凝胶柱sephadexLH-20使用.docVIP

1 Sephadex LH20是一种价钱较高的填料，使用请千万注意，很贵的哟！（当然，老板有钱就另当别论拉）2 先讲Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。3 再讲Sephadex LH20 洗脱溶剂。听我讲完 第2点后，其实就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。正相系统以氯仿甲醇最为常见，先用50氯仿甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇水），样品用最少体积的甲醇水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿甲醇），样品用最少体积的氯仿甲醇溶解，过滤后，湿法上样。5 分离的技巧，最后说说我的使用心得：（1） 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。（3） 馏分一定要接的细，可110，或120个保留体积接成一馏分。（4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质（6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。（1）新购凝胶需要充分溶胀A 可选用醇试剂（这样在换洗脱剂的时候不会产生气泡）；B 溶胀时要不时搅拌，但速度不要过快，否则可能会破坏凝胶的网状结构；C 溶胀所用溶剂的量，以湿润凝胶体积占总体积的1/32/3为宜；D 室温溶胀过夜，可在晚上离开实验室时，再次充分搅拌，以保证其溶胀充分；E 1 g凝胶溶胀后体积变为4.04.5 mL。（2）新购凝胶溶胀后，最好抽滤洗涤一下A 新购凝胶中可能会含有一些工业试剂，最好在装柱以前进行洗涤；B 洗涤方法：溶胀后的凝胶悬浮液进行抽滤，除尽其中的溶剂，再用醇洗涤几遍后，重新溶胀。（3）凝胶悬浮液黏度要适宜A 太稠会在搅拌时产生气泡；太稀会导致装柱时沉降时间长，加凝胶悬浮液的次数增加；B 将凝胶悬浮液静止后所得上清液弃去，保留高于凝胶液面约1 cm的液体即可；C 装柱混悬液的浓度以流动性好，搅拌阻力小为宜。（4）柱子下面棉花的松紧要适宜A 色谱柱下端需要加棉花，以防止凝胶被冲出；B 在活塞上的细口处塞上棉花即可。可用玻璃棒将一小团棉花压入细口处，再用较尖锐的物体（尖头的吸量管）将棉花压实；C 可在色谱柱中加入少量溶液以检测棉花的松紧，以液体不成线，24 s/d为宜。（5）装柱的要点A 装柱前，先在色谱柱中加入约1/4柱高的液体（溶胀时所用的试剂）；B 装柱时，将下端活塞打开，流速尽量大，但要保证小于凝胶沉降速度，否则会干柱；C 将凝胶悬浮液搅拌均匀，以漏斗倒入柱子中即可；D 柱床长度以比色谱柱短1520 cm为宜，否则换洗脱剂（如氯仿）时，凝胶柱体积会继续膨胀，影响加样；E 若一次倒入的凝胶沉降后，高度低于理想高度，则可将上清液吸出，再次加入凝胶悬浮液，用玻璃棒略搅拌一下即可（这次不要加太满，否则没办法放玻璃棒的）；F 最好使凝胶沉降的最终高度高于预计12 cm，因为在平衡时，柱子会进一步压紧；G 待凝胶沉降高度达到理想值后，加洗脱剂平衡柱子。最好用储液球，这样可以通过压力进一步压实柱子；（6）上样的要点A 样品尽量用大浓度的醇溶解，因为凝胶一般要求洗脱剂和溶解样品的溶剂一致，而水的粘度较大，洗脱时会影响分离效果；B 用溶解样品的溶剂平衡柱子，一般要3个柱体积以上；C 上样液体积越小越好，柱体积的15%（质量分数）为宜，但不能太浓；D 上样液一定要过滤，否则容易污染凝胶（只能把柱头的凝胶挖出来丢掉，想想吧，1 g就是24块钱啊！全是money啊）；E 上样液过滤最好用那种小小的玻璃抽滤漏斗，下面用鸡心瓶接着。这样沉淀容易回收，鸡心瓶容易洗涤；F 上样时，要用长滴管，垂直伸到柱床上1 cm处，绕柱内壁加入，这样才能使上样液分布均匀，样品层呈环；G 长滴管不要吸满液体，否则容易滴到柱内壁上；H 上样时，柱子下端的活塞可开可关，如果开着，流速不能太快，否则容易干柱；I 上样完毕后，可用少量洗脱剂洗涤鸡心瓶和色谱柱内壁；J 待上述液体均进入柱床后，加洗脱剂，开始洗脱。（7）洗脱的要点A 样品分散的时候，流速一定要慢，像201400 mm的柱子，分散速度应在20 s/d左右；B 看色带还有约20 cm就要下来时，就开始接流份；C 每份流份的要依据色谱柱体积而定