毕业论文-动物源性食品中磺胺类药物的检测.doc

毕 业 论 文（设计）题 目 动物源性食品中磺胺类药物的检测 指导老师 专业班级 食品营养与检测122 姓 名 学 号 2015年5月28日浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱技术测定猪肉和奶粉中十六种磺胺类药物的残留。样品经乙腈提取，提取液旋发浓缩至近干，残渣用1mL流动相定容，经正己烷脱脂后过膜，通过Waters C18色谱柱分离，以乙腈和0.1%（体积分数）的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾-正离子多反应监测的质谱模式，以基质外标法进行定量分析。实验结果表明，16种磺胺类药物在1-200 g/L的浓度范围内线性相关系数均大于0.99，该方法的定量限为3.05.0g/kg，在3个浓度添加水平下，各种磺胺类药物的总体回收率为80.2%130.1%，相对标准偏差均小于7.6%。该检测方法操作简单快速、回收率和灵敏度高、重现性好、检出限低，满足动物源性食品中十六种磺胺类药物的检测要求。关键词：超高效液相色谱-串联质谱；磺胺类药物残留；动物源性食品目 录引言11材料与仪器21.1实验材料21.2实验试剂21.3实验仪器22实验方法32.2实验条件32.2.1 色谱条件32.2.2 质谱条件33 结果与分析43.1色谱条件的优化43.2质谱条件的优化53.3线性范围53.4回收率和精密度63.5检出限和定量限83.6实际样品测试8结论9参考文献10II引言 磺胺类药物是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物1。也是应用最早的一类人工合成抗菌药物, 具有抗菌谱广、疗效强、方便安全等优点, 广泛应用于畜牧业生产、禽类饲养以及渔业养殖。该药物在动物体内的作用和代谢时间较长，人类摄入含磺胺类药物残留的动物性食品，可能对健康造成潜在的危害,可引起人体过敏反应、泌尿系统受损、血液系统的不良反应及机体产生抗药性等。近年来，由于人们不合理使用和滥用磺胺类药物以及不遵守休药期等，问题不断显现出来。2007年12月日本产牛肉被检出磺胺间甲氧嘧啶钠含量严重超标，2008年10月广东对蔬菜畜禽质量抽检，鸡肉磺胺类药物残留超标，2013年5月明一婴儿奶粉检出磺胺多辛等。目前，中国、欧盟、美国、日本等均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物, 其最大残余限量一般为50100g/kg，其中日本对磺胺二甲嘧啶的最大残余限量要求小于10g/kg 2。因此，对动物源性食品中磺胺类药物残留的检测的研究具有重要的现实意义。磺胺类药物残留检测的方法主要有酶联免疫法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。近年来，国内外有关于测定动物源性食品中磺胺类药物的方法报道有较多。冯才伟等建立酶联免疫法对猪肉中的磺胺药物残留的检测，最低检测限为1.5g/kg，平均回收率范围为76.1%101.7%3。查玉兵等建立高效液相色谱法测定猪肉中猪肉中五种磺胺类药物残留的测定，最低检出限为5g/kg,样品的加标回收率为80.1%96.5%4。虽然，酶联免疫法具有操作简单、快速的优点，但容易产生交叉反应和假阳性，检测结果较不准确。液相色谱法具有分离速度快、分析效率高等优点，但由于基质干扰的存在难于准确定性和定量分析5-6。因此迫切需要建立一种快速、准确、高效的检验方法。超高效液相色谱-串联质谱技术可同时测定多个目标化合物，超高效液相色谱的高分离效能与质谱的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相结合成为强有力的分析工具，以其操作简便准确度和灵敏度高、选择性强等优点成为兽药抗生素残留检测的筛查方法7。随着对UPLC-MS/MS的深入研究和该技术应用的普及，UPLC-MS/MS已经成为药物分析的有利工具。本文以猪肉和奶粉为检测对象利用超高效液相串联质谱技术建立动物源性食品中十六种磺胺类药物的定性和定量一次进样完成检测的方法。该方法具有高效、快速、检出限低、灵敏度高的特点。1材料与仪器1.1实验材料猪肉，奶粉(实验室提供)1.2实验试剂甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司产品；甲酸：色谱纯，美国TEDIA公司产品；水为Milli-Q系统纯水化。磺胺醋酰（纯度99.5%），磺胺嘧啶（纯度99.5%），磺胺噻唑（纯度99.5%），磺胺吡啶（纯度99.0%），磺胺甲基嘧啶（纯度99.2%），磺胺二甲嘧啶（纯度99.0%），磺胺对甲氧嘧啶（纯度98.0%），磺胺甲噻二唑（纯度99.0%），磺胺甲氧哒嗪（纯度99.2%），磺胺-6-甲氧嘧啶（纯度99.0%），磺胺氯哒嗪（纯度99.0%），磺胺邻二甲氧嘧啶（纯度99.5%），磺胺甲氧异恶唑（纯度99.0%），磺胺二甲异恶唑（纯度98.0%），磺胺间二甲氧嘧啶（纯度99.5%），磺胺苯吡唑（纯度99.0%），标准品均购于德国Dr.E公司。 标准溶液的配制：分别准确称取10.0mg上述标准品（需折算标准品纯度）于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1.0mg/mL的储备液，密封储存于-18冰箱中。分别吸取50L的1.0mg/mL的标准溶液于10mL容量瓶，用甲醇定容，配制成5.0g/mL的混合标准溶液，用时再稀释成一系列浓度的标准溶液，待测。1.3实验仪器AcquityTM超高效液相色谱仪和XevoTMTQ-MS质谱仪，美国Waters公司产品，配有电喷雾电离接口（ESI)及Masslynx数据处理系统； Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司产品；旋转蒸发仪，B-740，瑞士BUCHI公司；高速离心机，ST16R，美国Thermo公司；涡旋混合仪，WH-861，太仓市华利达实验设备有限公司。2实验方法2.1样品处理称取5g试样，精确至0.01g，置于50mL离心管中加入20g无水硫酸钠和20mL乙腈，均质2min后以8000 r/min超速离心3 min。上清液倒入100mL鸡心瓶中，残渣再加入20mL乙腈，重复上述操作一次。合并上清液后，向鸡心瓶中加入10mL异丙醇，用旋转蒸发器于50水浴蒸干，准确加入1mL流动相和1mL正己烷溶解残渣。转移至5mL离心管中，涡旋1min,以3000r/min离心3min,将上层正己烷弃去，再加入1mL正己烷，重复上述步骤，直至下层水相变成透明液体。按上述操作步骤制备样品空白提取液。取下层清液，过0.22m滤膜后，用超高效液相色谱-串联质谱仪测定。2.2实验条件2.2.1 色谱条件色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱2.1mm100mm,粒径1.7m；柱温：35；样品温度：25；进样体积：5L；流速：0.2mL/min;流动相：乙腈(A),0.1%甲酸水溶液(B)；按表2.1洗脱程序进行梯度洗脱。表2.1梯度洗脱程序时间(min)A：乙腈(%)B：0.1%甲酸水(%)055991313151516161717201010404040909090101090906060601010109090 2.2.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测（MRM)；毛细管电压为2.80kV，离子源温度为150，脱溶剂气温度为500，脱溶剂气流流量为1000L/h。3 结果与分析3.1色谱条件的优化 高效的色谱柱是多组分分析的前提条件，本实验用Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm100mm,粒径1.7m）色谱柱来分离十六种磺胺类药物，如图3.1，此色谱柱对各化合物具有较强的保留，各色谱峰峰型较好，并得到了有效的分离，减少了杂质的干扰。分别选择甲醇和乙腈作为强洗脱流动性。实验证明：当甲醇作为流动相时，离子化受到不同程度的抑制，峰型变宽，峰度明显降低，导致灵敏度下降，而乙腈的离子化效率明显优于甲醇，故本实验采用乙腈强洗脱流动性。在流动相中加入甲酸能增加各种化合物在ESI模式下的离子化效率，改善各化合物的峰形。本实验分别配制0.05%，0.1%和0.2%的甲酸水溶液作为流动相，经试验表明0.1%的甲酸水溶液体系能提供最佳离子化条件，峰面积信号最强，灵敏度最高。图3.1 十六种磺胺类药物的MRM色谱图 3.2质谱条件的优化在电喷雾质谱、正离子监测模式下，分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和选择离子等进行充分的优化，选取经碰撞后所得峰度较高的两个子离子作为定量和定性离子，并确定其最佳碰撞能量的电压值。最终所选择确定的母离子、子离子和碰撞能量等参数见表3.1。表3.1 十六种磺胺类药物的质谱分析条件编号化合物保留时间(Min)监测离子(m/z)锥孔电压(V)碰撞能量(eV)1磺胺醋酰3.14215.00/155.95*,215.00/107.902010,202磺胺嘧啶4.27251.10/156.00*,251.10/107.902016,223磺胺噻唑5.88256.10/156.00*,256.010/107.902615,244磺胺吡啶6.48250.10/156.00*,250.10/184.102516,185磺胺甲基嘧啶7.50265.10/156.00*,265.10/172.002520,166磺胺二甲嘧啶10.52279.10/186.00*,279.10/156.002817,207磺胺对甲氧嘧啶10.76281.10/156.00*,281.10/215.152818,228磺胺甲噻二唑11.00271.00/156.00*,271.00/107.902214,249磺胺甲氧哒嗪11.52281.10/156.00*,281.10/215.152818,2210磺胺-6-甲氧嘧啶12.06281.10/156.00*,281.10/215.152818,2211磺胺氯哒嗪12.41285.00/156.00*,285.00/107.952215,2412磺胺邻二甲氧嘧啶12.53311.10/156.00*,311.10/107.903020,2813磺胺甲氧异恶唑12.85254.10/156.00*,254.10/107.902516,2414磺胺二甲异恶唑13.08268.00/155.80*,268.00/112.802314,1815磺胺间二甲氧嘧啶14.19311.10/156.00*,311.10/107.903020,2816磺胺苯吡唑14.86315.10/156.00*,315.10/160.103420,24*定量离子3.3线性范围配制系列标准溶液，磺胺类化合物浓度分别为1，10，25，100，150，200g/L，以各分析物的峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，线性回归方程及相关系数见表3.2。结果表明：各种磺胺类药物在各自的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数r均在0.99以上。表3.2十六种磺胺类药物的线性方程、线性范围、相关系数编号化合物线性范围(g/L)线性方程相关系数 (r2)1磺胺醋酰1-200Y=816.703x-15.43650.99192磺胺嘧啶1-200Y=1026.89x-539.6940.99723磺胺噻唑1-200Y=2432.05x-485.0440.99694磺胺吡啶1-200Y=4932.29x-875.1650.99995磺胺甲基嘧啶1-200Y=1144.3x-506.4640.99846磺胺二甲嘧啶1-200Y=2813.65x-707.3550.99737磺胺对甲氧嘧啶1-200Y=8139.30x-132.4870.99378磺胺甲噻二唑1-200Y=7650.94x-111.7030.99529磺胺甲氧哒嗪1-200Y=3292.1x-657.2290.999510磺胺-6-甲氧嘧啶1-200Y=2508.70x-104.3860.990811磺胺氯哒嗪1-200Y=2877.12x-357.7650.996712磺胺邻二甲氧嘧啶1-200Y=2553.65x-433.9240.996813磺胺甲氧异恶唑1-200Y=602.044x-70.61460.990514磺胺二甲异恶唑1-200Y=3095.18x-716.8850.995415磺胺间二甲氧嘧啶1-200Y=2538.16x-578.4720.996816磺胺苯吡唑1-200Y=1541.36x-376.2310.99573.4回收率和精密度 分别在阴性的猪肉、奶粉样品基质中添加低、中、高三个不同浓度水平的混合标准溶液，每个浓度做三个平行，根据不同基质的性质，按2.1方法进行预处理，回收率和相对标准偏差见表3.3和3.4。表3.3 磺胺类药物的回收率（猪肉基质加标）编号化合物猪肉加标(g/kg)3.015.080回收率%RSD%回收率%RSD%回收率%RSD%1磺胺醋酰89.41.2113.72.682.52.02磺胺嘧啶114.80.9117.10.5107.41.23磺胺噻唑100.32.0116.81.7107.31.94磺胺吡啶99.72.4114.22.7108.12.45磺胺甲基嘧啶100.71.8115.32.0106.42.46磺胺二甲嘧啶103.82.9118.31.6112.41.87磺胺对甲氧嘧啶100.53.0130.12.795.42.68磺胺甲噻二唑116.23.6126.64.0118.74.29磺胺甲氧哒嗪108.74.6130.15.290.05.210磺胺-6-甲氧嘧啶94.13.7125.04.187.64.711磺胺氯哒嗪90.45.5102.84.895.05.812磺胺邻二甲氧嘧啶91.22.8121.53.7115.63.013磺胺甲氧异恶唑103.43.8125.34.0115.46.214磺胺二甲异恶唑126.04.1114.53.9109.15.815磺胺间二甲氧嘧啶93.45.0104.95.597.84.516磺胺苯吡唑99.84.8114.65.0101.96.3表3.4 磺胺类药物的回收率（奶粉基质加标）编号化合物奶粉加标 (g/kg)525125回收率%RSD%回收率%RSD%回收率%RSD%1磺胺醋酰99.74.0103.53.6104.64.12磺胺嘧啶87.62.886.42.684.43.53磺胺噻唑80.23.890.34.590.44.04磺胺吡啶87.73.985.63.884.04.65磺胺甲基嘧啶91.75.092.35.193.05.66磺胺二甲嘧啶92.15.9101.05.899.26.57磺胺对甲氧嘧啶95.64.992.04.889.65.88磺胺甲噻二唑85.36.988.66.886.86.59磺胺甲氧哒嗪100.45.6100.95.5105.75.010磺胺-6-甲氧嘧啶83.55.985.25.487.55.111磺胺氯哒嗪94.06.396.05.897.25.512磺胺邻二甲氧嘧啶84.26.887.67.395.17.413磺胺甲氧异恶唑98.75.496.75.097.35.214磺胺二甲异恶唑85.96.389.76.487.66.915磺胺间二甲氧嘧啶90.15.589.05.081.06.916磺胺苯吡唑81.36.481.57.385.67.6 由上表可知，猪肉样品在3、15、80g/kg三个不同添加浓度水平下，磺胺类药物的回收率分别为89.4%126.0%、102.8%130.1%和82.5%118.7%，RSD%范围分别为0.9%5.5%、0.5%5.5%和1.2%6.3%。奶粉样品在5、25、125g/kg三个不同添加浓度水平下，磺胺类药物的回收率分别为80.2%100.4%、85.2%103.5%和81.0%105.7%。RSD%范围分别为2.8%6.9%、2.6%7.3%和3.5%7.6%。实验结果表明：该方法基本满足日常样品中磺胺类药物残留的快速测定要求。3.5检出限和定量限以3倍信噪比(S/N=3)计算方法的最低检出限，以10倍信噪比(S/N=10)计算方法的最低定量限，猪肉基质中磺胺类抗生素药物的检出限和定量限分别为1.0g/kg和3.0g/kg。奶粉基质中磺胺类抗生素药物的检出限和定量限分别为1.5g/kg和5.0g/kg。3.6实际样品测试在优化的操作条件下，按上述方法对50批猪肉和40批奶粉样品进行测试，结果未检出阳性样品。其检测结果见表3.5。表3.5实际样品检测结果编号样品项目测试值g/kg样品项目测试值g/kg1猪肉磺胺醋酰ND奶粉磺胺醋酰ND2猪肉磺胺嘧啶ND奶粉磺胺嘧啶ND3猪肉磺胺噻唑ND奶粉磺胺噻唑ND4猪肉磺胺吡啶ND奶粉磺胺吡啶ND5猪肉磺胺甲基嘧啶ND奶粉磺胺甲基嘧啶ND6猪肉磺胺二甲嘧啶ND奶粉磺胺二甲嘧啶ND7猪肉磺胺对甲氧嘧啶ND奶粉磺胺对甲氧嘧啶ND8猪肉磺胺甲噻二唑ND奶粉磺胺甲噻二唑ND9猪肉磺胺甲氧哒嗪ND奶粉磺胺甲氧哒嗪ND10猪肉磺胺-6-甲氧嘧啶ND奶粉磺胺-6-甲氧嘧啶ND11猪肉磺胺氯哒嗪ND奶粉磺胺氯哒嗪ND12猪肉磺胺邻二甲氧嘧啶ND奶粉磺胺邻二甲氧嘧啶ND13猪肉磺胺甲氧异恶唑ND奶粉磺胺甲氧异恶唑ND14猪肉磺胺二甲异恶唑ND奶粉磺胺二甲异恶唑ND15猪肉磺胺间二甲氧嘧啶ND奶粉磺胺间二甲氧嘧啶ND16猪肉磺胺苯吡唑ND奶粉磺胺苯吡唑ND结论 本实验建立了猪肉、奶粉中十六种磺胺类药物残留的UPLC-MS/MS的检测方法，该方法在猪肉和奶粉两种基质下，十六种磺胺类药物的质量浓