鼠源性抗体.ppt

单克隆抗体,制药（硕）班潘婷婷2012207354,单克隆抗体的发展,抗体是机体对抗原刺激发生反应，由浆细胞产生的一种免疫球蛋白。它能特异性地识别相应的抗原物质并与之反应。抗体药物就其发展历程及制备技术可分为三类：,我们现在所称的抗体药物或单克隆抗体药物其实就是单克隆抗体和基因工程抗体的统称，其中主要为基因工程抗体。,二、单克隆抗体的发展,鼠源性抗体从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对单个细胞进行克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。嵌合抗体用人源基因代替鼠源单抗的恒定区。这样构建的嵌合抗体不仅保留了抗原抗体结合的特异性，又大大降低了鼠源单抗的免疫原性。人源化抗体由于嵌合抗体异源性仍然很大，因此需要对鼠源抗体进行人源化改造，进一步人源化的方法很多，主要是重构抗体和表面重塑技术。重构抗体就是互补决定区(eomplementaritydeterminingregion，CDR)移植，将鼠抗体的CDR移植到人抗体的相应部位。这样人源化程度可达90以上，目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方表面重塑技术即将鼠抗体框架区表面氨基酸的残基(surfaceaminoacidresidues，SAR)进行人源化改造。该方法是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。,人源性抗体虽然人源化抗体解决了鼠抗体的免疫原性等问题，但生产人源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常大，并且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用于治疗的理想抗体，目前它主要通过3种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠制备人源性抗体。,三、,域抗体(domainantibodies，DAbs)一直到1989年，所有的抗体被认为都是由两个重链和两条轻链组成，两条重链通过二硫键共价连接，重链由1个可变区VH和3个恒定区CH1和CH2和CH3组成，轻链由一个可变区VL和恒定区组成CL，并且与重链的CH1区非共价连接。1989年，一种新型抗体首先在单峰骆驼的血清中被发现鉴定，后来在骆驼家族所有其他种群中都有发现。这种抗体不包含轻链，重链中不含有CH1区。直到今天，这种重链抗体的进化优势都不是很清楚，然而仅由重链抗体的一个重链可变区组成的单域抗体，其广泛的适用性已经被迅速认可，由于其晶体结构直径2.5nm、长4nm，因此又被称为纳米抗体。,新技术的应用促进了对这种抗体药物的理解，也发现了这种小分子抗体的很多优点：具有高亲和性能够识别普通抗体不能识别或不能接近的抗原在严苛的环境下非常稳定容易形成聚体形式易表达,抗体-药物共轭体(antibodydrug-conjugates，ADCs)它是由一个合成接头共价连接一个单克隆抗体与一个细胞毒类化学物质构成，这样ADC就融合了单克隆抗体对肿瘤相关抗原的高度特异性和小分子毒性物质对肿瘤相关抗原的毒性效应，加强毒性物质对肿瘤细胞攻击效率的同时，避免了化学疗法中毒性物质对正常的组织细胞非特异性杀伤而引起的不良反应。,双特异性抗体(bispecificantibodies，BsAb)简单来说，双特异性抗体就是可以与两个不同抗原靶点特异性结合的抗体融合体。早期对BsAb的研究侧重于将一个特异性抗原与效应细胞连接起来，例如，一个BsAb既特异性地与肿瘤细胞上抗原结合，同时又与T细胞上CD3抗原或者NK细胞上的CD16抗原结合，这样BsAb交叉连接了肿瘤细胞与效应细胞，同时激活了效应细胞。最近一个新概念的BsAb得到了人们的极大关注，它同时结合一种疾病相关的两个靶抗原，这样BsAb可以与相同疾病发生途径中的不同靶点抗原结合，阻滞和中和作用都增强了，而且可以阻断单抗药物单一靶点疗法中出现的代偿现象。BsAb还可以与同一个靶抗原的不同抗原决定簇结合，不仅使亲和力加强，而且加强了抗体依赖的效应作用如抗体依赖的细胞毒作用和/或补体依赖的细胞毒作用。,三功能抗体(trifunctionalantibodies，TriomAb)三功能抗体除具有两个不同抗原结合位点，还具有完整的Fc片段，其两个抗原通常是T细胞上的CD3和肿瘤细胞上的抗原，这使它成为双特异性单克隆抗体的一种。,Fc工程抗体(Fc-engineeredantibodies)现在有两种改造Fc片段的方法:基因改造和糖基化改造。基因改造主要是通过丙氨酸扫描、定向突变、基于结构的系统计算等分子工程学手段改造编码Fc片段的DNA。糖基化改造通常是通过改造产生抗体的细胞系或者酵母来实现。,AHumanMonoclonalAntibodyTargetingScavengerReceptorClassBTypeIPrecludesHepatitisCVirusInfectionandViralSpreadInVitroandInVivo,四、单克隆抗体的最新进展,人类免疫缺陷病毒单克隆抗体在小麦胚乳中的表达,阻止丙型肝炎病毒在体外和体内感染的一种新型的人类单克隆抗体,研究背景：EndstageliverdiseasecausedbychronichepatitisCvirus(HCV)infectionistheleadingindicationforlivertransplantationintheWesternworld.However,immediatereinfectionofthegrafteddonorliverbycirculatingvirusisinevitableandliverdiseaseprogressesmuchfasterthantheoriginaldisease.Standardantiviraltherapyisnotwelltoleratedandusuallyineffectiveinlivertransplantpatients,whereasanti-HCVimmunotherapyishamperedbytheextremegeneticdiversityofthevirusanditsabilitytospreadbywayofcellcellcontacts.（对于肝移植患者，通常采用聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林治疗，但是这种联合疗法耐受性不好而且并不是很有效，因此，新的防止再度感染药物的研发是必要的。）,丙型肝炎病毒(HCV)的特点：extremegeneticdiversityhaveabilitytospreadbywayofcell-cellcontacts新合成的人类免疫球蛋白G4单克隆抗体(mAb)16-71的作用机制：mAb16-71interfereswithdirectcell-to-celltransmissionofHCV.结果表明：Usinginvitrocellcultureandhumanliver-chimericmousemodels,weshowthatahumanmAbtargetingtheHCVcoreceptorSR-BIcompletelypreventsinfectionandintrahepaticspreadofmultipleHCVgenotypes.,本研究的目的是利用基因枪介导法将抗体基因IgG转人小麦，获得转基因植株，并在分子水平上证实目的基因的整合、转录和表达。,植物表达载体的构建。用EcoRV和SacI酶切HC基因，回收约1414bp的目的片段。将回收的目的片段插入到植物表达载体pBarLYA克隆位点SmaI和SacI之间，获得HC表达载体pBarLYAHC(图1)。LC基因经SmaI和SacI酶切，回收约723bp的目的片段，并插入到载体pLYA克隆位点SmaI和SacI之间，获得LC表达载体pLYA-LC(图1)。HC和LC基因均由燕麦球蛋白启动子AsGlo驱动。,提取小麦叶片DNA，用HC和LC基因特异引物进行多重PCR检测，在T。代抗性苗中，其中有3株为阳性，且同时扩增出497bp和380bp的目的带(图2一A)，表明IgG的HC和LC基因共整合到小麦基因组中。对T0代植株PCR鉴定表明，所有T0代植株均同时检测到HC和LC2个基因。对T1代和T0代进行鉴定，所有转基因后代依然可以同时检测到HC和LC2个基因，T2代部分植株的PCR扩增结果见图2一B。连续3代的PCR鉴定结果表明，基因HC和LC是连锁的，而且能够稳定遗传。,2)基因枪介导的转化及转基因植株的筛选3)转基因植株的PCR检测,4)转基因植株的RT-PCR检测。,T2代转基因小麦和未转化植株开花后21d时，分别提取幼嫩籽粒RNA，用IgG的重链和轻链特异引物进行RT-PCR扩增。如图3所示，选取的6株转基因植株均可扩增出预期大小的目的带，而未转化对照中没有目的带，说明转基因株系的基因组中不仅整合了目的基因，而且能在胚乳中形成正常的转录本。,5)IgG蛋白的ELISA检测。,于开花后21d时，取T3代转基因株系和未转化植株幼嫩籽粒，提取总蛋白进行ELISA检测。结果表明，转基因株系蛋白提取液的D值与阴性对照相比差异显著(图4)。用IgG重链作为抗体检测时，样品的D值是对照的36倍；IgG轻链作为抗体检测时，样品的D值是对照的25倍，说明种子中IgG蛋白重链和轻链表达积累量均较高。,讨论：本研究利用基因枪共转化法将单克隆抗体IgG的重链和轻链基因同时导人小麦基因组。T。代共得到3株转基因植株，并同时含有IgG重链和轻链。连续3代的PCR检测结果表明，HC和LC基因是连锁的，而且能够稳定遗传，说明目的基因已经整合到小麦基因组中。为检测IgG在小麦颖果中的表达情况，取开花后21d的幼嫩籽粒提取RNA，进行RTPCR鉴定，在随机选取的几个样品中都可以检测到信号，说明工gG基因在小麦胚乳中能正常转录。ELISA结果进一步证实小麦胚乳中能产生正常的IgG分子。Rademacher等在玉米胚乳中表达了重组抗体2G12，此抗体具有HIV中和活性，而且并不低于仓鼠卵巢细胞来源的