国家重点基础研究发展计划（973计划）项目申报书-病毒致癌机制与干预的基础研究

项目名称：病毒致癌机制与干预的基础研究首席科学家：曾益新 中山大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部二、预期目标总体目标以鼻咽癌、食管癌为模型，结合临床与流行病学，鉴定致瘤DNA病毒EBV、HPV致瘤亚型；阐明致瘤病毒与环境危险因素及宿主易感遗传背景间的交互作用机制；阐明致瘤病毒感染上皮细胞以及诱导其转化的分子机制；发现诊断与治疗的新靶点，为提高病毒感染相关肿瘤的治愈率奠定基础，有望使鼻咽癌、食管癌成为继宫颈癌之后可预防的恶性肿瘤。同时在致瘤病毒感染与肿瘤发生发展的研究领域为我国培养一批优秀人才。 五年预期目标1 鉴定与鼻咽癌、食管癌相关致瘤病毒EBV、HPV亚型和变异体。建立致瘤病毒高效感染上皮细胞体外模型并阐明致瘤病毒亚型和变异体高效感染和诱导上皮细胞转化机制。2 阐明EBV、HPV与环境危险因素以及基因遗传变异交互作用机制，为人类认识肿瘤发生发展的分子机制、治疗和干预提供理论依据。3 从系统生物学角度阐明鼻咽癌、食管癌细胞内信号通路以及病毒激活导致肿瘤细胞裂解的分子机制，明确病毒感染与微环境相互作用机制，发现34个新靶点，为发展新的治疗手段奠定基础。4 利用创新的减毒活疫苗策略建构得到EBV疫苗株，为EBV免疫治疗开拓新方向。5 预计在SCI收录杂志发表论文80篇以上，其中IF5分以上论文超过40篇，争取在Cell Nature Science等顶尖杂志上发表高水平论文，申请专利10个。6 为我国在病毒感染相关恶性肿瘤研究领域培养一批高水平创新性人才，包括培养15-20名博士后等青年骨干人才，5060名博士生，50-60名硕士生，产生百篇优秀博士论文1-2篇。三、研究方案1）学术思路：本项目主要的学术思路是：在鼻咽癌、食管癌高发现场前瞻性流行病学研究的基础上，抓住鼻咽癌、食管癌为感染性相关恶性肿瘤的显著特点，鉴定诱导鼻咽癌、食管癌发生发展的病毒亚型，围绕病毒、环境危险因素、宿主易感遗传背景在感染和转化上皮细胞以及肿瘤的发生发展中的作用和分子机制进行系统研究。力争在鼻咽癌、食管癌的病因学、发病机制、早期干预上取得突破性进展，提出防治的新思路和新方法，使鼻咽癌、食管癌成为可早期预防的恶性肿瘤。本项目中，本团队主要通过鼻咽癌、食管癌相关的致瘤病毒亚型鉴定及致瘤病毒早期感染与转化上皮细胞的机制研究，明确高致瘤性病毒亚型与鼻咽癌和食管癌发病的关系和机制（研究内容一、四）；基于流行病学研究获得环境危险因素与结合高通量筛选技术筛选出易感基因，研究它们与病毒交互作用机制，更好地解决遗传学、环境、病毒与肿瘤发病之间的关系（研究内容二、三）；系统地阐明病毒在细胞内信号通路调控网络及病毒激活导致肿瘤细胞裂解的分子机制，为筛选出一些具有鼻咽癌、食管癌特异性的诊断与治疗新靶点指明了方向，引导针对新靶点的干预基础研究（研究内容五）。五个课题之间互相关联、互相影响，阐明致瘤病毒致癌机制，为鼻咽癌、食管癌这两种恶性肿瘤的早发现、早诊断、早干预提供实践基础和科学依据，并为提高其治愈率创造可能性。上述研究将推动EBV、HPV感染相关其他肿瘤的发病机制和干预研究，使人类在攻克恶性肿瘤的过程中向前迈进坚实的一步。总体的研究方案见下图：l EBV、HPV感染和转化上皮细胞的机制研究l EBV、环境危险因素、宿主易感遗传背景的协同致癌机制l HPV、环境危险因素、宿主易感遗传背景之间交互作用机制鼻咽癌和食管癌相关致瘤病毒致瘤机制及干预 鉴定鼻咽癌与食管癌相关致瘤病毒亚型和变异体 探索致瘤病毒、环境危险因素、宿主易感遗传背景间在肿瘤发生发展中的交互作用机制 阐明致瘤病毒感染和转化上皮细胞机制 揭示致瘤病毒在细胞内信号通路的调控网络及致瘤病毒激活和细胞裂解机制 发现新特异靶点以及针对靶点有效的干预方式 获得创新的EBV疫苗研发策略并建构得到EBV疫苗株l 食管癌相关HPV亚型及HPV16变异体分布与食管癌关系的分子流行病学研究l 鼻咽癌致瘤EBV亚型研究肿瘤病因 肿瘤发生发展 肿瘤靶向治疗基础l 致瘤病毒在细胞内信号通路调控网络研究l 致瘤病毒激活和细胞裂解的机制研究l 特异性靶点的发现及进行干预的基础研究l EBV疫苗研发新策略l2）技术途径： 本项目在总体目标的架构下分为5个主要的课题方向（见课题设置），各课题方向的主要技术途径总结如下： 课题一：以 PCR-测序技术为主，最终发展为高通量质谱测定方法，确定HPV亚型分布与食管癌相关关系；采用病毒全基因组深度测序技术，并发展 EBVgenome capture 的芯片测序技术，结合生物信息学分析，规模化地系统性筛选、鉴定高发区、高发人群鼻咽癌相关EBV亚型以及与食管癌相关HPV16型变异体。 课题二、三：利用用高密度 SNP 芯片筛查鼻咽癌、食管癌致病基因或位点，揭示在鼻咽癌、食管癌发生发展中起重要作用的遗传变异（CNV和SNP）；运用实时定量 RT-PCR（real -time RT-PCR）、免疫印迹蛋白定量（Western blot）以及免疫组织化学染色等方法，测定针对位于明确的基因编码区或调控区的 CNV（或SNP）所处基因或所调控基因在不同基因型个体的组织（包括靶组织）中的表达差异；用生物信息学方法分析编码 miRNA基因或区域的 CNV；定量分析正常食管或鼻咽组织中特定CNV和miRNA表达水平间的相关性；建立血清 miRNA检测方法并用有显著个体差异的 miRNA 进行大样本量的食管癌及鼻咽癌病例-对照研究，探讨以 miRNA作为食管癌及鼻咽癌预警或早期诊断生物标志的可能性；运用生物化学、分子生物学、转基因或基因沉默（knock-down）等手段揭示在关联研究中发现与食管癌及鼻咽癌密切相关但与肿瘤发生发展功能不清楚的的基因或 miRNA 与肿瘤相关的生物学作用；在全基因组关联研究（GWAS）获得大量的遗传变异信息以及流行病学研究获得的环境危险因素基础上，利用免疫缺陷鼠移植瘤系统确定这两者与 EBV、HPV 存在交互作用，通过平皿培养、三维Matrigel 培养、病毒载体转染以及 RNA 干扰等技术研究致瘤病毒、环境、遗传相互作用机制。 课题四：利用建立起 EBV高效感染鼻咽上皮细胞的体外模型，采用外源性转染、shRNA 沉默以及抗体封闭等方法，鉴定潜在上皮细胞 EBV 受体（gHgLR）；构建携带 GFP 标签的不同 EBV 亚型重组病毒，利用荧光标记跟踪技术观察 EBV感染上皮细胞过程；利用鼠疱疹病毒68（MHV-68）和致瘤疱疹病毒从头感染的动物模型，研究病毒颗粒从细胞质膜到细胞核膜转运的分子机制；通过自噬蛋白免疫、荧光跟踪、荧光定量PCR，研究自噬在EBV诱导细胞恶性转化过程中的作用；利用细胞转染技术以及已成熟的细胞内及体外转录翻译方法，揭示HPV57型、HPV16 型变异体致癌机制。 课题五：采用基因组芯片、MicroRNA芯片、DNA甲基化芯片、蛋白质组分析，研究 EBV 与鼻咽癌相关基因激活的信号通路与鼻咽癌变早期的表观遗传紊乱机制；利用信号传导途径芯片筛选，基因转染表达，改造表达基因质粒，siRNA沉默，蛋白定量测定蛋白生物化学活性的测定，以及细胞生物活性的测定，来分析研究 HPV E6 E7 对信号传导途径的作用，尤其是NF-kB，ERK、 Akt、STAT3、和Wnt等途径；在 EBV疫苗研发新策略研究中，利用细菌人工染色体基因突变的方法构建重组病毒，并利用全身发光成像技术来监测病毒在活物体内的感染并跟踪在一定时间内相同宿主体内的病毒感染。3）创新点与特色 1. 本项目以中国高发的常见恶性肿瘤鼻咽癌和食管癌为研究对象，阐明相关肿瘤的发病机制，发现预防、诊断和治疗新靶点，为提高病毒相关肿瘤的治愈率奠定基础。2. 以致瘤性DNA病毒为核心，从致瘤病毒、环境危险因素以及宿主遗传易感背景之间交互作用的角度，更全面、更系统地阐明鼻咽癌和食管癌发生发展的分子机制，并为发现诊断与治疗新靶点提供理论依据。3. 通过对不同地区、不同来源的EBV、HPV进行全序列测定，进行序列比较和功能分析，鉴定鼻咽癌、食管癌相关高致瘤性病毒亚型和变异体。4. 采用课题组建立的病毒高效感染上皮细胞的体外模型，阐明致瘤病毒感染上皮细胞机制。EBV感染上皮细胞的机制尚未得到阐明，本团队将在课题组特有的EBV高效感染的细胞模型基础上，筛选并鉴定介导EBV感染鼻咽上皮细胞的受体，阐明EBV感染上皮细胞的机制。目前文献中较少报道HPV感染食管上皮细胞机制，本团队将建立HPV感染食管上皮的三维模型并进一步研究其感染机制。5. 有关致瘤病毒感染与微环境相互作用的研究在国际上才刚刚展开，目前尚缺乏系统和深入的研究；结合本团队前期研究，本项目将明确鼻咽部微环境改变与鼻咽癌发生、EBV潜伏感染的可能关系；筛选鉴定EBV潜伏感染及鼻咽癌发生相关的细菌种群，为鼻咽癌的早期干预提供新线索。6. 本项目对EBV激活导致细胞裂解机制以及有关EBV免疫预防新策略进行研究，探索鼻咽癌治疗新方法。7. 技术方法创新：a. 首次运用高密度全基因组关联分析，并结合深度测序和计算生物学方法，利用鼻咽癌、食管癌高发现场的病源优势，对患者进行高通量筛查，发现鼻咽癌、食管癌易感基因。b. 建立适用于食管组织的高通量HPV测定技术平台，技术平台将同时具有高灵敏度与特异度。高通量与特异性相结合的方法建立对了解HPV感染规律、型别至关重要，也使得大样本横向与纵向调查成为可能。方法建立过程中所出现的问题与积累的经验对各部位HPV相关研究具有重要借鉴意义。c. 建立起的致瘤病毒高效感染上皮细胞体外三维模型，为将来深入研究提供平台。新ngfa 4）取得重大突破的可行性分析：1、科学假设上的可行性。本团队在国际上率先完成鼻咽癌相关EBV的全基因序列测定，发现了EBV-LMP1作用的新机制并提出了EBV LMP1介导的信号转导网络模式图；定位了鼻咽癌遗传易感基因、发现系列易患性基因。在食管癌研究方面，本团队的大型病例对照研究明确提示HPV感染是食管癌发生的危险因素。尤其重要的是在食管癌组织中不仅存在HPV DNA感染，同时存在HPV癌基因E6、E7的表达，提示HPV感染与食管癌变的直接联系；发现多个基因的多态性与食管癌的易患性有关，其中包括细胞死亡通路关键基因、炎症相关基因、DNA修复和细胞周期控制基因，并且证明与吸烟等环境因素存在交互作用。这些研究工作为本项目的深入研究打下坚实基础。2、资源上的可行性。本团队首先在广州、中山、四会三地建立了鼻咽癌高发现场，对广东省鼻咽癌高发区近10万人群进行长达15年的前瞻性研究，因此具有扎实的现场研究基础。本团队依托的华南肿瘤学国家重点实验设有专门的标本库，有专人管理和维护，临床资源丰富。在食管癌高发区河南安阳地区本团队建立随访现场，进行每两年一次的HPV感染与食管癌及其相关癌前病变进展的随访监测。截至目前，已完成第一个时间断面的基线人群问卷调查和生物学样本采集，基线调查样本量为8000余人，收集该人群各类生物样品4万多份。更重要的是，通过前期病例对照研究与队列研究的基线调研，本团队柯杨课题组与现场各级相关行政部门、当地群众建立了互相信任、互相支持的良好合作关系。3、技术上的可行性。本团队单位实验室具备充足的实验条件完成本项目，拥有系统的肿瘤发生发展相关的信号转导通路研究平台、蛋白质分析、蛋白质大规模纯化与复性技术平台；已建立完善的三维细胞培养平台、形成了技术可靠的分子遗传学、分子病毒学、细胞生物学、分子药理学实验技术平台；已建立了成熟的RNA干扰技术以及小鼠荷瘤动物实验模型；具有信号通路研究基础和技术平台；分子相互作用与新药筛选技术平台；生物信息学及结构模拟技术平台、组织芯片研究平台。4、人才上的可行性。本项目以曾益新院士牵头，课题负责人均是从事鼻咽癌、食管癌研究工作、活跃在鼻咽癌、食管癌研究工作的中青年学术带头人，对于鼻咽癌、食管癌的研究具有非常丰富的经验。学术骨干包含肿瘤病毒学、肿瘤分子遗传学、肿瘤细胞生物学和信号转导等研究领域第一线中青年学术主力军，体现了学科的交叉和有机融合。课题设置1) 课题设置的思路本研究项目从发现和鉴定与我国常见感染相关恶性肿瘤鼻咽癌与食管癌的致瘤病毒亚型出发，分别从环境危险因素、宿主易感遗传背景这两方面研究和相关致瘤病毒亚型的相互作用机制，并阐述致瘤病毒亚型感染和转化上皮细胞机制，以及揭示致瘤病毒在细胞内信号通路的调控网络及致瘤病毒激活和细胞裂解机制，在上述基础上发现诊断和治疗新靶点进行干预的基础研究，为提高致瘤病毒相关肿瘤的治愈率、降低发病率奠定基础。课题的设置围绕这一学术思路展开，分为5个分课题：（1）鼻咽癌与食管癌相关致瘤病毒亚型和变异体研究；（2）EBV、环境和遗传的交互作用在鼻咽癌发病中的研究；（3）HPV、环境和遗传的交互作用在食管癌发病中的研究；（4）致瘤病毒感染和转化上皮细胞的机制研究；（5）致瘤病毒及细胞内信号通路靶向治疗的基础研究。课题的设置主要考虑当前肿瘤领域的研究重点和发展趋势，并结合我国常见恶性肿瘤诊治水平提高的需要。所设置的5个分课题从不同角度研究致瘤病毒与肿瘤发生发展的关系。课题一将全面识别、筛选和鉴定鼻咽癌与食管癌相关EBV、HPV亚型。课题二与课题三将探索致瘤病毒EBV和HPV、环境以及宿主遗传因素的交互作用，阐明鼻咽癌、食管癌发病机制。课题四将阐述致瘤病毒感染正常上皮细胞的途径、受体及其协助因子，以阐明其感染机制，及其感染细胞后，诱导细胞恶性转化机制以及与微环境相互作用机制。课题五将进行致瘤病毒及细胞内信号通路靶向治疗的基础研究。本团队长期从事肿瘤及病毒的研究，并已取得一系列重要的研究成果，具有极大可能在致瘤病毒相关恶性肿瘤的研究领域取得突破性进展。2) 各课题研究内容及其与项目预期目标的关系本项目共设五个课题，各课题间息息相关，形成了一个有机的网络。课题一鉴定与鼻咽癌、食管癌相关致瘤病毒亚型和变异体与课题四研究致瘤病毒感染与转化上皮细胞以及病毒感染与微环境相互作用的机制，为阐明致瘤病毒的致瘤机制奠定基础；课题二和三从致瘤病毒、环境、宿主遗传背景交互作用的角度研究在鼻咽癌、食管癌发生发展中的机制；课题五从致瘤病毒在细胞内信号调控网络、病毒激活导致细胞裂解机制等方面揭示致瘤病毒致瘤机制，以及基于机制研究基础上发现新靶点并进一步针对新靶点的进行干预基础研究。总体说来本团队在这样一个不断探索的过程中获得的研究成果和发现，将为解决本项目的科学问题，为以后临床转化奠定基础。五个课题是预期目标的有机组成部分，其相互关系如下图所示：课题五：致瘤病毒致癌机制课题一：致瘤病毒亚型及变异体鉴定课题四：致瘤病毒感染和转化上皮细胞机制课题二、三：致瘤病毒、环境因素、宿主遗传背景交互作用机制细胞内信号通路、病毒激活导致细胞裂解机制研究靶点发现及干预的基础研究课题一：食管癌与鼻咽癌相关致瘤病毒亚型和变异体研究1. 研究内容：1) HPV亚型分布与食管癌关系的分子流行病学研究在食管癌高发人群（河南安阳地区）建立以HPV感染与病理检测为主的前瞻性队列，研究人食管HPV各亚型自然感染率、传播途径、感染消长规律、感染型别特点以及作为环境因素与食管癌发生发展间关联。工作分为现场与实验室两部分。现场工作采用经典的流行病学队列研究方法进行设计与实施。实验室主要以样本的HPV PCR-测序技术为主，最终发展为高通量质谱测定方法。2) HPV16型变异体的分析及与食管癌发生发展的关系为了进一步鉴定课题组前期发现的HPV16型亚洲变异体型突变在食管癌发病中的作用，本课题拟进行以下研究：（1） HPV16型亚洲变异体突变的序列分析：通过病毒全基因组测序，对比国际标准序列发现亚洲型变异体连锁存突变体，并鉴定可能引起病毒功能变化的氨基酸改变。（2） HPV16型亚洲变异体的人群分布:研究上述变异体在中国不同地区人群、食管癌病例和对照样品中的分布特征。（3） 利用已建成的食管癌高发人群的队列中比较亚洲变异体突变的感染及持续感染与其他HPV16型感染的差异，以及亚洲变异体突变与食管粘膜病变的相关性，探讨其致癌潜能。3) 鼻咽癌致病EBV亚型分析（1） 在已测定广东鼻咽癌病人的EBV（GD1，Genebank No AY961628）序列的基础上，通过国际EBV基因组协作组的合作，拟对多株（50株）来源于不同地区、不同人群的EBV进行全序列测序，分析疾病相关的EBV序列特征，筛选和鉴定鼻咽癌相关的EBV亚型。（2） 筛选和鉴定高发区、高发人群鼻咽癌相关EBV亚型的分布，探讨特异性EBV亚型的检查对早期鼻咽癌筛查的意义。2研究目标：1）确定与食管癌和鼻咽癌相关的病毒亚型及变异体2）确定上述病毒亚型和变异体在肿瘤和正常人群的分布经费比例： 23.3% 承担单位： 北京市肿瘤防治研究所、中山大学、广西医科大学、中南大学 课题负责人： 柯杨 学术骨干： 黄光武、李大疆、陶永光、蔡红课题二：环境、EBV和遗传的交互作用在鼻咽癌发病中的研究1研究内容：1) 全基因组遗传变异与鼻咽癌易患性的研究（1） 全基因组关联研究（GWAS）拟用来自高发区有确切EBV感染情况的癌症病人和正常对照外周血淋巴细胞DNA，用高密度SNP芯片筛查鼻咽癌致病基因或位点，以揭示在鼻咽癌发生发展中起重要作用的遗传变异（CNV和SNP）。（2） 在GWAS研究的基础上，探索EBV与环境危险因素及宿主遗传变异在鼻咽癌发病中的交互作用a. EBV亚型与宿主的遗传变异：在GWAS研究取得的大量全基因组遗传变异的基因组信息的基础上，研究与各种EBV亚型感染相关的宿主遗传变异，寻找遗传-EBV交互作用的证据；b. EBV在体内的“再激活”与宿主遗传变异：EBV在体内的频繁激活使得个体患鼻咽癌的风险数十倍的增加，研究个体的遗传变异与EBV在体内的频繁激活相关性，探讨病毒激活的可能遗传背景。c. 遗传-环境因素的交互作用：研究高发区的环境危险因素（微量元素、吸烟以及其它致癌因素）与遗传变异在鼻咽癌发病中的交互作用。2) EBV与宿主基因多态性协同致癌作用的生物学机制的探讨利用上述研究得到的宿主基因多态性，进行以下与EBV协同致癌作用的研究：a. EBV与宿主基因多态性在鼻咽正常上皮细胞转化及动物成瘤过程中存在相互作用的研究；b. 探讨宿主基因多态性对病毒感染正常上皮细胞的影响及其机制；c. 探索宿主基因多态性与病毒重要功能基因及信号通路的交互作用及机制3) EBV对环境危险因素致癌协同作用的研究从流行病学研究获得的环境危险因素，本课题进一步探讨环境危险因素对EBV致癌协同作用：a. EBV与环境危险因素在鼻咽正常上皮细胞转化及动物成瘤过程中存在相互作用的研究；b. 探索环境危险因素对EBV感染正常鼻咽上皮细胞的影响及其作用的分子机制；c. 通过对环境激活物作用于EBV阳性细胞的体外研究，进行环境因素对细胞EBV复制，在体内状态改变等激活作用的细胞生物学的验证；d. 探索环境因素对EBV重要功能基因以及相关信号通路的作用及机制；e. 环境危险因素所导致的EBV表观遗传学变化的研究。大型流行病学研究将提供基因-环境-EBV交互作用的相关重要参数，为鼻咽癌的干预和公共卫生学政策的制定提供依据：在课题组已经开展的迄今为止鼻咽癌研究领域最大的两项流行病学项目-基于人群的病例-对照研究（NIH资助项目）以及高发区前瞻性队列研究（国家十一五支撑计划）的两项大型的基础上，按照流行病学严格的采样原则下，提供一系列基因-环境-EBV交互作用的相关重要参数。2研究目标：1）相关蛋白表达谱关在全基因组范围确定与鼻咽癌遗传易患性以及发生发展密切相关的遗传变异包括拷贝数变异（CNV）和单核苷酸多态（SNP），并阐明其与高发区环境及EBV的交互作用；2）从感染与转化鼻咽正常上皮细胞、EBV体内的激活、EBV重要功能基因及相关通路、表观遗传学改变等角度，阐明EBV与环境危险相互作用在鼻咽癌发病中的重要机制。经费比例： 20.2% 承担单位： 中山大学、山东省医学科学院、北京市肿瘤防治研究所 课题负责人： 曾益新 学术骨干： 李胜、贝锦新、何忠虎课题三： HPV、环境和遗传的交互作用在食管癌发病中的研究1研究内容：1) 全基因组遗传变异与食管癌易患性的研究（1） 全基因组筛查与食管癌相关的拷贝数变异和单核苷酸多态拟用来自高发区有确切HPV感染情况的癌症病人和正常对照外周血淋巴细胞DNA，用高密度SNP芯片筛查食管癌或鼻咽癌致病基因或位点，以揭示在食管癌发生发展中起重要作用的遗传变异（CNV和SNP）。（2） 遗传变异与食管癌易患性的关联研究这部分研究的目的是验证并确定与食管癌易患性相关的CNV和SNP，以及CNV和SNP与环境因素的交互作用，为阐明食管癌的发病机制、建立可预测发生风险和早期诊断的标志提供依据。拟进行大样本量病例-对照分子流行病学研究，针对前一项全基因组检测获得的CNV和SNP进行关联分析，以确定致病基因或位点。（3） 食管癌相关CNV和SNP的生物学功能研究发现与食管癌易患性相关的遗传变异是本课题的主要目标，但阐明其作用机制是本课题的研究重点。本课题将挑选在关联研究中发现的重要CNV和SNP进行以下三部分生物学功能研究。a 对特定基因表达的影响：这部分研究主要针对位于明确的基因编码区或调控区的CNV（或SNP），运用实时定量RT-PCR（real-time RT-PCR）、免疫印迹蛋白定量（Western blot）以及免疫组织化学染色等方法，测定所处基因或所调控基因在不同基因型个体的组织（包括靶组织）中的表达差异。对拷贝数增多但表达没有显著增高的基因，拟研究其表达调控机制如启动子区甲基化、mRNA降解等因素，以阐明该CNV对特定基因表达有作用抑或只是无功能的遗传标志。b 对特定microRNA表达的作用：microRNA（miRNA）既有癌基因又有抑癌基因的作用，因此与肿瘤的关系备受关注。尽管miRNA表达异常的机制尚不完全清楚，但各种基因组结构异常都可能影响miRNA的表达，CNV可能是miRNA表达差异的重要机制。这部分功能研究主要针对位于非编码区的CNV。我们拟用生物信息学方法分析编码miRNA基因或区域的CNV；定量分析正常食管或鼻咽组织中特定CNV和miRNA表达水平间的相关性；建立血清miRNA检测方法并用有显著个体差异的miRNA进行大样本量的食管癌及鼻咽癌病例-对照研究，探讨以miRNA作为食管癌及鼻咽癌预警或早期诊断生物标志的可能性。c 相关基因的生物学功能探讨：这部分研究主要探讨具有CNV（或SNP）的基因或miRNA对食管癌及鼻咽癌易患性以及发生发展的生物学作用。我们将着重探讨在关联研究中发现与食管癌及鼻咽癌密切相关但与肿瘤发生发展功能不清楚的的基因或miRNA，运用生物化学、分子生物学、转基因或基因敲降（knock-down）等手段，探讨其与肿瘤相关的生物学作用。2) HPV与宿主基因多态性协同致癌作用的研究利用上述研究得到的宿主基因多态性，进行以下与HPV协同致癌作用的研究：（1） HPV与宿主基因多态性在鼻咽、食管正常上皮细胞转化及动物成瘤过程中存在相 互作用的研究；（2） 探讨宿主基因多态性对病毒感染正常上皮细胞的影响及其机制；（3） 探索宿主基因多态性与病毒重要功能基因及信号通路的交互作用及机制。2研究目标：1）相关蛋白表达谱关在全基因组范围确定与食管癌遗传易患性以及发生发展密切相关的遗传变异包括拷贝数变异（CNV）和单核苷酸多态（SNP）；2）阐明病毒感染的相互作用及其在食管癌发生中的机理，为建立食管癌预警、早期诊断和治疗靶点提供基础。经费比例： 16.7% 承担单位： 中国医学科学院、北京市肿瘤防治研究所、中山大学 课题负责人： 谭文 学术骨干： 林东昕、于典科、贾卫华、朱军 课题四：致瘤病毒感染和转化上皮细胞的机制研究1. 研究内容：1) EBV感染鼻咽上皮细胞途径及机制（1） 基于前期的研究工作，本课题已经建立起EBV高效感染鼻咽上皮细胞的体外模型，利用此模型本课题将进一步鉴定介导EBV感染鼻咽上皮细胞受体，并采用外源性转染、shRNA沉默以及抗体封闭等方法，鉴定潜在上皮细胞EBV受体（gHgLR）。并阐明gHgLR在EBV直接感染、以及通过B细胞间接感染鼻咽上皮细胞中的作用。（2） 构建携带GFP标签的不同EBV亚型重组病毒，对这些病毒的感染和转化鼻咽上皮细胞的特性进行研究，以阐明鼻咽癌相关EBV亚型与一般EBV相比对鼻咽上皮细胞更加高效的感染和转化能力机制。（3） 本课题利用鼠疱疹病毒68（MHV-68）来研究病毒颗粒从细胞质膜到细胞核膜转运的分子机制。MHV-68属于致瘤疱疹病毒，与EBV在基因组序列上具有较高的同源性，体外培养可以获得高滴度的病毒，而且可以感染各种品系的实验室小鼠，便于建立致瘤疱疹病毒从头感染的动物模型。在从头感染过程中，疱疹病毒囊膜与细胞质膜融合，病毒颗粒进入细胞质并转运到细胞核膜附近，通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内，建立感染。本课题将鉴定在MHV-68从头感染过程中参与病毒颗粒从细胞质膜到细胞核膜转运的病毒 粒子蛋白和宿主细胞蛋白；建立参与病毒颗粒从细胞质膜到细胞核膜转运的蛋白质相互作用网络；构建突变病毒并利用过表达或shRNA敲低等技术，研究病毒颗粒从细胞质膜到细胞核膜转运的机制2) EBV感染与微环境相互作用机制病毒感染通过宿主微环境影响肿瘤细胞的生物学特性，对病毒感染与肿瘤微环境的相互作用的分子机制研究将为肿瘤的诊断和治疗提供新途径。本课题拟探索EBV感染在鼻咽癌发生发展中的分子机制及与微环境的相互作用的分子机制，建立正常鼻咽组织和鼻咽癌的蛋白表达谱，筛选差异表达蛋白；运用三维细胞培养模型研究差异蛋白及其相互作用蛋白在EBV引起的鼻咽癌发生和发展过程中的作用及与微环境相互作用的分子机制，进而确定出一批具有靶点意义的蛋白质。3) EBV相关基因调控自噬促进鼻咽癌发生发展及其分子机制（1） EBV早期基因BHRF1（Bcl-2的病毒性同源基因）、EBV潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2 A)基因等对细胞自噬的影响及分子机制。（2） EBV相关基因抑制自噬对自体免疫影响，促进其潜伏感染，阻断其自噬抑制作用能促进对EBV的清除研究。（3） EBV相关基因抑制自噬，促进基因组不稳定性和非整倍体的形成，从而促进肿瘤的发生发展及其分子机制。4) HPV57型、HPV16型变异体诱导细胞转化功能的研究（1） 利用细胞转染技术，鉴定HPV16型亚洲变异体突变的E6、E7对细胞增殖及转化作用。（2） 利用已成熟的细胞内及体外转录翻译方法，鉴定突变的HPV16型E6对抑癌蛋白p53的降解作用、及对p53活性的抑制作用。（3） 利用细胞转染技术，鉴定HPV57型的E6、E7对细胞增殖及转化的作用。（4） 试建立食管上皮细胞系或原代培养模型，鉴定HPV57型病毒对食管上皮的转化作用。（5） 用已成熟的细胞内及体外转录翻译方法，鉴定HPV57型E6对宿主抑癌蛋白p53、E7对抑癌蛋白pRb功能的阻断作用。（6） 通过定量PCR以及测序分析食管癌中HPV57型的病毒载量、整合状态与食管癌变的相关性。2. 研究目标：1） 利用建立好的EBV高效感染正常上皮细胞模型，阐明EBV感染鼻咽上皮细胞的时机和机制；阐明鼠疱疹病毒68在从头感染过程中由细胞质膜转运到细胞核膜的分子机制，为研究EBV感染上皮细胞的详细途径打下坚实基础。2） 解析EBV与微环境相互作用的分子机制及发展潜在的靶点蛋白，为鼻咽癌的早期干预和治疗方式提供新线索。3） 阐明EBV相关基因通过对自噬调控影响其潜伏感染及基因组稳定性，从而促进鼻咽癌发生发展的分子机制，为鼻咽癌的预防和治疗提供理论依据和实验基础。探讨HPV57型、HPV16型变异体致癌机制经费比例： 16.3% 承担单位： 中山大学、广西医科大学、北京市肿瘤防治研究所 课题负责人： 曾木圣 学术骨干： 朱孝峰、陶然、张哲、陈克能 课题五：致瘤病毒及细胞内信号通路靶向治疗的基础研究1研究内容：1） EBV感染和信号通路及干预研究致瘤EBV主要通过编码的致瘤蛋白异常激活宿主细胞内信号网络参与细胞癌变的发生发展。EBV感染与表观遗传学改变在鼻咽癌变早期就发挥关键作用，Epigenetic Chemoprevention to Cancer 的概念，为基于肿瘤表观遗传的干预与治疗指明了方向。因此从信号通路与表观遗传的角度研究靶向病毒及肿瘤信号通路和网络干预的机制研究，将为肿瘤靶向治疗和预防提供新思路。本课题利用课题组在肿瘤信号转导研究领域的优势，以EBV编码的致瘤蛋白LMP1激活的信号网络中关键蛋白激酶导致DNMT1激活为切入点，从转录调控的角度，阐明天然产物化学小分子grifolin靶向干预EBV LMP1激活的蛋白激酶MAPK的分子机制，并选用三种在鼻咽癌中呈高频甲基化失活的基因PCDH10、DAPK1、UCHL1为代表,逆转因DNMT高活性造成的CIMP，恢复相关基因表达及功能，这将为在鼻咽癌变中提供靶向干预策略的可行性及应用前景的实验依据。2） EBV激活与细胞裂解的分子机制研究表明，诱导EBV裂解感染是一种治疗鼻咽癌等EBV阳性肿瘤的有效方法。本课题拟应用传统化疗药物和药用植物提取物或免疫疗法（immunotherapy）等方法诱导EBV裂解感染，同时应用活细胞检测不同处理是否能够特异性诱导含EBV的细胞死亡增加；通过检测EBV立即早期蛋白BZLF1和BRLF1的启动子的激活及参与的信号通路，阐明诱导产生EBV裂解的分子机理；利用小鼠模型在体内研究诱导EBV裂解感染能否减缓或抑制鼻咽癌的生长。这将从病毒自身机理角度为致瘤病毒的靶向治疗提供重要的实验依据。3） EBV疫苗研发新策略研究本课题拟首先利用细菌人工染色体从AC-RTA基因组上删除5个免疫逃逸基因（ORF10,ORF11,ORF36,ORF54和K3），构建重组病毒DIL(deletion of immune evasion genes and latency)。通过检测在不同器官或组织内的病毒滴度和基因拷贝数来测试DIL病毒作为疫苗的保护效果，并利用小动物活体成像技术来监测和实时跟踪病毒在小鼠体内不同时间点的感染。之后利用酶联免疫吸附和中和实验来测定病毒特异性抗体的滴度，利用活体成像技术来检测这些病毒特异性的抗体或T细胞是否可以提供保护，评估DIL病毒作为疫苗的效果。4） HPV感染和信号通路及干预食管鳞癌的发生与HPV的感染密切相关。本课题研究在食管癌癌变过程中HPV编码的 E6 E7早期病毒癌基因激活的细胞信号通路，进一步阐明其生物学作用和分子机制。以NF-kB 信号通路为核心，主要研究HPV E6 E7对其上游蛋白TNFR, IKK, TRAF6, CYLD等相关信号途径中的调节分子的作用；及与STAT3, Wnt等信号通路的交叉作用。这将从信号转导的角度阐明HPV E6 E7病毒蛋白在食管癌中的致癌机制， 为食管癌的化学小分子阻断和干预提供重要的实验依据。2研究目标：1） 确定病毒致瘤蛋白异常激活的信号通路，筛选出关键的信号靶分子及阐明干预的作用机制。2） 阐明病毒自身复制导致肿瘤细胞裂解的分子机制及靶向治疗。3） 开发出创新的EBV疫苗策略，为EBV的免疫治疗引领新方向。为致瘤病毒及宿主细胞内信号通路靶向治疗提供重要的实验依据。经费比例： 23.5% 承担单位： 中南大学、中国农业大学、上海交通大学、中山大学、浙江大学 课题负责人： 曹亚 学术骨干： 封文海、吴婷婷、邓炯、刘强、孙雪青四、年度计划2011.1-2011.12研究内容：1） 进行EBV全基因组序列分析，以鉴定致瘤病毒亚型；2） 在食管癌高发人群（河南安阳地区）建立以HPV感染与病理检测为主的前瞻性队列，研究食管 HPV 各亚型自然感染率、传播途径、感染消长规律、感染型别特点以及与食管癌发生发展间关联；3） HPV16型全基因组序列测定，鉴定HPV16 变异体及其核苷酸多态性；4） 食管癌的全基因组关联研究（GWAS），筛选食管癌致病基因或位点；5） 进行EBV和HPV感染和致癌机制的研究。预期目标：1） 完成EBV全基因组序列分析的前期准备，收集多株来源于不同地区（东南亚、北非等）、不同人群（中国南方人、爱斯基摩人等）的EBV以及收集不同地区、不同人群的来源的鼻咽癌患者和健康对照的鼻咽拭子（患者包括组织）、唾液等标本，提取DNA样品；初步建立全基因组测序平台；2） 在食管癌高发人群（河南安阳地区）建立以HPV感染与病理检测为主的前瞻性队列，并获得初步的数据；3） 完成多个地区HPV16型全基因组序列测定，确定中国HPV16变异体和全基因组核苷酸多态特征；4） 完成食管癌全基因关联研究前期标本的收集，来自高发区有确切 HPV 感染情况的癌症病人和正常对照外周血淋巴细胞DNA；5） 鉴定介导EBV感染鼻咽上皮细胞的糖蛋白；6） 优化鼻咽癌三维培养模型与建立并获得HPV16 E6、E7不同表达状态食管癌细胞系，比较细胞系；7） 发表SCI论文5-10篇，申请专利2-3个。2012.1-2012.12研究内容：1） EBV全基因组序列分析，鉴定致瘤病毒亚型；2） HPV16型变异体与食管癌相关性研究；3） 食管癌的全基因组关联研究（GWAS），筛选食管癌致病基因或位点；4） 进行EBV和HPV感染和致癌机制的研究。预期目标：1） 鉴定与鼻咽癌相关的EBV亚型及其序列的变异特征；2） 测定食管癌组织中HPV感染及HPV16的变异体、核苷酸多态性，初步获得HPV16型变异体与食管癌相关性数据；3） 完成全基因组关联研究（GWAS），确定与食管癌遗传易患性以及发生发展密切相关的遗传变异包括拷贝数变异（CNV）和单核苷酸多态（SNP）；4） 筛选EBV感染上皮细胞的潜在受体；5） 确定EBV相关基因参与的信号途径以及诱导EBV裂解性复制的信号途径；6） 发表SCI论文20-25篇，申请专利2-3个。2013.1-2013.12研究内容：1） 进行致病性亚型分布的研究，筛选高风险人群