二重PCR法快速检测3种食源性致病菌.pdf

第 5 卷 第 9 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 5 No. 9 2014 年 9 月 Journal of Food Safety and Quality Sep. , 2014 堃蔡军、欧静为共同第一作者 CAI Jun and OU Jing-Kun are co-first authors. *通讯作者: 蔡军, 博士, 主要研究方向为食品分子生物学检测及科研。E-mail:cai_jun *Corresponding author: CAI Jun, Ph.D, Nutrition 营养健康与食品安全北京市重点实验室, 北京 102209) 摘摘 要要: 目的目的 建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 沙门氏菌属(Salmonella spp.)及志 贺氏菌属(Shigella spp.)的二重 PCR 方法。方法方法 分别针对金黄色葡萄球菌 femA 和 nuc、沙门氏菌属 invA 和 hilA 及志贺氏菌属 ipaB 和 ipaH 设计 6 对特异性引物, 检测每对引物的特异性及灵敏度, 组合优化各自二重 PCR 反应体系。结果结果 初步建立了针对这 3 类致病菌的二重 PCR 检测方法, 整个检测过程不超过 18 h, 检测 灵敏度均可达 10 pg DNA/reaction。结论结论 所建立的针对 3 类致病菌的二重 PCR 检测方法具有灵敏度高、特 异性强和方便高效等优点, 具有良好的市场应用前景。 关键词关键词: 二重 PCR; 金黄色葡萄球菌; 沙门氏菌属; 志贺氏菌属; 快速检测 Duplex polymerase chain reaction methods for rapid determination of 3 foodborne bacterial pathogens CAI Jun*, OU Jing-Kun*, LI Hui, HU Meng-Long, FU Yang, LIU Dong-Xue (Nutrition Beijing Key Laboratory of Nutrition, Health Staphylococcus aureus; Salmonella spp.; Shigella spp.; rapid detection 2838 食品安全质量检测学报 第 5 卷 1 引 言 近些年, 食品安全事件频频出现, 食品安全问 题也越来越被社会公众所关注。在世界范围内, 每年 有超过 30%的人口患食源性疾病。 预防和控制食源性 疾病的发生和传播, 已成为解决食品安全问题的重 要举措, 其关键在于快速准确的检测与鉴定食源性 致病菌。 在当前食品生产和流通过程中, 一般采用传统 微生物培养法检测食源性致病菌, 通常需要经过富 集培养、 形态观察、 生理生化鉴定等一系列复杂过程, 检测周期长、操作程序繁琐1-2, 难以满足大规模、 高通量、 快速准确检测的现实需求。 因此, 建立快速、 准确、灵敏、高效的食源致病菌检测方法, 对于有效 预防和控制因食源致病菌引起食源性疾病的发生和 传播具有重要意义3-4。随着分子生物学技术的发展, 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)检测 技术在食源致病菌检测中得到了广泛应用和发展, 针对各种食源性致病菌的 PCR 检测技术逐渐被建立 起来。李荔枝等5建立了针对原料乳中金黄色葡萄球 菌肠毒素 A 基因型的 PCR 检测技术, 何晖等6进一 步建立了金黄色葡萄球菌肠毒素 A, B, C, E 基因的 PCR 检测技术, 许会会等7建立了沙门氏菌 PCR 检 测方法, 刘书花等8建立了 3 类食品中沙门氏菌 PCR 快速检测方法, 许会会等9建立了牛奶中志贺氏菌 PCR 检测方法, 李金磊等10建立了饲料中志贺氏菌 PCR 快速检测方法。 此外, 多个国家颁布了检测食源 性致病菌的 PCR 方法标准, 如加拿大颁布的 MFLP-23、MFLP-26 及 MFLP-78 等, 我国颁布的 GB/T 28642、SN/T 1869、SN/T 3640 及 SN/T 1632.2 等。然而, 虽然 PCR 技术具有操作简便、成本低廉 和快速高效等优点, 但由于检测目标基因单一可能 造成假阳性, 大多数食品安全检测人员对 PCR 方法 检测食源性致病菌的准确性存在疑虑。因此, 基于 PCR 技术的多重 PCR 方法越来越受到食品安全检测 人员的关注和重视。 本研究通过对多重 PCR 方法检测金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)和志贺氏菌属(Shigella spp.)的可行性及实用性 展开深入研究和探讨, 建立了分别针对金黄色葡萄 球菌、沙门氏菌属和志贺氏菌属高灵敏度、简洁高效 的多重 PCR 检测体系, 为食品中这 3 类致病菌快速 检测产品的研发提供了一定的研究基础, 也为广大 食品安全检测人员进行多种致病菌的快速检测提供 了一定的技术参考。 2 材料与方法 2.1 材 料 2.1.1 供试菌株 实验菌株部分购自 ATCC、CGMCC 和 CICC 菌 种库, 部分为本实验室分离保藏。所有供试菌株均先 经过 ATB 和(或)API 细菌鉴定系统鉴定后保藏使用, 菌株目录如表 1。 2.1.2 主要试剂 营养肉汤和营养琼脂(NA)购自北京陆桥技术有 限责任公司; dNTPs、Taq 酶、DNA Marker 等, 购自 Takara 公司; 细菌 DNA 提取试剂盒(E.Z.N.A. Bacterial DNA Kit)购自美国 OMEGA 公司, TES 缓冲 液(PH 8.0)由本实验室配置保存。 2.1.3 仪器设备 PCR 仪(Veriti 96 孔快速热循环仪)购自美国 ABI 公司, 电泳仪、 凝胶成像系统(Gel Doc XR+ System) 购自美国BIO-RAD公司, NanoDrop 2000超微量分光 光度计购自美国 ThermoFisher 公司, 冷冻离心机购 自美国 Beckman 公司。 2.2 方 法 2.2.1 细菌培养及模板制备 分别挑取金黄色葡萄球菌(CGMCC 1.2465)、肠 炎沙门氏菌(CICC 21482)和褔氏志贺氏菌(CGMCC 1.1868)单菌落接种于营养肉汤培养基中, 37 过夜 培养。采用 OMEGA 细菌 DNA 提取试剂盒提取相应 细菌基因组 DNA, 用 NanoDrop 2000 超微量分光光 度计测定浓度, 分装, 20 保存备用。 分别挑取经过鉴定的菌株单菌落接种于营养肉 汤培养基中, 37 过夜培养。参考陈琼等3采用的水 煮裂解法制备相应细菌基因组 DNA, 主要操作步骤 如下: 取相应培养物 1 mL 于 1.5 mL 离心管中, 10000 r/min离心5 min, 弃上清液; 菌体用500 L TES缓冲 液洗涤 2 次, 弃上清; 200 L TES 缓冲液重悬菌体, 100 水浴 15 min, 涡旋振荡裂解释放基因组 DNA, 13000 r/min、4 离心 10 min, 取上清分装, 20 保 存备用。 第 9 期 蔡 军, 等: 二重 PCR 法快速检测 3 种食源性致病菌 2839 2.2.2 引物设计 依据金黄色葡萄球菌(CGMCC 1.2465)femA 和 nuc 基因、肠炎沙门氏菌(CICC 21482)invA 和 hilA 基 因及褔氏志贺氏菌(CGMCC 1.1868)ipaH和ipaB基因 序列, 应用 Primer 5.0 软件设计筛选相应特异性多重 PCR 引物, 引物序列如表 2。 2.2.3 单重 PCR 特异性及灵敏度检测 以金黄色葡萄球菌(CGMCC 1.2465)、肠炎沙门 氏菌(CICC 21482)和褔氏志贺氏菌(CGMCC 1.1868) 基因组 DNA 为模板, 按浓度 10 ng/L100 fg/L 进 行 10 倍梯度稀释, 分别进行 PCR 检测; 同时, 设置 以 50 ng/L 的大肠埃希氏菌(CGMCC 1.3373)基因组 DNA 为模板的阴性对照及分别以 50 ng/L 的金黄色 葡萄球菌(CGMCC 1.2465)、肠炎沙门氏菌(CICC 21482)和褔氏志贺氏菌(CGMCC 1.1868)基因组 DNA 为模板的阳性对照。经优化的反应体系为: 2.5 L 10PCR buffer, 1.0 L 10 mmol/L dNTPs, 各引物 0.4 mol/L, Taq酶 1.0 U, 1 L DNA模板, 加 ddH2O至 25 L。经优化的扩增程序为: 95 预变性 2 min; 94 变性 15 s, 55 退火 20 s, 72 延伸 30 s, 30 个循环; 72 延伸 7 min。经凝胶电泳分析相应 PCR 扩增产 物, 分别纯化后测序验证。 2.2.4 二重 PCR 体系的建立及检测灵敏度检测 对二重 PCR 反应中主要影响因素, 如引物的选 表 1 供试菌株 Table 1 The tested strains 序号 菌株名称 菌株编号 菌株来源 1 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CICC 21600 中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 2 金黄色葡萄球菌金黄亚种 Staphylococcus aureus subsp. aureus CGMCC 1.2465 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC) 3 表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermidis CICC 10294 中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 4 表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermidis CGMCC 1.2429 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC) 5 大肠埃希氏菌 Escherichia coli CICC 23657 中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 6 大肠埃希氏菌 Escherichia coli CICC 10389 中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 7 大肠埃希氏菌 Escherichia coli CGMCC 1.3373 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC) 8 深褐芽孢杆菌 Bacillus atrophaeus CGMCC 1.3343 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC) 9 弗氏柠檬酸杆菌 Citrobacter freundii CGMCC 1.1732 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC) 10 蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus CGMCC 1.1846 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC) 11 肠炎沙门氏菌 Salmonella enteritidis CICC 21482 中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 12 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhimurium CGMCC 1.1190 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC) 13 褔氏志贺氏菌 Shigella flexneri CICC 21534 中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 14 褔氏志贺氏菌 Shigella flexneri CGMCC 1.1868 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(CGMCC) 15 宋氏志贺氏菌 Shigella sonnei ATCC 25931 美国模式培养物集存库(ATCC) 2840 食品安全质量检测学报 第 5 卷 表 2 引物序列 Table 2 Primers 菌株名称 目的基因 引物序列(5-3) 产物大小(bp) 金黄色葡萄球菌 (CGMCC 1.2465) femA Sa-femA-F: AAGCACACAACAAGCGAGATAAC Sa-femA-R: TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG 130 nuc Sa-nuc-F: TACATGTTCAAAGAGTTGTGGATG Sa-nuc-R: ATAAACATCTTGATTTGTTAATGTCTTCTTAC 179 肠炎沙门氏菌 (CICC 21482) invA Se-invA-F: TTGACGAGCTTTATCATTGTCTG Se-invA-R: ACGTCTTTTTCTCTTGGTGCC 256 hilA Se-hilA-F: TGAATTACGCTCACAACACCTG Se-hilA-R: TGCTAAGCAACCAGATTACGATG 430 褔氏志贺氏菌 (CGMCC 1.1868) ipaH Shf-ipaH-F: CTCACATGGAACAATCTCCG Shf-ipaH-R: TCATTCTCTTCACGGCTTCTG 320 ipaB Shf-ipaB-F: TGAAAGCAGTCATTGAACCC Shf-ipaB-R: TGAGAGTTGGACATTGAGGC 592 择、 引物浓度、 退火温度、 dNTPs 浓度等进行优化, 确 定二重 PCR 反应体系及扩增程序。分别以金黄色葡 萄球菌(CGMCC 1.2465)、 肠炎沙门氏菌(CICC 21482) 和褔氏志贺氏菌(CGMCC 1.1868)基因组 DNA 为模 板, 按浓度 10 ng/L100 fg/L 进行 10 倍梯度稀释, 分别进行二重 PCR 检测; 同时, 设置以 50 ng/L 的 大肠埃希氏菌(CGMCC 1.3373)基因组 DNA 为模板 的阴性对照及分别以 50 ng/L 的金黄色葡萄球菌 (CGMCC 1.2465)、 肠炎沙门氏菌(CICC 21482)和褔氏 志贺氏菌(CGMCC 1.1868)基因组 DNA 为模板的阳 性对照。相应 PCR 扩增产物经凝胶电泳分析并纯化 后测序验证, 以检测扩增特异性及灵敏度。 2.2.5 二重 PCR 体系检测特异性及稳定性验证 应用包含 3 种致病菌的标准菌株和分离鉴定的 菌株共计 32 株人工感染牛乳(按 1.0%的体积比(相应 菌株的活化培养液: 牛乳液=1:100)进行混合制备), 按 5%的体积比接种于营养肉汤培养基中, 37 过夜 培养。分别采用 OMEGA 细菌 DNA 提取试剂盒及水 煮裂解法制备基因组 DNA 模板进行 PCR 检测。 凝胶 电泳分析相应 PCR 扩增产物, 检测扩增的特异性及 稳定性。 3 结果与分析 3.1 单重 PCR 检测特异性及灵敏度分析 应用所设计的 6 对引物, 分别采用表 1 所示菌株 基因组 DNA 为模板进行特异性检测。结果显示, 以 femA 和 nuc 为目标基因进行扩增, 仅金黄色葡萄球 菌菌株(CICC 21600 及 CGMCC 1.2465)DNA 为模板 体系中扩增出目的条带, 并且均无非目的条带出现; 以 invA 和 hilA 为目标基因进行扩增, 仅沙门氏菌菌 株(CICC 21482及CGMCC 1.1190)为模板体系中扩增 出目的条带, 并且均无非目的条带出现; 以 ipaH 和 ipaB 为目标基因进行扩增, 仅志贺氏菌菌株(CICC 21534、CGMCC 1.1868 及 ATCC 25931)为模板体系 中扩增出目的条带, 并且均无非目的条带出现。 单重 PCR 检测灵敏度检测结果显示(图 1), 以 femA 及 nuc 为目标基因对金黄色葡萄球菌进行检测 (图 1A), 以 invA 及 hilA 为目标基因对肠炎沙门氏菌 进行检测(图 1B), 以ipaH及ipaB为目标基因对褔氏 志贺氏菌进行检测(图 1C), 检测灵敏度均分别达 1 pg 及 10 pg。 3.2 二重 PCR 检测灵敏度分析 对分别针对金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌和志贺氏 菌的二重 PCR 检测体系各参数进行优化, 确定了最 佳的反应体系及条件。最佳反应体系为: 2.5 L 10PCR buffer, 2.0 L 10 mmol/L dNTPs, 各引物均 0.25 mol/L, Taq 酶 1.5 U, 1 L 基因组 DNA 模板, 加 ddH2O 至 25 L。经优化确定的扩增程序为: 95 预 变性 2 min; 94 变性 15 s, 55 退火 15 s, 72 延伸 第 9 期 蔡 军, 等: 二重 PCR 法快速检测 3 种食源性致病菌 2841 35 s, 35 个循环; 72 延伸 7 min。采用上述反应体系 及反应条件的二重 PCR检测灵敏度检测结果显示(图 2), 针对金黄色葡萄球菌的二重 PCR 检测灵敏度均 达到 10 pg, 其中, 以 femA 为目标的检测灵敏度达 1 pg(图 2A); 针对沙门氏菌的二重 PCR 检测灵敏度均 达到 10 pg(图 2B); 针对志贺氏菌的二重 PCR 检测 灵敏度均达到 10 pg(图 2C)。 以上各检测体系中引物 对间均无明显非特异交叉扩增出现。 3.3 人工模拟实验分析 应用包含 3 种致病菌的标准菌株和分离鉴定的 菌株共计 32 株人工感染牛乳, 营养肉汤培养基 37 过夜培养。随机选取 17 株细菌培养物采用细菌基因 组 DNA 提取试剂盒法制备相应样本细菌基因组 DNA, 剩余 15 株细菌培养物则采用水煮裂解法制备 相应样本细菌基因组 DNA, 课题组运用所建立的二 重 PCR 检测体系及条件进行检测以期对理论推断进 行结果验证。结果显示, 32 份人工感染牛乳样本二重 PCR 扩增产物中均无其他非特异条带出现, 表明所 建立的二重 PCR 检测体系及条件具有较强的检测特 异性; 同时, 每份样本的二重 PCR 扩增产物中扩增 条带的数量及大小同理论结果完全一致, 检测准确 率达 100 %。表明所建立的二重 PCR 检测体系具有 检测稳定性好、特异性强及准确率高等优点, 特别是 采用水煮裂解法制备细菌基因组DNA的二重PCR检 测体系及方法还具有操作简单、成本低廉等优点, 具 有较强的可推广应用性。 图 1 单重 PCR 反应检测灵敏度检测 注: M100bp DNA 分子量标准, 其分子量由小至大依次为(bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 16 及 914模板 细菌基因组DNA浓度递增依次为: 100 fg/L, 1 pg/L, 10 pg/L, 100 pg/L, 1 ng/L和10 ng/L, 8及16阴性对照, 7及15阳性对照; (A) 金黄色葡萄球菌单重 PCR 检测: 18PCR 扩增 femA 基因, 916PCR 扩增 nuc 基因; (B)沙门氏菌单重 PCR 检测: 18PCR 扩增 invA 基因, 916PCR 扩增 hilA 基因; (C)志贺氏菌单重 PCR 检测: 18PCR 扩增 ipaH 基因, 916PCR 扩增 ipaB 基因。 Fig. 1 The detection sensitivity of single PCR reaction M-100bp DNA marker, the corresponding molecular weight (from small to large, bp) was 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, and 1500, respectively; 16 and 914 - the template DNA concentrations were 100 fg/L, 1 pg/L, 10 pg/L, 100 pg/L, 1 ng/L and 10 ng/L, respectively; 8 and 16 - set as the negative controls; 7 and 15 - set as the positive controls. (A) Single PCR reaction of Staphylococcus aureus, 18 - target for the femA gene, 916 - target for the nuc gene; (B) Single PCR reaction of Salmonella spp., 18 - target for the invA gene, 916 - target for the hilA gene; (B) Single PCR reaction of Shigella a spp., 18 - target for the ipaH gene, 916 - target for the ipaB gene. 图 2 金黄色葡萄球菌(A)、沙门氏菌(B)和志贺氏菌(C)二重 PCR 反应检测灵敏度检测 注: M100bp DNA 分子量标准, 其分子量由小至大依次为(bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 16模板细菌基因组 DNA 浓度递增依次为: 100 fg/L, 1 pg/L, 10 pg/L, 100 pg/L, 1 ng/L 和 10 ng/L, 8阴性对照, 7阳性对照 Fig. 2 The detection sensitivity of duplex PCR reaction for Staphylococcus aureus(A), Salmonella spp.(B) and Shigella spp.(C) M-100bp DNA marker, the corresponding molecular weight (from small to large, bp) was 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, and 1500, respectively; 16 - the template DNA concentrations were 100fg/L, 1 pg/L, 10 pg/L, 100 pg/L, 1 ng/L and 10 ng/L, respectively; 8 - set as the negative controls; 7 - set as the positive controls 2842 食品安全质量检测学报 第 5 卷 . 4 讨 论 多重PCR技术11是在单重PCR技术基础上发展 起来的一种快速准确、操作简单、结果稳定、成本较 低的 PCR 技术, 优点明显, 具有非常好的应用发展 前景, 目前在食品安全检测中得到了初步的应用和 发展12-17。 本研究在单重 PCR 检测技术的基础上, 为进一 步加大检测覆盖范围及提高检测准确度, 尝试采用 二重 PCR 技术检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属和 志贺氏菌属。分别以金黄色葡萄球菌 femA 及 nuc、 沙门氏菌属 invA 及 hilA 和志贺氏菌属 ipaH 及 ipaB 为检测目标基因, 通过序列比对分析, 设计筛选得到 文中所列的6对引物, 并对每对引物的检测特异性和 灵敏度进行了检测。多重 PCR 的影响因素复杂, 如 不同引物间、 模板和引物浓度及其比例、 dNTPs 浓度、 Mg2+浓度、Tm 值大小和退火温度等, 相应技术体系 构建难度较大。本研究通过优化影响二重 PCR 反应 的主要条件, 如引物浓度及其比例、 dNTP 浓度、 Mg2+ 浓度和退火温度等, 建立了稳定、特异、灵敏度高的 二重 PCR 反应体系。 在实际食品致病菌检测过程中, 由于多重 PCR 检测的检测目标为致病菌特异性的 DNA 序列, 容易 扩增出死亡致病菌的 DNA 造成检测假阳性, 因此建 议在实际工作中, 先在经过预增菌检测样品中加入 核酸交联剂来抑制死细菌基因组的影响, 再利用多 重 PCR 方法对样品进行检测, 对于极少数可疑检测 结果, 再结合相应国标方法进行验证。 本研究建立了分别针对金黄色葡萄球菌、 沙门氏 菌和志贺氏菌快速检测的二重 PCR 检测体系, 特异 性强、灵敏度高、操作简单、成本较低, 检测限均达 到 10 pg, 并且包括预增菌过程在内整个检测时间不 超过 18 h, 很符合当前食品快速检测的需要, 具有较 强的实用价值和应用前景, 值得在建立完善标准化 检测流程后进一步推广应用。 参考文献 1 孙秀兰, 张芳, 张银志. 多种致病菌同步检测方法的研究进展 J. 食品与生物技术学报, 2012, 31(5): 449455. Sun XL, Zhang F, Zhang YZ. Research advance study of the synchronous detection of multiplex foodborne pathogens J. J Food Sci Biotechnol, 2012, 31(5): 449455. 2 余倩, 黄梦娜. 食源性致病菌多重 PCR 快速检测研究进展J. 中国食品工业, 2013, (007): 7071. Yu Q, Huang MN. Research advance on the rapid detection of foodborne pathogens by multiplex PCR J. Food Beverage Ind, 2013, (007): 7071. 3 陈琼, 周昱, 孔繁德, 等. 多重 PCR 技术同时检测四种肠道致 病菌方法的建立与初步应用J. 食品安全质量检测学报, 2013, 4(4): 11161123. Chen Q, Zhou Y, Kong FD, et al. Establishment and primary application of multiplex polymerase chain reaction for synchronous detection of four food-borne pathogens J. J Food Safe Qual, 2013, 4(4): 11161123. 4 遇晓杰, 薛成玉, 吕琦, 等. 食品中 5 种致病菌多重 PCR 快速 检测技术的建立与应用J. 中国食品卫生杂志, 2009, 21(5): 398402. Yu XJ, Xue CY, Lv Q, et al. Construction and application of multiple PCR rapid detection for 5 pathogenic bacteria in food J. Chin J Food Hygiene, 2009, 21(5): 398402. 5 李荔枝, 杨欣, 胡萍. PCR 法检测原料乳中金黄色葡萄球菌 肠毒素 A 基因型J. 食品研究与开发, 2012, 33(9): 140143. Li LZ, Yang X, Hu P. Detection of SEA in raw milk by PCRJ. Food Res Dev, 2012, 33(9): 140143. 6 何晖, 刘华章, 魏泉德. PCR 技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素 A, B, C, E 基因的研究J. 中国卫生检验杂志, 2012, 22(7): 15851587. He H, Liu HZ, Wei QD. Research on detection of Staphylococcal enterotoxin A, B, C, E by PCR J. Chin J Health Lab Technol, 2012, 22(7): 15851587. 7 许会会, 雷连成, 谢芳, 等. 沙门氏菌PCR检测方法的建立J. 中国畜牧兽医, 2010, (4): 9497. Xu HH, Lei LC, Xie F, et al. Development of Polymerase Chain Methods for Salmonella J. China Animal Husbandry Vet Med, 2010, (4): 9497. 8 刘书花, 张瑞凌, 丁尚志, 等. 3 类食品中沙门氏菌 PCR 快速 检测方法的建立J. 现代农业科技, 2010, (23): 324325. Liu SH, Zhang RL, Ding SZ, et al. Establishment of PCR rapid method for detection of Salmonella in three kinds of food J. Mod Agri Sci Technol, 2010, (23): 324325. 9 许会会, 谢芳, 雷连成. 牛奶中志贺氏菌 PCR 检测方法的建 立J. 食品安全质量检测学报, 2010,1(1): 4348. Xu HH, Xie F, Lei LC. Development of detection method for shigella in milk by polymerase chain reaction J. J Food Safe Qual, 2010, 1(1): 4348. 10 李金磊, 狄元冉, 董鹏, 等. 饲料中志贺氏菌的 PCR 快速检测 方法的建立J. 上海畜牧兽医通讯, 2013, (6): 23. 第 9 期 蔡 军, 等: 二重 PCR 法快速检测 3 种食源性致病菌 2843 Li JL, Di YY, Dong P, et al. Development of rapid detection method for Shigella in feed by PCR J. Shanghai J Animal Husbandry Vet Med, 2013, (6): 23. 11 Edwards MC, Gibbs RA. Multiplex PCR-Advantages, development, and applications J. Genome Res, 1994, 3(4): S65S75. 12 Kawasaki SK, Kusano RA, et al.