 5 00 1 4 6 1 ( 0 1 9 6 1 ) 0 2 1 8 4 ( 0 2 8 0 5 ) 5l O 1 3 6 6 7 ( 0 4 8 3 9 )1 2 5 9 5 ( 0 3 5 0 6 ) 5 1 6 70 1 3 9 4 ( 0 2 0 7 0 ) 0 2 4 1 4 ( 0 2 7 9 5 ) 6 1 0 1 4 2 5 0 ( 0 4 9 6 4 ) 1 315 4 ( 0 3 6 4 9 )5 4 5 2 O 1 4 7 6 ( 0 18 7 4 ) 0 2 3 71 ( 0 2 6 9 6 ) 71 0 1 5 2 5 0 ( 0 5 0 1 5 )1 2 4 8 3 ( 0 3 7 3 2 ) 5 2 5 00 1 5 4 6 ( 0 1 8 8 5 ) 0 2 8 3 6 ( 0 2 9 6 3 ) 81 0 1 4 6 6 7 ( 0 5 0 1 5 )1 2 4 5 3 ( 0 3 3 8 7 ) 5 2 3 80 1 5 0 2 ( 0 1 7 6 4 ) 0 2 0 3 9 ( 0 2 8 7 9 ) 91 0 1 4 8 3 3 ( 0 5 0 1 8 )1 2 6 8 7 ( 0 3 8 2 5 ) 5 2 6 70 1 4 7 8 ( 0 1 8 6 7 ) 0 2 4 2 3 ( 0 2 35 ) lO10 1 4 5 0 0 ( o 4 9 9 6 ) 1 2 7 7 5 ( 0 3 6 6 2 ) 4 9 8 7 0 15 41 ( 0 16 2 3 ) 0 2 5 0 4 ( 0 2 6 7 4 ) ll1 0 1 6 0 3 8 ( 0 5 0 1 5 )1 3 6 1 8 ( 0 3 7 3 7 ) 6 8 3 6 0 1 8 7 6 ( 0 1 9 1 2 ) 0 2 8 2 3 ( 0 2 7 9 5 ) 1 21 0 1 4 5 6 3 ( 0 4 9 6 3 ) 1 2 4 3 1 ( 0 3 2 0 1 ) 5 7 6 8 0 1 4 7 2 ( 0 1 8 6 7 ) 0 2 4 0 7 ( 0 2 8 5 6 ) l310 1 5 0 6 7 ( 0 4 6 8 7 ) 1 2 6 4 5 ( 0 3 017 ) 5 4 210 15 2 9 ( 0 19 9 0 ) 0 2 6 4 8 ( 0 2 8 7 6 ) 1 41 0 1 4 8 9 7 ( 0 5 0 2 7 )1 3 2 5 4 ( 0 3 0 2 3 ) 5 0 6 7 0 1 4 6 1 ( 0 1 9 6 1 ) 0 2 4 9 0 ( 0 2 6 1 7 ) 1 51 0 1 5 8 3 2 ( 0 5 3 2 8 )1 3 1 0 7 ( 0 3 0 1 2 ) 6 3 7 80 1 4 6 9 ( 0 1 7 5 2 ) 0 2 3 7 2 ( 0 2 6 9 8 ) 1 61 0 1 4 9 6 7 ( 0 5 8 1 0 )1 2 7 5 3 ( 0 3 0 1 2 ) 5 9 6 70 1 5 2 0 ( 0 1 8 4 3 ) 0 2 3 4 4 ( 0 2 7 0 1 ) 1 71 0 1 6 3 7 2 ( 0 5 0 7 5 )1 4 1 0 4 0 3 6 2 5 ) 7 6 2 3 0 1 6 2 1 ( 0 1 9 8 6 ) 0 2 8 5 9 ( 0 2 9 7 2 ) 1 8l O 1 6 8 3 9 ( 0 5 0 2 4 )1 4 6 0 3 ( 0 3 5 2 6 ) 7 9 3 2 O 1 5 7 9 ( 0 1 8 7 6 ) 0 2 9 1 5 ( 0 2 9 8 4 ) 1 9l O 1 5 4 2 0 ( 0 4 8 6 7 )1 3 2 0 7 ( 0 3 7 2 1 ) 6 2 7 8O 1 4 8 4 ( 0 1 6 8 2 ) 0 2 5 4 0 ( 0 2 6 7 9 ) 2 0 10 1 4 9 6 7 ( 0 5 0 5 6 )1 2 6 8 7 ( 0 2 817 ) 61 3 80 15 6 5 ( 0 18 6 2 ) 0 2 4 8 6 ( 0 2 8 6 7 ) 物种2 0 01 6 3 9 2 ( 0 4 9 6 7 )1 3 6 9 7 ( 0 3 1 5 6 ) 7 6 9 2 O 1 7 1 7 ( 0 2 1 4 5 ) 0 2 7 2 2 ( 0 2 7 6 9 ) 水平 3 9 。 ：一 硕士学位论文不同地理种源鹅掌楸的I S S R 遗传分析 3 3 4 鹅掌楸群体的遗传分化 P O P G E N E l 3 1 软件的分析结果显示( 见表9 ) ，2 0 个种源总的遗传多样性( n t ) 为0 2 1 5 3 ，群体内的遗传多样性( 珏) 为o 0 8 2 4 。这说明群体间的遗传变异大于群 体内的遗传变异。根据总的遗传变异( H 0 和群体内遗传多样性( n d 计算各群体间 的遗传分化系数G S 。( G s t = ( n t - n 。) H t ) 为0 6 1 7 3 ，表明总的遗传变异中有6 1 7 3 的 变异存在于群体间，群体内的遗传变异仅为3 8 2 7 。说明鹅掌楸的各地理种源 内部存在一定的遗传分化，但总的遗传分化还是主要来自群体之问。 表9 鹅掌楸的遗传多样性 T a b 9G e n e t i cd i v e r s i t yo f L i r i o d e n d r o n 3 3 5 遗传距离和聚类分析 为了进一步分析鹅掌楸各地理种源之间的遗传分化程度，计算了N e i s 遗传 相似系数和遗传距离见表l O 。从表中可以看出来，北美鹅掌楸中来源密苏里和 路易斯安那州的遗传距离比较远，而来源中国等几省中的浙江和四川遗传距离较 远，遗传距离系数为0 2 6 2 4 ，遗传相似系数为0 6 7 9 2 。在分子水平上，湖南大公 山和湖南大围上两地的鹅掌楸遗传距离较近仅为0 0 8 0 0 ；四川酉阳和贵州松桃两 地的鹅掌楸之间的遗传距离系数也是0 0 8 0 0 。对2 0 个地理种源用 N T S Y S P C ( V e r s i o n2 1 0 e ) 分析软件进行不加权成对算数平方法 U P M G A ( U n w e i g h t e dp a i rg r o u pm e t h o da r i t h m e t i ca v e r a g e s ) 聚类分析，具体方法是 对上表中的原始数据阵用S i m i l a r i t y 程序_ Q u a l i t a t i v ed a t a ，进行遗传相似系数 计算，在应用C l u s t e r i n g 中的S N A N 程序中的非加权算术平均法( U P G M A ) 进行 聚类分析，最后在G r a p h i c 中的T r e ep l o t 程序中生成的树状聚类图。聚类结果表 明，2 0 个地理种源基本是按照地理距离聚在一起的( 见图8 ) 。 ，”。，一一，- ：誓k ，：i 嚣矗 H竹。甘| ， 卜一叶 oAI】磊鼬口。鼋盘苟8鼬百Z-o芒日置瑚善gQ锄Id 匝葵霉蔓。每f1艟|吾啦暇窨翳嚣牛oN匝 *辑层描M喝。【p 一蚺D 颦求夸缎醋们一暑蓉褂皱翳嚣嘲鲁匣熙 仪秘迥扑_千匿 硕士学位论文不同地理种源鹅掌楸的I S S R 遗传分析 在刘丹等对中国鹅掌楸遗传多样性研究中将中国鹅掌楸分为三个主要的分 布区，即南部、北部和中心种源区，在中心种源区包括四川叙永、贵州黎平和湖 南绥宁，在文中得出来自湖南绥宁和四川叙永的鹅掌楸之间的遗传距离最大为 0 5 7 8 4 ，这个结果和本实验得出的0 6 1 9 0 较为相近，再一次证明了刘丹等将中国 鹅掌楸分为三个主要分布区的观点是存在一定的合理性。 4 3 硕士学位论文不同地理种源鹅掌楸的I S S R 遗传分析 4 讨论 4 1 植物基因组D N A 提取 植物基因组D N A 的提取已有比较成熟的方法，但实际工作中却发现并不容 易成功，往往需要消耗掉研究者大量的时间和精力。D N A 提取的难易程度首先 取决于植物自身，由于不同物种所含的化学物质种类和多少不同，导致D N A 提 取的难易程度也不相同。而且在提取液中必须加入抗氧化剂p 毓基乙醇、P V P 或者它们的组合，才能够有效避免D N A 在提取过程中的氧化褐变【1 0 3 1 。因此，本 研究在提取D N A 时，加入一定的B 巯基乙醇，能够有效的抑制D N A 发生褐变。 目前有关植物D N A 提取的文献大多数集中于应用不同的方法提取不同的植 物D N A ，如C T A B ，S D S 以及D N A 提取试剂盒等【1 0 4 J 0 6 1 。其实，这些方法对植 物D N A 提取难度或D N A 提取的质量和数量上并没有太大的差异。沈永宝，施 季森【1 0 7 】在对板栗、银杏、油茶、杨树、桑树和杉树等树种的D N A 提取时，也发 现C T A B 和S D S 等方法对结果的影响不大。但绝大部分研究结果却表明，在植 物总D N A 提取时，C T A B 法效果更加好些。因此，在实验过程中采用了改良的 C T A B 法。 植物材料的老嫩程度在植物基因组D N A 提取中也非常的重要。就目前的报 道【1 0 8 J 嗍而言，植物组织越嫩所提取基因组的得率也越高。许多研究已经表明植 物组织中的多糖和其它一些次生代谢物质，如：酚，脂，萜等，对D N A 的提取 造成了很大的困难【晰】，而且这些物质随植物组织器官的增长而增加。另外，幼 叶比芽样品采集更难，而且叶中的次生物质含量更多，基因组D N A 提取操作更 复刹1 1 0 1 。沈永宝，施季森在提取其它树种D N A 时，也发现提取成熟叶子D N A 必须要增加纯化次数，才能去掉一些蛋白质和次生物质，否则无法得到理想的 D N A 尽管知道D N A 的量往往随着纯化次数的增加而丢失。为避免这一问题，建 议在采样时尽量的采摘嫩芽作为研究样本。 提取D N A 过程中也有许多因素能导致D N A 的降解。首先是物理因素。因 为D N A 分子量较大，机械张力或高温很容易使D N A 分子发生断裂。因此，在 实际实验操作过程中应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移及剧烈的震荡等， 以减少机械张力对D N A 的损伤，同时也应避免过高的温度。其次，细胞内源 D N A 酶及细胞破裂释放的次级产物也会导致D N A 的降解，所以在提取D N A 的 由于在过酸的条件下，D N A 脱嘌呤会导致D N A 的不稳定，极易在碱基脱落的地 方发生断裂，所以本实验的D N A 提取缓冲液P H 值为8 0 ，我认为有必要的时候 还可以改成9 0 。 此外，D N A 提取步骤对后续实验也有影响。如果用于P C R 分析，D N A 提 取步骤越少越好，多步骤、多试剂容易引起交叉感染，影响P C R 的准确性【1 1 。 所以，本实验最终采用的改良后的C T A B 法2 尽量使用较少的试剂和步骤，用此 方法提取的植物基因组D N A 可直接用于I S S R P C R 。 现将上述需要注意的问题总结成以下几点： ( 1 ) J J l 入抗氧化剂，防止D N A 发生褐变。 ( 2 ) 针对不同的植物材料选用合适的D N A 提取方法，并且选用植物材料的采 取时间和部位要对D N A 的提取有利。 ( 3 ) 实验过程中影响D N A 降解因素分析。特别是注意物理因素。 除以上问题外，在D N A 提取实验步骤中要注意的有以下几条： 。 ( 1 ) 在抽提过程中如果水相和有几层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量 较高，可增加酚氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。 懒一j ( 2 ) 酚抽提时如果上清液太黏稠，无法进行水相转移时，可加入适量T E S 稀 释后再抽提。 ( 3 ) 提取D N A 过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸 酶化处理。 ( 4 ) 苯酚具有高度的腐蚀性，飞溅到皮肤和眼睛等会造成损伤，因此应注意 防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。 4 2P C R 扩增过程中出现的问题和处理方法 4 2 1 没有扩增产物 当在琼脂糖凝胶电泳检测时没有出现扩增条带，应该检查以下几点： ( 1 ) 循环温度特别是解链温度是否正确。 对于富含G + C 的目的基因9 7 C 的温度可以使解链更加有效，但过高的温度 会影响酶的活性，有效地解决办法是在加T a qD N A 聚合酶前先使模板在9 5 9 7 ( 2 4 5 硕： 学位论文不同地理种源鹅掌楸的I S S R 遗传分析 变性5 1 0 m i n 。但要注意有的P C R 仪由于长期使用，其显示的温度和实际温度 不一致，应定期对仪器进行维护和测试。 ( 2 ) 选用的引物是否正确和聚合酶的活性是否正常。 ( 3 ) 反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在，使聚合酶或模板及产物降解。将模板 置于9 5 以上处理，可以抑制蛋白酶和核酸酶的活性。 ( 4 ) 样本的蛋白质成分去除不完全，可以抑制P C R 反应，再用蛋白酶重新处理样 本，可以提高扩增效率。 4 2 2 有非特异性产物形成或产物在凝胶电泳中呈涂布状条带 在实验中出现这种情况的时候应该考虑： ( 1 ) 提高退火温度、缩短退火及延伸时间。 选择合适的退火温度可以提高P C R 反应的效率，大大减少引物和模板的非 特异性结合，提高P C R 反应的特异性。 ( 2 ) 调整引物T a qD N A 聚合酶或模板的用量。 引物浓度过高会促使引物的错误引导合成非特异性产物，增加引物二聚体的 形成，如果引物二聚体出现在早期的循环中，可成为P C R 反应的模板，与靶序 列竞争D N A 聚合酶、d N T P 底物，从而使靶序列的扩增量降低。 ( 3 ) 调整M g + 用量。 M 9 2 + 影响着T a qD N A 聚合酶的活性，同时还影响着引物的退火、模板与P C R 产物的解链温度、产物的特异性和引物二聚体的形成。其浓度过低时，酶活力显 著降低，过高时，则酶催化非特异性扩增。 ( 4 ) 减少循环次数。 循环次数决定着扩增程度，过多的循环会导致增加非特异性产物，过少的循 环次数，P C R 产物量就会降低。 4 2 3P O R 过程中的污染问题 P C R 过程中出现的污染主要有三大类：样品问的交叉污染、P C R 试剂的污 染和P C R 扩增产物污染。 样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于容器外粘有其 他样品而造成相互间交叉污染；样品D N A 在提取过程，由于微量移液枪污染导 致样品问的污染等。 P C R 试剂的污染主要是由于在P C R 试剂配置过程中，由于吸样枪、容器、 硕士学位论文 不同地理种源鹅掌楸的I S S R 遗传分析 双蒸水及其他溶液被其他样品污染。 P C R 扩增产物污染，是P C R 反应中最主要污染来源。因为P C R 产物拷贝量 大，所以极微量的P C R 产物污染，就可以造成假阳性。 4 2 4 最终的扩增系统 在对上述需要注意的问题经过长时间的尝试之后，对I S S R P C R 反应程序中 的一些重要参数进行了摸索和优化，建立了稳定、适用于鹅掌楸遗传多样性分析 研究的I S S R P C R 的反应体系。经过优化后的反应体系为：2 0 1 t L 总体系中，含3 0 n g 模板D N A 、0 3I t m o l L - 1 随机引物、O 2m m o l L - 1d N T P s 、1 4m m o l L - 1M 9 2 + 、 0 4 UT a qD N A 聚合酶。 最佳扩增条件为1 ) 预变性：9 4 C ，5m i n ；2 ) 变性：9 4 ，lm i n ，3 ) 退火： 5 0 - - 5 6 ，4 5s ，4 ) 延伸：7 2 ，2m i r a 共4 5 个循环；最后7 2 延伸7 m i n 。 4 3 鹅掌楸的遗传多样性水平 从表8 中可以知道：物种( S p e c i e s ) 水平多态位点百分率为7 6 9 2 ，基因 多样性指数为O 1 7 1 7 ，S h a n n o n 信息指数为0 2 7 2 2 。上述结果表明实验筛，。 选出来的引物U B C 8 2 5 是一条高效引物；同时也说明鹅掌楸具有相对较高的遗传 多样性水平，这与其广泛的地理分布相符。 4 3 1 北美鹅掌楸与中国鹅掌楸遗传多样性水平 进一步将表7 中所有种源划分为北美鹅掌楸和中国鹅掌楸两个大类群，研究 二者之间的遗传多样性水平，相比较知道( 见表1 1 ) ：北美鹅掌楸的有效等位基因 平均数、基因多样性指数平均值、S h a n n o n 信息指数平均值均高于中国鹅掌楸， 即中国鹅掌楸各地理种源总的基因多样性比北美鹅掌楸要低，这说明鹅掌楸的遗 传变异主要存在于地理种源之间，但二者没有显著的差异。 表11 北美鹅掌楸和鹅掌楸遗传多样性各度量平均值 T a b 11T h em e a np a r a m e t e r so fg e n e t i cd i v e r s i t yo f L i r i o d e n d r o nt u l i p i f e r aa n dL c h i n e s e 4 7 硕士学位论文不同地理种源鹅掌楸的I S S R 遗传分析 4 3 2 北美鹅掌楸之间遗传多样性分析 五个北美鹅掌楸品种可以划分为两类，一类是来源于美国南卡罗来那、佐治 亚和北卡罗来那的鹅掌楸，另一类是以密苏里和路易斯安娜的北美鹅掌楸为主。 从聚类图上可以看出，中国鹅掌楸种内种群问的分化程度明显低于北美鹅掌楸， 虽然来源于密苏里和路易斯安娜的北美鹅掌楸与其他来源的北美鹅掌楸遗传距 离较远，但相对于中国鹅掌楸而言，北美鹅掌楸不同种源问仍具有较近的遗传距 离。但是来源于南卡罗来那、佐治亚、北卡罗来那的北美鹅掌楸与中国鹅掌楸的 遗传距离比来源于密苏里和路易斯安娜的北美鹅掌楸遗传距离更近，因此，以中 国鹅掌楸作为比较中介，可以将北美鹅掌楸的五个种源划分为两类，同时引起一 个猜想：鹅掌楸属是否完全按照大的地理来源划分为中国鹅掌楸和北美鹅掌楸2 个种呢? 值得后续研究者进行深入研究。 4 3 3 中国鹅掌楸各地理种源之间遗传多样性比较 根据聚类分析图可以将中国鹅掌楸的分布主要分为三个大的方向，即云南省 勐腊，安徽的黄山、大别山地区和来自四川、贵州、湖南、湖北、江西和浙江等 地的鹅掌楸。云南勐腊和安徽大别山、黄山地区鹅掌楸之问的遗传距离最大分别 为0 7 7 3 2 和0 6 1 9 0 ，从地理位置上来分，一个处于中国南部适应南方气候，一 个处于中国北方，符合地理分布。而四川、湖南等地的鹅掌楸之间的遗传距离相 较云南和安徽之间没有那么明显的差距。 郝日明【1 9 】在对中国鹅掌楸的自然分布进行研究后认为，鹅掌楸依照地理区域 可划分为“一带五岛 的分布形式，并认为鹅掌楸的分布形式反映了一个走向濒 危的物种在数量上的减少过程。张大勇H 挖1 等认为濒危物种的遗传多样性可能会 由于遗传漂变和近交作用而丧失，但本研究表明鹅掌楸具有较高的遗传多样性， 这也证明了遗传多样性的丧失可能是濒危物种的最终结果而不是濒危的起因，其 濒危的处境可能是由其本身的繁殖隔离机制造成的。 优化和采用统一的P C R 反应条件是非常必要的。并且I S S R 标记能够检测出更多 的D N A 多态性，而且一套引物可以在多种植物中通用，提高了其利用率，故在 遗传关系研究方面有更广阔的应用前景。 ( 3 ) 本研究利用I S S R 分子标记技术，对鹅掌楸群体遗传多样性进行分析：应用 I S S R 分子标记技术对2 0 个地理种源共2 0 0 个个体进行了遗传多样性分析。从7 0 条引物中筛选出8 条引物。8 条引物共扩增到7 0 个位点，其中4 3 个是多态性位 点，总的多态性位点百分率( P ) 为6 1 4 3 。N e i 8 基因多样性指数( 日) 为O 1 7 1 7 ， S h a n n o n 多态性信息指数( ，) 为0 2 7 2 2 。2 0 个不同种源的遗传多样性水平差异 不大。群体多态性位点百分率在4 9 8 7 7 9 3 2 之间，N e i s 基因多样性指数为 0 1 2 6 2 0 1 8 7 6 ，S h a n n o n 多态性信息指数为0 1 9 1 5 0 6 1 7 3 。2 0 个群体间的遗传分 化系数G s t 为0 6 1 7 3 ，说明群体间存在一定程度的遗传分化。 ( 4 ) 再一次验证了刘丹等等在中国鹅掌楸遗传多样性研究中对中国鹅掌楸分布 范围划分为三个主要分布区即南部、北部和中部种源区的结论。 4 9 硕士学位论文不同地理种源鹅掌楸的I S S R 遗传分析 参考文献 【1 】袁建立，：v 冈J J 生物多样性与生态系统功能：内涵与P b 延- J 兰州大学学报：自 然科学版，2 0 0 3 ，3 9 ( 2 ) ：8 6 - 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