大豆铁蛋白基因的分离和转化研究-硕士论文

分类号 河南农业大学硕士学位论文 论文题目：大豆铁蛋白基因的分离和转化研究 密级 英文题目：S t u d yo nI s o l a t i o na n dT r a n s f o r m a t i o n o fS o y b e a nF e r r i t i nG e n e 学位申请人：崔瑞洁 导 专 师：席章营副教授 谢传晓副研究员 业：作物遗传育种 论文提交 日期： 学位授予 日期 |IIllI I r i l lI IIFrI l l l ! l l I Irill Y 1 7 2 8 7 9 4 i i I l l 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 学位 文题目 大豆铁蛋白基因的分离和转化研究硕士 级别 学生学科 导师席章营副教授 姓名 崔瑞洁作物遗传育种 专业姓名谢传晓副研究员 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月日 一警够杰翩躲枇 日期：扣年月i , t 日 日期：砌年石码，弘白 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。，影蔷誓：7 研究生签名：维描协导师签名：琵形，学院领导霉鬟乃未喜7 日期如知年彭月彤日日期：y 辟么月归日期：硼肛6 月劢。 致谢 三年前，我有幸被席章营副教授收为他的硕士研究生，将我带入了科研殿堂。席老师高 尚正直的品格，严谨的治学态度，渊博的知识和为发展玉米事业无私奉献的精神时刻影响着 我。感谢席老师在我遇到挫折时给予的热情鼓励、信任支持；生活上无微不至的关心；学业 上的严格要求。在此致上最诚挚的感谢! 两年前的金秋时节，我怀着无比兴奋的心情来到中国农业科学院作物科学院所玉米研究 中心试验室开始了我的硕士论文研究，有幸认识了谢传晓副研究员。本研究正是谢传晓副研 究员的悉心指导下完成的，从论文选题、试验设计、实施到撰写和修改，都倾注了导师的大 量心血和辛勤劳动，在此谨向尊敬的导师致以衷心的感谢! 感谢在生活上的关怀以及在学习 上严格的要求和谆谆的教诲，特别在论文的设计、实施和撰写方面进行了具体的指导。导师 严谨求实的治学作风，渊博的知识、周密的思维能力，开拓创新的胆识，执着的敬业精神将 永远铭记在我心中。 在试验过程中，还得到了中国农业科学院玉米研究中心的张世煌、李新海、郝转芳、翁 建峰等老师的帮助，在此表示感谢! 感谢河南省农业科学院铁双贵研究院的热心指导，感谢 河南农业大学农学院胡彦民老师的悉心指导；导师组陈彦惠、李玉玲、吴建宇、刘宗华、汤 继华、崔党群等教授的支持和帮助。感谢师兄王帮太硕士、师姐史利玉在试验给予的指导、 鼓励和生活上给予的帮助。感谢试验室的赵刚、韩凯、雍红军、陈亮、李亮、刘志鹏等的帮 助；感谢白杨、梁芳、石慧芳等在河南农业大学期间，学习和生活中给予我的帮助。 感谢父母和亲人作我坚强的后盾，多年来，父母含辛茹苦地栽培我，始终如一地理解和 支持我的学业，在此致以最衷心的感谢! 在此衷心感谢所有关心和帮助我的人! 崔瑞洁 2 0 1 0 年5 月于郑州 目录 摘要1 第一章文献综述2 l 铁蛋白的研究概况2 1 1 铁的生理功能和吸收机制2 1 2 铁蛋白的研究现状3 2 启动子概述5 2 1 启动子的定义及结构特点5 2 2 启动子的类型5 2 3 胚乳特异启动子。6 3 农杆菌介导的遗传转化7 3 1 植物遗传转化方法7 3 2 农杆菌介导的遗传转化原理8 3 3 农杆菌介导的玉米遗传转化的影响因素：9 第二章Z e i n 启动子的分离及表达载体构建10 l 材料与方法1 0 i 1 试验材料l0 1 2 试验方法10 2 结果与分析l5 2 1Z e i n 启动子片段P C R 扩增l5 2 2 重组子菌液P C R 检测：l5 2 3 序列分析15 2 4 重组载体p B ll21 - Z e i n G U S 的P C R 检测l7 2 5p B l l 2 1 一Z e i n - G U S 载体的双酶切验证：1 8 3 小结与讨论1 8 第三章大豆铁蛋白基N ( F e r r i t i n ) 全长c D N A 分离及表达载体的构建2 0 1 材料与方法2 0 1 1 试验材料2 0 1 2 试验方法2 0 I 第四 2 结果与分析3 8 2 1 转化后的农杆菌P C R 检测3 8 2 2 玉米胚性愈伤组织培养3 8 2 3 转基因植株的筛选3 9 2 4 转基因植株的分化和再生3 9 2 5 转基因植株的P C R 检测。j 3 9 3 讨论4 0 附录：4 1 参考文献4 5 AB S T R A C T 5 2 I I 摘要 铁蛋白是广泛存在于生物体中的一种长期贮藏铁的蛋白，调节铁的吸收和释放，是植物 贮藏铁的主要形式。大豆是含铁量高的植物，其内大约9 0 的铁以铁蛋白的形式存在。研 究发现大豆铁蛋白中铁的吸收利用率和F e S 0 4 基本相当。本研究使用农杆菌介导的转化方法 将大豆铁蛋白F e r r i t i n 基因转入玉米，期望在玉米胚乳特异表达基因1 5k D I - Z e i n 启动子的 驱动下，特异表达，以提高籽粒中微量元素铁的含量，为强化玉米营养品质，解决以玉米为 主食人群的缺铁问题提供帮助。主要结果如下： 1 从玉米自交系鲁2 5 4 8 分离获得胚乳特异表达基因1 5k Df 3 - Z e i n 的启动子序列，并构建 了表达载体p B l l 2 1 Z e i n G U S 。 2 从大豆品种9 5 5 8 8 3 克隆并获得大豆铁蛋白F e r r i t i n 基因的c D N A 序列，全长7 5 3b p ， 包含2 5 1 个氨基酸残基，构建植物表达载体p B l l 2 1 3 5 s F e r r i t i n ，p C U b i l 3 9 0 - F e r r i t i n ， p B l l 2 1 一Z e i n F e r r i t i n ，p C U b i l 3 9 0 - F e r r i t i n - E p s p s 。 3 诱导玉米自交系R 1 8 5 9 9 和齐3 1 9 的胚性愈伤组织，为遗传转化提供受体材料。利用 三亲交配法将重组载体p C U b i l 3 9 0 F e r r i t i n ，p B l l 2 1 Z e i n F e r r i t i n 导入农杆菌L B A 4 4 0 4 ，通 过农杆菌介导法将表达载体转入玉米自交系R 18 - 5 9 9 和齐31 9 的胚性愈伤组织，得到转基因 植株。提取转基因植株的D N A ，经P C R 鉴定，初步证明F e r r i t i n 基因整合到转基因玉米基 因组中。 关键词：大豆铁蛋白；F e r r i t i n 基因；胚乳特异表达；启动子；农杆菌介导 第一章文献综述 铁是人体生理代谢必需元素之一，也是不可缺少的营养元素。铁缺乏是全球性较严重的 营养问题之一，能直接导致人体的缺铁性贫血症。贫血会损坏免疫系统，降低人体的生理和、 心理机能；导致精神疲惫，注意力不集中，影响学习和工作效率。严重贫血还可以增加婴幼 儿、孕妇的死亡率。此外，铁营养缺乏还会影响到人的中枢神经系统，对儿童的智力、身体 发育均造成损害【l 2 】。目前，调查结果显示，发展中国家大部分妇女、儿童和发达国家至少 3 0 4 0 的妇女、儿童都受到了严重的铁缺乏困扰【引。 人体对微量营养元素铁的吸收，主要来源于蔬菜、谷类等植食性食物。但这些食物由于 自身铁含量较低或铁的生物有效性低导致以它们为主要食物来源的人体缺铁【4 】。目前，补充 营养剂、食品强化等是比较常用的解决铁缺乏的手段。但是，可溶性和可吸收铁成分的不均 衡使得这些措施见效甚微【5 】o 通过常规育种或是基因工程等生物强化途径改善主食作物中的 铁等微量元素含量成为当前比较有效的措施1 6 , 7 1 。 铁蛋白是植物体内铁贮藏蛋白，调节铁的生物吸收和释放【8 】。研究表明，将铁蛋白转入 蔬菜、谷类等植物，能够提高可吸收利用铁的含量，对解决铁等微量元素营养缺乏具有重要 意义。玉米( Z e am a y sL 1 是世界主要粮食作物之一，其胚乳占籽粒重量的8 0 8 5 ，是主要 的食用部位，培育胚乳中富含铁等微量元素的玉米品种，解决以玉米为主食地区居民缺铁情 况至关重要。 1 铁蛋白的研究概况 1 1 铁的生理功能和吸收机制 铁是大多数生物体内结构或器官的组成成分，是必不可少的营养元素之一，对生物体的 生命活动具有重要作用。 1 1 1 铁在人体的吸收 铁是人体必需微量矿物元素中含量最多一种，人体内的总铁含量平均为4 5 9 ，其中2 3 是功能性铁，以血红蛋白、肌红蛋白的形式存在；其它以贮备铁的形式存在。人体所需铁主 要来自膳食，膳食中的铁的来源有两种：一种是血红素铁，多存在于动物内脏、血液、瘦肉 的血红蛋白、肌红蛋白中，占人体铁来源的1 0 - 4 0 ，它可以直接被肠粘膜上皮细胞吸收； 另一种是非血红素铁，多存在于谷类、蔬菜等植物性食物中，占人体铁吸收量的6 0 一9 0 ， 这种铁为F e 3 + ，需先经胃酸还原为F e 2 + 才能被人体吸收利用【引。血红素铁对肠胃的刺激小， 易于吸收，如鱼类吸收利用率为1 1 ，动物肌肉、肝脏则高达2 2 。而非血红素铁的吸收 多因植食性食物中存在大量的植酸、草酸、鞣酸、钙等抑制铁吸收的物质，其吸收利用率较 低，如水稻中铁吸收率为1 ，玉米为3 ，小麦为5 ，莴苣为4 。 铁在人体内具有多种生理功能，主要体现在4 个方面：( 1 ) 组织器官( 肌肉、肝脏、脾脏、 骨髓等) 的构成成分：( 2 ) 与血红蛋白、肌红蛋白相结合，形成红血球，参与组织中氧气、二 氧化碳的转运和交换过程；( 3 ) 细胞色素酶、铁硫蛋白、过氧化酶和过氧化氢酶等许多酶的 2 辅助因子，促进体内的氧化还原反应；( 4 ) 与免疫功能和能量代谢有关【2 】。 1 1 2 铁在植物中的吸收和运输 铁在地壳中含量居第4 位，但在植物中含量很少，约占植物干重的0 0 2 。这是因为铁 多以F e 3 + 的形式存在，而这种形态的铁在中性和碱性土壤中的的溶解度极低，从而限制了土 壤中铁的有效性【9 】o 植物从土壤中吸收铁的机理主要有两种：机理I ( s t r a t e g y I ) ：在低铁含量 的情况下，非禾本科植物将F e 3 + 还原为F e 2 + ，从而增加铁的吸收；机理I I ( s t r a t e g y I I ) ：禾本 科植物以吸收螯合形式的铁为主( s t r a t e g y I I ) ，如玉米、小麦【l o J 。此外，可能还存在另一种全 新的铁吸收机理I I I 吞噬机理。 植物贮藏铁的主要形式为流动性很小的铁蛋白。因此，植物缺铁首先会反映在植物的幼 芽、幼叶等部位。如水稻、玉米、小麦等禾本科植物缺铁时，会导致叶片脉间失绿，呈条纹 花叶，且心叶发病最重。严重时心叶不出，植株生长不良，生育延迟，甚至不能抽穗。究其 原因主要是缺铁引起叶绿素合成的前体一吡咯环和卟啉环的合成受阻，从而导致叶片黄化， 光合作用降低，且最终造成产量和品质的严重损失【眩l 。此外，铁与过氧化物反应能产生具 有极强毒性的活性氧物质，可导致植物细胞病变或者死亡。总之，铁作为植物正常生命活动 所必需的矿质营养元素之一，在植物的光合作用、呼吸作用、氮的固定、蛋白质和核酸的合 成等生理代谢过程中发挥着极为重要的作用。 1 2 铁蛋白的研究现状 1 2 1 铁蛋白的结构 铁结合蛋白是一种广泛存在于植物、动物和微生物中的铁贮藏结合蛋白，自H y d e 等【I 3 】 第一次报道铁蛋白以来，植物铁蛋白在许多植物中的存在相继得到证实。在植物中，铁蛋白 多天然积累在一些低光合活性的组织中，如种子、幼苗、根尖和豆科植物年幼根瘤等组纠1 4 J ， 在植物导管细胞、维管形成层、生殖细胞和衰老细胞中也有分布【l 引。 R a g l a n d l l 6 1 ，L e s c u r e 17 1 ，L o b r e a u x 18 1 ，S p e n i l9 1 ，W i c k sa n dE n t s c h 2 0 1 等分别从大豆、豌 豆、菜豆、豇豆等多种豆类植物中分别克隆了铁蛋白基因。研究表明，铁蛋白是一类多聚体 蛋白，由2 4 个同源或异源亚基结合成一个4 5 0k D 的大蛋白复合体。这些亚单位排列形成一 个中空的蛋白外壳，直径为1 2 1 3n m ，其中每个亚单位包括1 个由4 股长螺旋组成的束、5 个短的螺旋和1 个长的突出环。壳内含1 个复合体状的无机铁核，由细胞中过量铁聚合形成， 内径7 8r i m 。铁蛋白结构中最多可储存4 5 0 0 个铁原子1 2 1 - 2 3 1 ，这些铁原予以可溶性形式存在， 不具毒性，是具有生物利用价值的铁源。 1 2 2 铁蛋白的生理功能 铁蛋白通过对铁元素的吸收与释放来调节细胞内的铁含量。一般通过两种方式结合 F e “：( 1 ) 两个F e 2 + 结合到铁蛋白中通道附近的位点上，然后被0 2 氧化，产生F e ( O H ) 3 沉淀 于空穴中，此过程不产生毒性自由基；( 2 ) F e 2 + 结合在空穴中心表面，表面的其它分子可催化 F e 2 + 氧化，沉积于被氧化部位。 3 铁蛋白通过亚铁氧化酶活性变化调控植物对铁元素的吸收，主要有两个作用：( 1 ) 铁蛋 白能够贮藏铁，为参与光合作用和其他呼吸作用过程中提供铁离子【2 4 乃l 。当种子形成、叶片 衰老或环境铁过量时积累铁，在种子萌发等过程中释放铁，维持铁的动态平衡，在植物发育 的初期发挥了重要作用。植物铁蛋白具有较强的铁储存能力，因此提高作物种子或籽粒中的 铁蛋白含量，将对改善作物的铁营养品质，解决人类缺铁问题起重要作用。( 2 ) 铁蛋白能够 保护细胞免受过量的铁或者其他金属元素的毒害。v a l ld e rM a r k 等【2 6 J 发现通过过量的铁处理 可以诱导铁蛋白的表达。但过量的F e 2 + 能够催化活性氧的积累，这就加速了过氧化反应，铁 蛋白能够将有毒的F e 2 + 转化为无毒的F e ”螯合物形式，从而保护细胞免受这种氧化胁迫的影 响1 2 。S c z e k a na n dJ o s h i 【2 7 】发现铁蛋白还能够结合有害的金属离子，如镀离子。此外，在豆 科植物中，铁蛋白还与固氮作用有关I l J 。 1 2 3 转铁蛋白基因的研究进展 豆类植物是含铁量高的富铁植物，其铁蛋白中贮藏的铁占种子铁含量的9 0 以_ L t 2 8 刀J 。 利用豆科作物的铁结合蛋白基因，通过转基因技术可以提高作物的铁含量。v a nW u y t s w i n k e l 等【3 0 1 将大豆铁蛋白转入烟草，发现转基因植株叶片中的铁含量增加了2 3 倍。G o t o 等【3 1 1 通 过农杆菌介导的方法，使用水稻胚乳特异性表达启动子G l u B 1 将大豆铁蛋白基因转入水稻， 发现铁富集在转基因植物种子中，T l 代种子干重的铁含量为1 3 3 + 2 8 I t g g 到3 8 1 + 4 5 “g g ， 与非转基因植株相比，铁含量平均提高3 倍左右，而在其他部位中的铁含量则与非转基因植 株差异不大。V a s c o n c e l o s 等【3 2 】在水稻谷蛋白基因启动子G l u t e l i n 驱动下，将大豆铁结合蛋 白基因转入籼稻，结果籼稻籽粒中的铁和锌的含量都有显著提高。Q u 等【3 3 】在水稻球蛋白基 因启动子G l b 一1 驱动下，将大豆铁结合蛋白基因转入水稻，发现转基因最高铁含量比未转化 对照提高3 倍。董阔等【3 4 1 使用G I u B 1 启动子将大豆铁蛋白导入早稻，结果转基因植株种子 中的铁含量明显高于未转基因植株。晰n h 等【3 5 】在水稻g l o b u l i n 启动子的调控下，将大豆铁 蛋白基因和烟酰胺合成酶基因共同转入水稻，发现转基因植株胚乳中的铁含量比非转基因植 株提高了6 倍。D r a k a k a k i 掣3 6 1 将从大豆中分离铁蛋白的e D N A 序列导入水稻和小麦后，再 用玉米组成型启动子泛素U b i q u t i n 1 调控表达，发现只在转基因植物的营养组织中铁含量有 所提高，其中转基因小麦叶片中的铁蛋白含量提高了5 0 ，转基因水稻叶片中的铁蛋白含 量则提高了2 倍，同时转基因植株的抗逆胁迫能力增强。G o t o 掣”j 通过C a M V 3 5 S 启动子 将大豆铁蛋白基因转入生菜，叶片的铁含量增加了1 7 倍，且转基因植物的生长速度也比野 生型的快许多。D r a k a k a k i 等【3 8 1 在水稻球蛋白基因启动子G l b 1 驱动下，将大豆铁蛋白和植 酸酶基因共同转入玉米，结果转基因植株的铁含量普遍增加，同时也提高了铁的生物利用率。 刘巧泉等【3 9 1 将菜豆的铁蛋白基因导入到水稻的胚乳，结果水稻种子的铁含量提高6 4 。 L u c c a 等【4 0 】将菜豆铁蛋白基因转入水稻，发现水稻种子中的铁含量提高了2 倍，同时将烟曲 霉菌的耐热植酸酶引入水稻，而使富含半胱氨酸的内源金属硫蛋白类蛋白过量表达，铁吸收 的抑制剂植酸也很容易被降解，并且过量的半胱氨酸还能迅速结合铁离子，提高铁的吸收利 4 用率。 徐晓晖使用组成型启动子C a M V 3 5 s 将蚕豆铁蛋白转入粳稻，经测定发现转基因植株 种子和叶片中铁含量明显提高。刘燕4 2 1 使用玉米泛素基因启动子U b i q u t i n 1 ，将小红豆铁蛋 白基因的C D S 序列导入水稻，结果转基因植株叶片的铁含量是非转基因植株叶片的2 1 7 倍。 2 启动子概述 2 1 启动子的定义及结构特点 启动子是位于结构基因上游5 端，能够被R N A 聚合酶识别，并与之结合，诱导转录的 一段D N A 序列，是细胞内控制基因转录与表达的时空特异性的重要因子。真核生物的启动 子分3 类，分别被R N A 聚合酶I 、I I 和I I I 识别，起始基因转录。其中，I I 类启动子能够 同R N A 聚合酶I I 识别、结合，控制多数编码蛋白质基因的表达【4 3 1 。高等植物的启动子属 于I I 类启动子，由R N A 聚合酶I I 调控转录的基因核心启动子大多都包含了一个T A T A b o x 或起始子( 埘H 4 | 。 植物基因的转录起始位点一般位于翻译起始密码子( A T G ) 上游4 0 7 0b p 处，保守序列 为C T C A T C A ，通常以中间的碱基A 为转录起始点，编为+ 1 1 4 5 1 。距转录起始位点的3 2 士7 个 核苷酸处通常为T A T A b o x ，富含A T ，其保守序列为T A T A A ( T ) A A ( T ) 。它参与决定转录的 方向，是绝大多数植物启动子正确表达必需的 4 6 1 。有些基因的启动子没有T A T A b o x ，但是 这类基因转录起始于“起始子( I n r ) ”，它与T A T A b o x 功能相似，具有决定转录起始位点并 指导转录起始前复合物的装配的功能，但其转录效率降低4 7 1 。植物基因启动子还存在启动 子一般上游元件C A A T - b o x ，具有增强基因转录的作用；G C 框，能够与特异转录因子S P l 结合促进转录。这两种元件可以同时存在，也可以只存在其中之一。然而，并非所有的植物 基因启动子都存在一般上游元件。此外，不同来源的植物基因启动子还具有种属特异的或是 仅局限于某种基因家族特有的调节基序【4 8 】，如G 盒( C A C G T G ) ，醇溶蛋白盒( T G T A A A G ) ， 豆球蛋白盒等。 2 2 启动子的类型 根据植物基因表达方式不同将其启动子分为3 类：组成型启动子、诱导型启动子和组织 或器官特异性启动子。 2 2 1 组成型启动子 在组成型启动子的调控下，基因的表达不受时空限制和某种物质的诱导，表达具有持续 性，而且R N A 和蛋白质表达量相对恒定。目前，基因工程中使用的组成型启动子多为花椰 菜花叶病毒C a M V 3 5 s 启动子、来自根癌农杆菌T i 质粒T - D N A 区域的胭脂碱合成酶基因N o s 启动子和章鱼碱合成酶基因O c s 启动子【4 9 1 。来自植物本身的组成型启动子，玉米泛素基因 u b i q u i t i n 启动子和水稻肌动蛋白A c t i n I 启动子也广为使用，用它们来代替C a M V 3 5 S 启动子， 可以调控外源基因在单子叶植物中更有效的表达。 虽然植物基因工程中多使用组成型启动子来调控外源基因表达，它能使外源基因在植物 体非特异、高效表达；但它造成了植物能量和养分等资源浪费。而且大量异源蛋白的积累， 会打破植物的代谢平衡，影响植物正常的生长发育，有些还会使某些性状发生变化影响植物 的形态。 2 2 2 诱导型启动子 诱导型启动子是由于信号刺激而具有转录活性的一类启动子，在某些物理或化学信号刺 激下，可以提高基因的转录水平。它可以根据需要在植物发育的特定阶段或特定的组织器官、 生长环境下，接受诱导信号诱导基因快速表达，也可以随时解除胁迫，使目的基因停止表达。 这类启动子区域通常包含增强子、沉默子或类似功能的序列结构。可以划分为：( 1 ) t - 生物 胁迫诱导型启动子，受物理因素( 光、温、干旱等) 或化学因素( 激素、有机物等) 的诱导，如 目前应用最广泛的r d 2 9 A 启动子能够驱动目的基因在干旱、低温和脱落酸A B A ( a b s c i s i ca c i d ) 等非生物胁迫下表达5 0 1 ，r b c S 3 A 、p h y A 启动子则是在光照条件下调控基因的表达【5 1 5 2 J ；( 2 ) 生物因素( 组织器官、发育器官、病菌等) 诱导型启动子，如f i s 启动子受锈菌诱导，使外源 基因在锈菌感染及其周围区域表达【5 3 1 。 2 2 3 组织或器官特异型启动子 在组织或器官特异性启动子调控下，基因的表达局限在某些特定器官或组织中，并具有 调节发育的特性5 4 1 。这类启动子调控外源基因在植株发育的某一特定时空特异表达，克服 了外源基因在组成型启动子启动下的非特异性的、持续的、高效的表达，避免了浪费。同时， 它能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，克服了目的基因在特定组织 部位表达量过低达不到预期效果的问题1 5 5 | 。 这类启动子除具一般的启动子结构特点外，同时还存在组织特异表达相关元件。如R Y 基序对种子特异性基因的高水平表达十分重要，常以多拷贝形式存在，具有抑制种子特异性 基因在非种子组织中表达的负调控元件( N e g a t i v ee l e m e n t ) 的作用【5 6 】；如E 框与G 框存在于 种子特异性启动子中，高度保守，对种子特异基因的表达在时空上起到重要的顺式调节作用。 它们的保守序列相似，突变后会使种子特异性启动子的大部分功能丧失5 7 l ；G C N 4 基序多存 在于种子贮藏蛋白基因中，是胚乳特异表达所必需的顺式调控元件( C i s e l e m e n t ) 之一，如果 发生突变，大部分启动子种子特异表达活性会丧失，还会使贮藏蛋白基因在叶片中表达【5 引。 2 3 胚乳特异启动子 随着抗逆、品质相关基因研究的深入，人们对胚乳特异性启动子的研究越来越多。胚乳 特异性启动子的调控具有明显的组织及发育阶段特异性，能使外源基因在转基因植物种子胚 乳中高效、特异表达，避免外源基因非特异表达造成的能量负荷和物质浪费，减少对植物的 不利影响。胚乳特异性启动子对于提高作物产量、改良作物籽粒营养品质具有非常重要的应 用价值。 2 3 1 胚乳特异性启动子的结构特点 胚乳特异性启动子的结构除了具有基本启动子元件、起始子和上游元件外，还广泛存在 6 一些与胚乳特异性表达相关的顺式作用元件( 表1 一1 ) 。 表1 - 1胚乳特异表达相关的顺式调控元件 W a s h i d a 等【6 3 1 研究发现启动子中A A C A 、A C G T 、G C N 4 和S k n 1 等顺式元件与胚乳特 异表达高度相关，且顺式元件A A C A 和G C N 4 普遍存在于谷蛋白基因启动子中，A A C A 抑 制谷蛋白基因在正处于营养生长阶段组织中表达，G C N 4 对谷蛋白基因启动子的活性具有正 调控作用，且调控谷蛋白基因在胚乳中特异表达。独立的G C N 4 和醇溶蛋白盒不具有生物 学功能，其作用发挥依赖于与其它固定序列或反式作用因子的相互作用。例如，小麦、大麦 和黑麦醇溶蛋白基因启动子中，醇溶蛋白盒与G C N 4 基序一起形成“胚乳盒”或“3 0 0 e l e m e n t ”瞰】。在玉米2 7k D a - Z e n 基因和高粱7 - k a n f i r i n 基因启动子中，G C N 4 基序与醇溶 蛋白盒邻近【6 引。 2 3 2 - 胚乳特异性启动子的研究进展 近年来报道显示，在水稻、小麦和玉米等作物中已经发现和克隆了谷蛋白、球蛋白、醇 溶蛋白等胚乳特异性表达基因的启动子，并用于生物反应器和作物转基因研究。X u e 等【6 5 】 利用G l u B - 1 启动子在大麦中大量合成纤维素酶( 1 ，4 1 3 g l u c a n a s e ) ，具有一定的商业价值。Y e 等【6 6 1 利用G t l 启动子成功获得“黄金米”，使水稻胚乳维生素A ( 1 3 - c a r o t e n e ) 含量显著提高， 具有较高的实用和经济价值。G o t o 等【3 1 】把G l u B - 1 启动子和大豆F e r r i t i n 基因构建表达载体， 并转入水稻，获得的转基因水稻T 。代籽粒铁含量较非转基因植株增加3 倍。张秀君纠d 7 】用 1 9k D - Z e i n 基因启动子将马铃薯花粉特异蛋白基因导入玉米，发现玉米种子的赖氨酸含量提 高约1 0 。D a t t a 纠6 8 1 在水稻谷蛋白启动子的驱动下，将八氢番茄红素合成酶基因导入水稻， 在转基因植株胚乳中成功合成了维他命原A 。B i c a r 等【6 9 】用2 7k D - Z e i n 基因启动子将a 乳蛋 白基因导入玉米，改善了玉米氨基酸平衡。Z h a n g 掣7 0 】用2 7k D - Z e i n 基因启动子将小麦嘌呤 吲哚蛋白基因导入玉米，改善了玉米籽粒硬度，提高了磨粉产量。 3 农杆菌介导的遗传转化 3 1 植物遗传转化方法 7 植物遗传转化是利用分子生物学和基因工程技术将外源基因插入受体植物基因组中，获 得使外源基因稳定表达的可育植株【8 3 1 。这种方法能有效地打破物种间生殖隔离的障碍，实 现了物种间遗传物质的定向交流，从而克服了特定性状的遗传改良中遗传资源不足的矛盾， 较快地实现优良农艺性状的突变。植物遗传转化的方法主要分为直接的遗传转化方法和农杆 菌介导的遗传转化方法。直接的遗传转化方法是借助于简单的外力冲击或是某些物理力学原 理将携带了外源基因的质粒载体直接导入受体细胞，整合进植物基因组中。主要包括基因枪 法、电激法、P E G 法、超声波法、花粉管介导法等，但是这些方法大多不适于大片段D N A 导入，而且常常是多拷贝插入，整合方式复杂，易出现转基因沉默的现象。农杆菌转化则是 一种天然的植物基因转化方法，其含有的T i 或鼬质粒具有携带外源基因的功能。它与直接 的遗传转化方法相比，具有显著优点：( 1 ) 能导入大片段的D N A ；( 2 ) 转化的频率高，再生植 株的可育性高；( 3 ) 导入外源基因的拷贝数较低，发生转基因沉默的概率低，表达效果较好。 3 2 农杆菌介导的遗传转化原理 农杆菌是一类革兰氏阴性土壤杆菌，主要有根癌农杆菌( A g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 和发 根农杆菌( A g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) ，在自然情况下它们可以通过伤口侵染植物，导致受伤 部位产生冠瘿瘤和毛状根。目前在玉米遗传转化中主要使用根癌农杆菌，其介导转化的过程 大致包括：( 1 ) 细菌在植物敏感细胞上吸附；( 2 ) 农杆菌中的T i 质粒上的v i r 区基因被激活； ( 3 ) T - D N A 切割和T - D N A 复合物形成；( 4 ) T - D N A 复合物由农杆菌进入植物细胞；( 5 ) T - D N A 整合到植物基因组中并进行表达。 根癌农杆菌含有环状的肿瘤诱导质粒T i 质粒。主要包括T - D N A 区、毒性区( V i r 区) 、 接合转移区( C o n 区) 和复制起始区( O r i 区) 。其中与生成冠瘿瘤有关的是T - D N A 和r 区。 T - D N A 是T i 质粒上一段可转移的D N A ，可将其携带的外源基因转移并整合到植物基因组中。 它在结构上有一重要的特点，即存在左右两边界，两个边界为2 5b p 不太完全的顺向重复序 列，是T - D N A 转移和整合的重要标记，这两个重复序列之间是生长素和细胞分裂素合成基 因及冠瘿碱合成基因。由于T - D N A 能够进行高频率转移，且可以插入达到5 0k b 的外源基 因，因此，T i 质粒称为植物基因转化的理想载体系统【7 1 1 。 r 区用于编码T - D N A 加工、转移及整合的功能蛋白，它含有r A J 等至少1 0 个操纵 子【7 2 】。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类化合物促使农杆菌向植 物受伤部位移动并附着于植物细胞表面，r 区基因就开始转录。V i r A 基因编码一种结合在 细胞膜上的受体蛋白，决定农杆菌侵染玉米的位点【7 3 】。当它感受植物受伤细胞产生的酚类 化合物时会发生自身磷酸化。r A 蛋白磷酸化后能够将磷酸基转移到旧蛋白，使硒 蛋白活化，然后通过雨蛋白的信号传递作用，启动V i r 区其它基因的表达，从而完成T - D N A ， 从农杆菌到植物细胞的导入过程。其中V i r D l 和V h - D 2 蛋白参与T - D N A 整合过程，V i r D 2 和V i r E 2 产生的细菌蛋白介导T - D N A 进入玉米细胞核，而且在V i r E 2 蛋白存在时，玉米转 化效率可以提高2 倍 4 1 。 8 3 3 农杆菌介导的玉米遗传转化的影响因素 玉米基因型和农杆菌菌株之间存在着强烈的互作，所以选择适当的玉米受体材料和菌株 在转化体系中发挥着重要的作用。 3 3 1 玉米受体材料 农杆菌对玉米的侵染有基因型依赖性，同时玉米愈伤组织的诱导和植株再生也存在着很 强的基因型依赖性。研究发现，不同基因型的转化效率存在明显差异，低至0 ，高达3 0 l _ 7 5 】。 基因型可以影响农杆菌能否吸附玉米受体材料表面，从而影响转化效率。侵染能力强的农杆 菌菌株E H A l 0 1 侵染不同玉米品种的愈伤组织，结果对苏玉l 号转化效率最强，达8 1 【_ 7 6 】。 不同来源的受体材料，如幼胚、茎尖分生组织、胚性愈伤组织、玉米盾片结节和中胚轴 等都可被农杆菌感染和转化。F r o m m 掣7 7 1 和G o r d o n k a m m 等7 8 1 利用基因枪轰击原生质体获 得可育的玉米转基因植株。G o u l d 纠79 】使用农杆菌介导法成功地转化了玉米茎尖分生组织。 I s h i d a 等【7 5 】发现授粉后9 1 4 天，长度1 0 2 0m m 的幼胚，最容易被农杆菌侵染。但是，由 于幼胚的获取受到严格的时间限制，而其胚性愈伤组织则容易获得且具较高的转化频率和再 生频率，所以胚性愈伤组织成为现在玉米遗传转化中最常用的受体材料。此外，农杆菌的转 化率也受到玉米愈伤组织生理状态的影响。不同时期的玉米自交系农大S 1 愈伤组织进行农 杆菌L B A 4 4 0 4 侵染，发现继代7 - 9 天的愈伤组织筛出的抗性愈伤率最高【8 0 1 。袁鹰等对继 代不同天数的愈伤组织进行侵染，发现继代3 5 天的愈伤组织适于转化。 3 3 2 农杆菌菌株 选择适当的农杆菌菌株也是影响遗传转化的关键因素之一。目前已经分离出了大量的农 杆菌菌株，如L B A 4 4 0 4 、E H A l 0 1 、E H A l 0 5 、C 5 8 c l 等对玉米都有感染性。合适的菌液浓 度也是影响农杆菌侵染的重要因素。菌液浓度过低，则导致转化效率降低；而过高则后期不 易抑制。张荣等【8 2 】分别用不同浓度的农杆菌L B A 4 4 0 4 ( p T Q K 2 3 3 ) 菌液侵染A 1 8 8 自交系幼胚， 结果显示，O D 6 0 0 值在0 3 左右的菌液最适于转化。杨爱国【8 3 】用E H A l 0 5 不同浓度菌液侵染 玉米自交系齐3 1 9 胚性愈伤组织，O D 6 0 0 值为0 4 时，转化效率最高。袁鹰掣8 1 】用不同浓度 的菌液侵染玉米自交系7 9 2 2 胚性愈伤组织，O D 6 0 0 值在0 5 - 0 6 时，转化效率最高。 此外，影响玉米遗传转化的因素还有诱导玉米胚性愈伤的培养基成分、选择性标记基因、 共培养的温度和时间掣8 3 J 。 9 第二章Z e i n 启动子的分离及表达载体构建 启动子是基因表达正调控的重要顺式元件，它控制基因表达的时间及强度，精确调控外 源基因在植物体内的表达【4 6 ，洲。胚乳特异性启动子的调控具有明显组织及发育阶段的特异 性，能使外源基因在转基因植物种子胚乳中高效、特异表达，避免外源基因非特异表达造成 的能量负荷和物质浪费，减少对植物的不利影响。胚乳特异性启动子对于提高作物产量、改 良作物籽粒营养品质具有非常重要的应用价值。目前已经克隆和分析了水稻谷蛋白基因 ( g l u t e l i ng e n e s ) 、水稻球蛋白基 ( g l o b u l i ng e n e s ) 、小麦谷蛋白基 ( g l u t e n i ng e n e s ) 、小麦醇 溶蛋白基N l ( g l i a n d i ng e n e s ) 、玉米醇溶蛋白基I 丢l ( Z e i ng e n e s ) 、小麦淀粉合成酶基N ( G B S S I ) 等胚乳特异表达基因的启动子。 玉米醇溶蛋白( 乃伽) 是玉米胚乳的主要贮藏蛋白，占胚乳总蛋白质的7 0 ，Z e i n 表达具 有高度的组织及发育阶段特异性，这种特异性由玉米醇溶蛋白基因Z e n 启动子控制。Z e n 是多基因家族，1 9 k D 、2 3 k D 和2 7 k D Z e n 启动子的研究报道较多【8 5 瑚】，但1 5 k D - Z e i n 启动 子研究尚少。本试验根据N C B I 已报道的1 5 k D - Z e i n ( G e n b a n kM 7 2 7 0 8 ) 序y U t s 9 , 9 0 ，设计特异 性引物，P C R 克隆得到岔加启动子序列，并构建了表达载体p B l l 2 1 - Z e i n G U S ，为进一步 验证外源基因在胚乳中特异性表达提供依据，也为利用基因工程技术改良作物品质奠定基 础。 l 材料与方法 1 1 试验材料 材料：玉米自交系鲁2 5 4 8 。 菌株及载体：大肠杆菌( E s c h e r f c h i ac o l i l l D H 5 c t 菌株感受态细胞，p M D I8 - TS i m p l eV e c t o r 载体( 均购自T a k a r a 公司，大连) ，植物双元表达载体p B l l2 1 ( 本试验室保存) 。 酶及生化试剂：T a q 酶、D N AM a r k e rD L 2 0 0 0 、I P T G 、X g a l ( 均购自T a k a r a 公司，大连) ； D N A 片段回收试剂盒、凝胶回收试剂盒( 均购自T I N A G E N 公司，北京) ；限制性内切酶S c a I 、X b al ( 购自N E B 公司，北京) ；T 4l i g a s e ( 购自p r o m e g a 公司，北京) 。 仪器：P C R 仪( G e n eC o m p a n yL i m i t e dP T C 2 0 0 ) 、紫外分光光度计( B e c k m a nD U6 4 0 S p e c t r o p h o t o m e t e r ) 、低温离心机( B e c k m a nA v a n t i3 0C e n t r i f u g e ) 、电泳仪和紫外凝胶成像仪 ( B i o R a d 公司) 。 。 1 2 试验方法 1 2 1Z e i n 基因启动子片段分离 1 1 2 1Z e i n 基因启动子扩增 P C R 引物( 北京奥科公司合成) 序列如下： ， 上游引物Z p l F ：5 G C A G T A C T A T C C A A G G C A T C C T A A C A A C T - 3 下游引物Z p l R ：5 G C T C l A G A T G C T G T T C T G T T C G A C G A T - 3 P C R 反应体系： 1 0 1 0 B U 丘e r d N T P ( 2 5r e t o o l L ) Z p l F ( 2 0 山田 Z p l R ( 2 0 州) D N A S a m p l e T a qD N AP o l y m e r a s e ( 5U 止) d d H 2 0 2 5 r 此 2 0 p J , 0 5 ：止 0 5 此 2 0 止 0 2 1 a L 1 7 3 9 L T o t a l 2 5 0 p , L P C R 程序： 9 4 3 而i n 9 4 2 0 8 6 0 2 0sl3 2 个循环 7 2 3 。s j 7 2 1 0 m i n 1 1 2 2P C R 产物的回收及纯化 使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收长约4 0 1b p 的片段，即为Z e i n 片段。 1 )用干净的刀片割下含有目的D N A 的琼脂糖凝胶块，放入干净的离心管； 2 )加入3 倍体积的溶胶液( 每1 0 0m g 凝胶加入3 0 0g L ) ，放在5 0 ( 2 水浴1 0m i n ，期间上下 颠倒，使胶彻底融化； 3 )将溶液转移到吸附柱中，1 2 0 0 0r m i n 离心3 0S ，倒掉收集管中的废液； 4 )加入7 0 0 江漂洗液，1 2 0 0 0r r a i n 离心3 0S ，倒掉收集管中的废液； 5 )重复上述第4 步，把吸附柱重新放入收集管内，1 2 0 0 0r m i n 离心2m i n ； 6 )使吸附柱在室温下晾干数分钟，乙醇完全挥发； 7 ) 加3 0p L d d H 2 0 洗脱。 1 1 2 3 目的片段与T 载体连接转化 1 ) 连接反应体系： S o l u t i o nl c D N A p M D l 8 一T d d H 2 0 1 0 9 t L 0 p L 5 p L 5 皿 0 0 此 T o t a l 1 6 连接3h 。 2 ) 连接产物的转化： 蓝白斑筛选平板的制各： ( 1 ) 在含有适当抗菌素的预制L B 平板中央滴加4 0 此，2 的X g a l 和7 皿2 0 的I P T G 。 l l ( 2 ) 用无菌的涂布器使液体均匀分散于平板表面，3 7 ( 2 放置3 4h 。 转化方法：热激法