平邑甜茶GLB1基因的克隆、表达及其功能的研究-硕士论文

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D g a l a c t o s i d K a n a m y c i n L u r i a - b e r t a n im e d i u m 3 - ( N m o r p h p l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c - 4 ，4 ，5 ，5 四咪唑 - 1 - 羟基3 氧化 物 十六烷基- - 7 , 基 溴化铵 重蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三 磷酸 二苯基碘 二硫苏糖醇 大肠杆菌 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 电子顺磁共振 p 葡糖醛酸酶 过氧化氢 血红蛋白 异丙基p D 硫代 半乳糖 卡那霉素 L B 培养基 3 _ N 吗啉代丙磺 圳删洲删 5 0 6 m R N AM e s s a g eR N A “ 信使R N A M S M u r a s h i g ea n dS k o o gm e d i a M S 培养基 N A D P HN i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e 烟酰胺腺嘌呤二 p h o s p h a t e ，r e d u c e df o r m 核苷磷酸，还原 型 N a 3 P 0 4 N a O A C N O N O S N R N s H b P A G E P B S P V P 鼬f R N A R 1 1 R s e A R O S R p m R r - P C R S D S S D S P A G E S H b S N A P S N P S T 】巳T T E T E M E D T H b T f i s S o d i u mp h o s p h a t e S o d i u ma c e t a t e N i t r i co x i d e N i t r i co x i d es y n t h a s e N i t r a t er e d u c t a s e N o n s y m b i o t i ch e m o g l o b i n P o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s P h o s p h a t eb u f f e r P o l y v i n y l p y r r o l i d o n e R i f a m p i c i n R i b o n u c l e i ca c i d R i b o n u c l e a s eA R r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s R e v o l u t i o n sp e rm i n u t e R e v e r s et r a n s c r i p t a t i v eP C R S o d i u md o d e c y ls u l f a t e S D S p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p - h o r e s i s S y m b i o t i ch e m o g l o b i n S - n i t r o s o - N a c e t y l p e n i c i l l a m i n e S o d i u mn i t r o p r u s s i d e S o d i u mc h l o r i d e ，t r i s H C I ，E D T Ab u f f e r T f i s H C I ，E D T Ab u f f e r N ，N ，N , N - T e t r a m e t h y l E t h y l e n e d i a m i n e T r u n c a t e dh e m o g l o b i n T t r i s h y d r y x y m e t h yL a m i n o m e t h a n e 磷酸钠 醋酸钠 一氧化氮 一氧化氮合酶 硝酸还原酶 非共生血红蛋白 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 磷酸缓冲液 聚乙烯吡咯烷酮 利福平 核糖核酸 核糖核酸酶A 活性氧 转分钟 反转录P C R 十二烷基硫酸钠 S D S 聚丙烯酰 胺凝胶电泳 共生血红蛋白 亚硝基乙酰青霉 胺 硝普钠 N ，N N ，N 四甲 基乙二胺 N a C l ， Ir i s H C I E D T A T r i s H C l 、E D T A 缓冲液 短截血红蛋白 三羟甲基氨基甲 烷 a _ N A A a n a p t h a l e n ea c e t i ca c i d a - 萘乙酸 Y E PY e a s te x t r a c ta n dp e p t o n em e d i u m1 阢P 培养基 - _ - - - - _ _ _ _ - - o _ - - - - _ _ _ - _ _ _ - _ I _ - - - _ _ - _ - _i iI hm _ _ o - _ - o - - _ - _ - - _ _ _ _ _ _ o _ o o o o o _ - _ _ _ - o o _ _ - 】【 3 ； ! ； 5 7 9 l ( ) 1 5 本研究的目的和意义1 1 2 材料与方法。1 3 2 1 实验材料1 3 2 1 1 植物材料与处理j 1 3 2 1 2 菌株与质粒1 4 2 1 3 酶及生化试剂1 4 2 1 4P C R 引物1 4 2 1 5 培养基1 4 2 2 实验方法：。16 2 2 1 植物材料总R N A 的提取l6 2 2 2 反转录c D N A 第一链的合成1 7 2 2 3c D N A 全长基因序列的获得1 7 2 2 4D N A 片段与克隆载体的连接1 8 2 2 5 凝胶电泳中D N A 片段的回收1 8 2 2 6 碱法小量质粒D N A 的提取。1 9 2 2 7D N A 序列测定。2 0 2 2 8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化2 0 2 2 9 根癌农杆菌L B A 4 4 0 4 感受态细胞的制备与转化2 l 2 2 1 0 基因组D N A 提取( C 1 ：A B 法) 2 1 2 2 1 lM h G L B l 正义表达载体的构建2 2 2 2 1 2 实时荧光定量P C R 2 3 2 2 1 3 S 以1 2 粉番茄的转化2 4 2 2 1 4 转基因植株的检测2 5 2 2 1 5 转基因植株抗涝性的测定2 5 2 2 - 1 6 本研究使用的软件2 5 3 结果与分析2 7 3 1 平邑甜茶G L B l 全长e D N A 的分离2 7 3 2 非共生血红蛋白基因( 砌吼B 1 ) 的序列分析2 7 3 3 基因表达特性分析31 3 3 1M - h G L B _ 7 在不同组织中的表达3 1 3 3 2 硝态氮处理对M h G L B l 在不同组织中的表达的影响3 2 3 3 3N O 释放剂( S N P ) 处理对M h G L B I 在根中的表达的影响3 3 3 3 4 低氧胁迫对M h G L B l 在根中表达的影响3 4 3 3 5A B A 处理对M h G L B l 在根中表达的影响3 4 3 4 转基因番茄表达载体p B l l 2 1 - M h G L B l 的构建及转基因番茄的鉴定3 5 3 5 正义转基因番茄抗涝性的测定3 9 4 讨论q 1 1 4 1M h G L B l 基因编码平邑甜茶非共生血红蛋白1 4 1 4 2 锄G 凹的表达特性4 1 4 3G L B l 在植物耐低氧胁迫中的功能4 2 5 结论。4 5 参考文献。4 6 j 变谢5 3 硕士在读期间形成的论文。5 4 2 中文摘要 模式植物研究发现G L B l 编码非共生血红蛋白，该蛋白的主要功能包 括以下几个方面：( 1 ) 因为和氧的亲和力强，所以可能起到清除氧的作用。 ( 2 ) 通过与黄素蛋白( 类似于细菌和酵母体内的黄素血红蛋白) 的相互 作用用参与电子传递。( 3 ) 、结合一些已知的配体( 0 2 ，N O 和C O ) ，作为感 受机制的一部分，比如针对配体水平的波动而调节细胞内的代谢。( 4 ) 与 有机小分子结合，在脂肪酸的运输中起作用或者参与低氧条件下的有机物 的合成。为探讨G L B l 在果树抵抗非生物胁迫中的分子生物学功能，以水 培平邑甜茶实生苗为试材，克隆了非共生血红蛋白1 的编码基因，同时采 用实时荧光定量P C R 研究了M h G L B I 基因在N 0 3 。、S N P 、低氧胁迫及 A B A 处理下表达量的变化，并构建了M h G L B l 的正义表达载体，成功转 化了番茄，初步研究了其生理生化功能，主要结果如下： 1 根据已知苹果G L B l 基因的E S T 序列，设计特异引物利用P C R 技术获 得非共生血红蛋白1 的全长编码区，命名为M h G L B l ，G e n B a n k 注册号为 G Q 4 2 3 6 1 9 。序列分析表明，M h G L B l 基因编码区4 7 7 b p ，共编码1 5 8 个 氨基酸，预测分子量为1 7 8 k D a 。同时M h G L B I 的氨基酸序列分析显示该 基因与梨( P y r u sc o m m u n i s ) 、棉花( G o s s y p i u mh i r s u t u m ) 、苜蓿( M e d i c a g o s a t i v a ) 的非共生血红蛋白的同源性分别为9 5 5 7 、8 2 8 2 、8 0 1 2 ；系 统进化树分析显示，M h G L B I 基因与梨的同源关系最近。故进一步确定其 为平邑甜茶非共生血红蛋白1 的编码基因。 2 荧光定量P C R 分析M h G L B l 基因在不同组织中的表达发现，M h G L B I 在平邑甜茶的根、茎、叶中均有表达，且在根中的表达量最大。对M h G L B I 基因在不同环境条件下在不同组织中的表达特性的研究结果显示：硝态氮 处理增加了M h G L B l 在根、茎、叶中的表达，且在根中M h G L B l 的含量 2 h 时就明显升高，茎和叶中M h G L B I 的表达量是缓慢增加的；在S N P 处 理下，M h G L B l 的表达量2 h 时已迅速增加，4 h 时表达量比峰值下降5 0 8 ， 但仍高于对照，之后又有所增加；A B A 处理4 h 能够使M h G L B I 的含量显 著高于对照，用c - P T I O 预处理后再用A B A 处理时，M h G L B I 的含量与对 照差异不显著。 3 为进一步研究平邑甜茶G L B I 的生理生化功能，将非共生血红蛋白- l 平邑甜茶G L B l 基因的克隆、表达及其功能的研究 的编码基因，构建了p B l l 2 1 M h G L B l 正义表达载体，并对番茄进行农杆 菌侵染的遗传转化。对转基因番茄的抗涝性进行了初步检测发现：与野生 型植株( W T ) 相比，转基因番茄( 1 号和5 号) 在水涝下其光合速率下 降比较缓慢。在淹水2 4 h 时野生型植株光合速率、气孔导度、蒸腾速率分 别下降了8 6 、8 6 8 和9 0 7 ，而转基因植株1 号和5 号则分别下降了 4 0 1 、7 2 5 、7 8 7 以及5 5 3 、7 0 2 、8 2 8 ，9 6 h 时H 2 0 2 和N O 的 含量也都显著低于对照。 关键词：平邑甜茶；胁倪B ，；非共生血红蛋白；H 2 0 2 ；N O ；低氧胁迫 2 s m a l lo r g a n i cm o l e d u l e sa n da c t e di nt h et r a n s p o r t a t i o no ff a t t yo rp a r t i c i p a t e i nt h es y n t h e s i so f o r g a n i cc o m p o u n d su n d e rt h eh y p o x i a T h ea i mo f t h i ss t u d y w a st oo b t a i nab e t t e ri n s i g h ti n t ot h em o l e c u l a rf u n c t i o n so ft h eG L B li n r e s p o n s e t oa b i o t i cs t r e s s U n d e rw a t e rc u l t u r ec o n d i t i o n ，w eh a v ec l o n e d c l a s s 一1 n o n s y m b i o t i ch e m o g l o b i ne n c o d i n g g e n e f r o m p i n g y i t i a n c h a s e e d l i n g s T h ee x p r e s s i o np a t t e r no fM h G L B li nd i f f e r e n tt i s s u e sa t d i f f e r e n t c o n d i t i o n sw a sa n a l y z e db yq u a n t i t a t i v er e a l - t i m eP C R T h eG L B lg e n e d e r i v e df r o mp i n g y i t i a n c h aw a sh e t e r o l o g o u s l ye x p r e s s e di nt o m a t ot os t u d y t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no ft h eG L B l 1 I na na t t e m p tt oi s o l a t eM h G L B Ig e n e ，t h ek n o w na p p l eE S Ts e q u e n c e s W a su s e dt od e s i g np r i m e rf o ri s o l a t i o no fM h G L B I A n a l y s i sr e v e a l e da4 7 7 b ps e q u e n c eo b t a i n e db yP C Rt e c h n o l o g yW a st h ef u l l l e n g t ho fe n c o d i n g r e g i o n ( M a l u sh u p e h e n s i sR e l l dG L B l ，G Q 4 2 3 6 1 9 ) M h G L B le n c o d i n ga p r o t e i no f1 5 8a m i n oa c i d sw i t ham a s so f1 7 8k D a T h ed e d u c e da m i n oa c i d s e q u e n c eo fM h G L B ls h o w e d9 5 5 7 ，8 2 8 2a n d8 0 1 2p e r c e n ti d e n t i t yt ot h e p e a r ( 咖U Sc o m m u n i s ) ，c o t t o n ( G o s s y p i u mh i r s u t u m ) ，a l f a l f a ( M e d i c a g os a t i v a ) n o n s y m b i o t i ch e m o g l o b i ne n c o d i n gg e n e T h ep h y l o g e n e t i c t r e es h o w e d M h G L B Ih a sn e a r e s th o m o l o g o u sr e l a t i o n s h i pw i t hp e a rG L B l I tw i l 1b ea st h e p i n g y i t i a n c h ac l a s s 一1n o n s y m b i o t i ch e m o g l o b i ne n c o d i n gg e n e 2 Q u a n t i t a t i v e r e a l t i m eP C Ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a tM h G L B lg e n e e x p r e s s e da td i f f e r e n tl e v e l si nr o o t s ，s t e m sa n dl e a v e s ，t h er e l a t i v ev a l u ei n r o o t sW a sh i g h e s t W h e nN 0 3 w a ss u p p l i e dt ow a t e rc u l t u r e ds e e d l i n g s ， M h G L B lt r a n s c r i p ti nr o o t sr a p i d l ya c c u m u l a t e dw i t h i n2h ，t h ea c c u m u l a t i o n 3 平邑甜茶G L B I 基因的克隆、表达及其功能的研究 o fm R N Ams t e m sa n dl e a v e si n c r e a s e ds l o w l y h aS N Pt r e a t e dr o o t s ，t h e i n d u c t i o no fM h G L B lt r a n s c r i p t sW a sm o r er a p i da n dp e a k e da t2 h ，f o l l o w e d b yar a p i dd o w n - r e g u l a t i o na f t e r2 h A c c u m u l a t i o no fM h G L B lW a sa l s o i n d u c e d b y t h e h y p o x i c s t r e s sw i t h i n12 h ，t h e r e a f t e r , t h ea c c u m u l a t i o n d e c r e a s e d U n d e rt h et r e a t m e n to fA B A ，t h el e v e lo fM h G L B lm R N Aw a s i n c r e a s e da c c o m p a n i e d 、析t 1 1t h ea c c u m u l a t i o no fN O 3 I no r d e rt od e t e r m i n et h e p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lf u n c t i o n ，a c o n s t r u c tc o n t a i n i n gf u l l l e n g t he n c o d i n gr e g i o no fM h G L B lg e n ei ns e n s e o r i e n t a t i o nd r i v e nb yt h ec o n s t i t u t i v ec a u l i f o w e rm o s a i cv i r u s3 5 Sp r o m o t e r w a sa s s e m b l e da n di n t r o d u c e di n t ot o m a t o T h et o l e r a n c eo ft h et r a n s g e n i c t o m a t ou n d e ra b i o t i cs t r e s sw a sa l s o a n a l y z e d C o m p a r e d w i t ht h e w i l d t y p e ，t h ep h o t o s y n t h e t i cr a t eo ft r a n s g e n i ct o m a t od e c r e a s e ds l o w l y T h e p h o t o s y n t h e t i cr a t e ，s t o m a t a lc o n d u c t a n c ea n dt r a n s p i r a t i o nr a t eo fw i l d t y p e W a sd e c r e a s e d8 6 ，8 6 8a n d9 0 7p e r c e n tr e s p e c t i v e l y , b u tt h et r a n s g e n i ct o m a t o n u m b e rla n d5d e c r e a s e do n l y4 0 1 ，7 2 5 ，7 8 7a n d5 5 3 ，7 0 2 ，8 2 8 p e r c e n t r e s p e c t i v e l y T h el e v e lo fH 2 0 2a n dN Ow a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nw i l d - t y p e a t9 6 ho fw a t e r l o g g i n g K e y w o r d s ：M a l u sh u p e h e n s i sR e h d ；M h G L B l ；N o n s y m b i o t i ch e m o g l o b i n ； H 2 0 2 ；N O ：H y p o x i es t r e s s 4 山东农业大学硕士学位论文 l 前言 1 1 植物血红蛋白的研究概况 血红蛋白( h e m o g l o b i n ，H b ) 最初是在动物中发现的，在血液中起运 输氧气，维持血液酸碱平衡、活化组织细胞、增强自身免疫、抗菌等功能。 而植物血红蛋白发现的较晚，1 9 3 9 面K u b o 首次在豆科植物固氮根瘤中发 现了血红蛋白，后来人们把它定名为豆血红蛋白。之后，A p p l e b y 等从一 种与根瘤菌共生的非豆科的榆科植物P a r a s p o n i aa n d e r s o n i i 中分离出植物 H b s ，并证实P a n d e r s o n i i 拥有一个编码共生、非共生H b s 的双重功能基 因。后来，L a n d s m a n n 等在非豆科植物山麻黄中发现了H b s 的表达。进一 步的研究证实，单子叶植物大麦及其他禾本科植物如玉米、小麦、黑麦、 水稻中也存在植物H b s 。这些发现表明植物血红蛋白在植物中广泛存在， 而并非仅限于豆科植物，并可能具有共生固氮以外的功能，所以改称其为 植物血红蛋白( 陈义烘等，2 0 0 6 ) 。 1 9 9 5 年，J a c o b s e n - L y o n 等在粗枝木麻黄中发现不但存在能在根瘤中 特异表达的，与共生作用相关的共生血红蛋白基因( s y m b i o t i ch e m o g l o b i n ， s H b ) ，还存在能在其他组织非特异表达，与共生作用无关的非共生血红蛋 白基因( n o n s y m b i o t i ch e m o g l o b i n ，n s H b ) 。之后，又在大豆及其他豆科植 物中发现非共生血红蛋白基因。所以，人们根据与根瘤固氮过程相关与否， 分为与根瘤固氮有关的s H b 和与根瘤固氮无关的m I - t b 两类( 陈义烘等， 2 0 0 6 ) 。 根据氧亲和力的大小，又可将目前在植物中已发现的非共生血红蛋白 分为n s H b 1 和n s I - I b 2 两种。n s H b 1 有很强的氧亲和力，如在拟南芥中， 在P h 7 0 、2 0 的条件下n s H b 1 的P 5 0 可达到6 7 n M 。但这仍然比任何的 细胞色素氧化酶的P 5 0 低，所以其无法将氧气传递给细胞色素氧化酶；其 解离常数也比s H b 的氧解离常数低。这些性质使其更像是一个氧清除剂而 不是氧载体。拟南芥的n s H b 2 则有更低的氧亲和力，在p H 7 0 、2 0 的 条件下P 5 0 为1 3 0 n M ；其解离常数在同样条件下比n s I - I b 1 的稍高，但还 是比s I - l b 的低。正是由于两者具有很低的解离常数，因此，它们在正常生 理状态下不能为组织提供氧。 平邑甜茶G L B l 基因的克隆、表达及其功能的研究 2 0 0 1 年W a R s 等在拟南芥中又发现了另一种血红蛋白。它的氨基酸序 列较以前发现的植物血红蛋白的氨基酸序列短，称为短截血红蛋白 ( t r u n c a t e dh e m o g l o b i n ，t H b ) ，t H b 与n s H b 相似，具有更低的氧亲和力， 后来又在棉花中发现了t H b ，说明植物血红蛋白的存在也有一定广泛性( 陈 义烘等，2 0 0 6 ) 。? 迄今为止，人们根据血红蛋白的序列、表达方式及配体结合性质把植 物的血红蛋白分为三类：共生血红蛋白、非共生血红蛋白、短截血红蛋白。 共生血红蛋白，是目前研究的最清楚的植物血红蛋白，主要存在于豆 类和非豆类植物的固氮根瘤菌感染的细胞中。共生血红蛋白与氧的亲和力 特别强，与氧的结合速率很高，解离速率很低。起初认为豆血红蛋白结合 分子氧，保护位于类菌体内的对氧浓度敏感的固氮酶不被氧化。后来发现 豆血红蛋白最为氧的一种载体，可以缓冲细胞环境，防止氧浓度的大幅度 变化，氧浓度高时豆血红蛋白结合氧，低时释放所结合的氧，达到调节氧 的目的。豆血红蛋白一方面为共生菌的末端氧化酶提供足够的氧，尽管浓 度很低；另一方面又要避免位于共生菌中的对氧气敏感的固氮酶失活。但 关于s H b 在植物体内的功能直到2 0 0 5 年才得到了直接的证实，O t t 等通过 R N A i ( R N Ai n t e r f e r e n c e ) 技术使日本百脉根的血红蛋白基因发生沉默， 结果发现，根瘤中的游离氧增加，类菌体的固氮酶受损，丧失固氮功能； 在补充氮肥后，发生基因沉默的植株又能生长正常。从而证实了s H b 在共 生固氮中的关键作用。 短截血红蛋白首先是在原核生物，原生动物和真核藻类中发现，其序 列比其他血红蛋白的短。短截血红蛋白与非共生血红蛋白有许多共同的特 点，但不同的起源，不同的生化特性表明其可能不同于其他两种血红蛋白 的功能。W a t t s 克隆了拟南芥的第三个血红蛋白。第三个血红蛋白有一类 似细菌，原生动物和真核藻类的短截血红蛋白的中心区域。其在整个植株 中都表达但对能诱导其他血红蛋白表达以及表达状态的分析表明，这个蛋 白可能有独特的生化特性，进化历史以及不同于其他血红蛋白的功能。 短截血红蛋白是发现最晚的植物血红蛋白，人们对其了解很少。由于 其多在活跃的组织如芽、根尖等处，推测其在这些部位提供充足氧有重要 作用( 陈义烘等，2 0 0 6 ) 。 山东农业大学硕士学位论文 非共生血红蛋白结构与人血红蛋白等相似，相对于s H b s 而言，n s H b 与氧亲和力太强，氧释放率很低，因此n s H b 不适合作为氧转运载体而是 氧缓冲物质。有学者提出非共生血红蛋白可能参与多条代谢途径，其作用 包括以下几个方面：( 1 ) 因为和氧的亲和力强，所以起到清除氧的作用； ( 2 ) 通过与黄素蛋白的相互作用参与电子传递；( 3 ) 结合一些已知的配 体，作为感受机制的一部分；( 4 ) 与有机小分子结合在脂肪酸的运输中 起作用或者参与低氧环境下的有机物的合成( 陈义烘等，2 0 0 6 ) ； ( 5 ) 在代谢活跃的细胞中，非共生血红蛋白可能有助于细胞内的氧气扩散到线 粒体，满足高水平氧化磷酸化的要求；( 6 ) 非共生血红蛋白可能是植物 无氧生活的一个正常组分，在低氧浓度下，它可能有助于氧的扩散( 张静 娴等，1 9 9 9 ) 。 1 2 缺氧胁迫下植物n s H b s 对N O 的调节 一般认为，植物中的N O 可能主要由N O S 与N R 途径生成( C u e t o 等， 1 9 9 6 ) ，两种途径在反应中均需N A D ( P ) H 提供还原力。研究表明，每合成 1t o o lN O ，N O S 途径消耗1 5t o o lN A D P H 和2t o o l0 2 ，而N R 途径形成1 t o o lN O 消耗2t o o lN A D H ，不需要消耗0 2 。在缺氧条件下，N O S 途径被 抑制，N R 途径可能是N O 形成的主要途径( S a k i h a m a 等，2 0 0 2 ) 。 缺氧条件下植物细胞中n s H b 与N O 的作用机制如图所示。氧合血红 蛋白与N O 快速反应形成高铁血红蛋白( M e t H b ) 和N 0 3 , M e t H b ( F e 3 + ) 通过依赖于N A D H 的还原酶( M e t H b R ) 被还原为H b ( F e 2 + ) 。在长期缺 氧条件下，可供植物利用的N 0 3 显著减少，而通过N O 与H b 0 2 反应形成 的N 0 3 可被重复利用，有利于提高植物细胞对缺氧胁迫的耐受性 ( I g a m b e r d i e v 等，2 0 0 5 ) 。m 和N O 形成H b N O ，而H b N O 的合成速率 与H b 0 2 的合成速率几乎相同，因此，当N O 产生较多，而0 2 分压较低时， H b N O 的合成在植物体内占优势。 H u n t 等( 2 0 0 2 ) 研究表明，过量表达n s H b s 1 的拟南芥和表达大麦 n s H b s 的紫花苜蓿培养系缺氧胁迫下均具有较高的细胞活性和较强的生长 能力，而n s H b s 表达受抑制的植株表现出器官生长缓慢。进一步研究证实 n s H b s 对缺氧胁迫的耐受性的调节取决于n s H b s 对0 2 的高亲和力及对N O 的清除能力( P e r a z z o l l i 等，2 0 0 6 ) ，而不在于其对0 2 的运载功能。 7 平邑甜茶G L B I 基因的克隆、表达及其功能的研究 高浓度N O 对细胞有毒害作用，H b 和N O 的反应可能是植物减轻N O 毒害的途径之一。利用化学发光和E P R 检测得知，缺氧胁迫激活由N R 催化合成N O 的反应，植物组织N O 释放量增加( P e r a z z o l l i 等，2 0 0 6 ) ， 同时，n s H b s 参与调节N O 的代谢，减少因N O 富集而给植物带来的伤害。 研究证实，在表达大麦n s H b 的紫花苜蓿根提取物中N O 可以被清除 ( I g a m b e r d i e v 等，2 0 0 4 ) ，过量表达n s H b s 1 的拟南芥、过量表达大麦 n s H b s - l 的紫花苜蓿根培养系和玉米细胞系可快速消除缺氧引起的N O 富 集，而n s H b s 1 过量表达受抑制的转基因系中N O 水平上升( P e r a z z o l l i 等，2 0 0 6 ) 植物n s H b s 在维持缺氧条件下植物的还原力方面有重要作用。D o r d a s 等( 2 0 0 3 ) 研究表明，在缺氧条件下，由N R 催化产生的N O 被n s H b s 氧 化成N 0 3 。，同时N A D ( P ) + 被还原为N A D ( P ) H ，维持了缺氧条件下植物的 还原力，这在一定程度上替代了缺氧条件下乙醇脱氢酶( a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ，A D H ) 的作用。S o w a 等( S o w a 等，1 9 9 8 ) 研究证实，缺 氧条件下，与野生型及n s I - - I b s 表达抑制型相比，过量表达大麦n s H b s 的玉 米及紫花苜蓿培养系具较低A D H 活性。进一步研究表明，过量表达大麦 n s H b s 的紫花苜蓿根培养系中N A D ( P ) H N A D ( P ) + 比率较低( I g a m b e r d i e v 等，2 0 0 4 ) ，缺氧及线粒体电子传递受抑制时。该比例不受太大影响，而 n s H b s 表达抑制系在缺氧胁迫下该比例明显增大，表明n s H b s 在参与抵抗 缺氧胁迫响应中可以取代A D H 为植物提供较高的还原力，维持植物正常 生长发育。 缺氧条件下植物不可能通过需氧的氧化磷酸化来提供细胞所需的 A T P ，这暗示了可能存在其他途径来维持缺氧条件下细胞内的能量平衡。 植物在适应缺氧胁迫中与H b s 诱导相关的一系列事件。0 2 缺乏引起线粒 体呼吸下降并使糖酵解产物增加，结果N A D H 水平上升而A T P 水平下降， A T P 水平下降活化N R 并诱导n s H b s 基因表达( S t o h r 等，2 0 0 1 ) ，在N R 催化下N O 大量产生，即而进入n s H b N O 循环，N A D H 的再生及n s H b N 0 反应可维持细胞的还原力及能量水平。与0 2 水平相比，细胞中的A T P 水 平可以更直接的诱导n s H b s 基因表达( N i e 等，1 9 9 7 ) 。研究发现，缺氧条件 下，与野生型和n s H b s 表达抑制型相比，过量表达n s H b s 的玉米细胞培养 山东农业大学硕士学位论文 系可以维持细胞中的能量水平，进而维持细胞存活( S o w a 等，1 9 9 8 ) ， J o r m a k k a 等( 2 0 0 3 ) 研究发现，细菌中N O 代谢途径能产生质子驱动力， 植物中经线粒体由N 0 3 产生N O 的过程可能与电子传递链复合体I 的膜电 势产生有关。进而合成A T P ( I g a m b e r d i e v 等，2 0 0 4 ) 。F a n 等( 1 9 9 7 ) 发现缺 氧条件下。相比N H 4 + ，植物利用N 0 3 做氮源时碳素流失较少，这说明植 物这一合成A T P 的途径比糖酵解更有效。 晰肚鼬恩鸥 l D e c l i n ei nr e s p # a t i o n J 1 猢s ei ng l y c c 虐她f l u x 图1 2 缺氧条件下m H l ) - l 在清除N O 、N A D H 再生及久曙形成中的作用( D o r d 舔等，2 0 0 9 ) F i g1 2T h ef u n c t i o no f n s H b - 1i ns c a v e n g i n gN O ，r e p r o d u c t i o no f N A D H a n dp r o d u c t i o no f A T Pu n d e r h y p o x i a 1 3 低氧胁迫下植物n s H b s 对H 2 0 2 的调节 B a x t e r - B u r r e UA 等( 2 0 0 2 ) 发现低氧压力刺激了R o p 信号转导通路， 激活了D P I 敏感的N A D H 氧化酶，从而增加了H 2 0 2 的产生。B l o k h i n a 等 9 平邑甜茶G L B l 基因的克隆、表达及其功能的研究 ( 2 0 0 1 ) 用低氧处理对低氧敏感的小麦，发现H 2 0 2 大量增加。而A t G L B l 在受到低氧胁迫的诱导后，其表达量也大大增加( H u n t 等，2 0 0 2 ) 。Y a n g 等( 2 0 0 5 ) 研究发现过量表达A t G L B l 的转基因拟南芥在低氧胁迫后有较 高的生存率，而且植株体内积累的H 2 0 2 水平与其体内A t G L B l 的水平负 相关。并且氧合A t G L B l 的浓度越高，反应越快。因此，可以推测在正常 的生理条件下，细胞内的H 2 0 2 水平和A t G L B l 水平都很低，它们之间的 反应很微弱，不会影响H 2 0 2 作为信号分子的功能。一旦植物遭受低氧胁 迫，细胞内的H 2 0 2 水平和A t G L B l 水平都会很快提高，随后两者之间的 反应液加快，从而降低植物细胞中升高的H 2 0 2