目的基因的连接、转化、涂板培养-刘玥.ppt

目的基因的连接、转化、涂板培养,生物化学与分子生物学教研室刘玥,掌握目的基因的重组连接原理及方法。理解蓝白斑筛选鉴定的原理熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路和方法,目的,实验总设计,分-PCR分离目的基因切接-目的基因与载体相连转-转入宿主细胞筛-筛选阳性重组体,接-目的基因与载体相连,原理：DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3末端添加一个或者几个A碱基的特性利用T载体3末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接,是一种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体。由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。,pMDTM18-TVector,pMDTM18-TVector,仪器与主要试剂：,pMDTM18-TVector（TaKaRa公司）PCR扩增产物T4DNA连接酶10T4DNA连接酶缓冲液,反应体系,pMDTM18-TVector连接试剂盒使用说明（TaKaRa公司）pMDTM18-TVector0.5l0.5lPCR扩增产物4.5lControlInsertDNA1lddH2O3.5lSolutionI5l5l总体积10l10l,16反应30-60分钟,感受态细胞感受态细胞：经过电击、CaCl2、RuCl等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。,转-转入宿主细胞,实验原理-CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞,目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。,实验器材,器材：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪。,1.LB琼脂固体和液体培养基。2.含特定抗生素的LB固体培养基。3.100mMCaCl2溶液。4.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。5.待转化质粒。,试剂,实验步骤,1.挑取一DH5单菌落于2.5mlLB培养液中37过夜培养,2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间,3.取50ml菌液置于离心管内，44500g离心5分钟,2019/11/23,17,可编辑,4.加入30ml,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟,5.44500g离心5分钟收集细胞后，加2ml,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。,6.感受态细胞分装成100l的小份,暂且不用的贮存于-70可保存半年。取其中一份进行转化。,7.向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟。,8.将上述混合物转移到预热到42的水浴锅中，热休克90秒(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却12分钟。,9.向管内加入800ul的LB培养液。然后37培养45分钟。,生长培养基,10.取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟,选择培养基,11.倒置平板于37培养1216个小时。,实验流程,感受态细菌100ul,连接产物10ul,冰浴中30,混匀,420C水浴90,冰浴1-2,加入500lLB培养液370C振荡培养45,涂板培养过夜,勿动,热激,实验注意事项,为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。,原理：pMDTM18-TVector含有编码-半乳糖苷酶基因（LacZ基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。当这种载体转入的宿主细胞是含有-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（称为互补），产生具有酶活性的蛋白质（-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTG（强诱导剂）,X-gal（生色底物）的培养基上呈蓝色。然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，破坏原有的阅读框，因此同样情况下，带重组质粒的细菌形成白色菌落。,筛-筛选阳性重组体,蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）,lacZ,-半乳糖苷酶,分解乳糖,i,P,O,调控蛋白P,大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因lacZ系统,a-互补显色反应（蓝白斑筛选）,lacZ-,-半