柑橘果实发育过程中抗坏血酸积累及相关酶活性的分析-硕士论文

分类号：密级：内亲8 3p67s 华中农业大学硕士学位论文 柑橘果实发育过程中抗坏血酸积累及相关酶活性的分析 A s c o r b a t eA c c um u l a t i o na n dA c t i v i t yC h a n g eo fR e l a t e d E n z y m e sd u r i n gC i t r u sF r u i tD e v e l o p m e n t 专业：果树学 研究生：谢金霞 指导老师：李国怀教授 刘永忠副教授 指导小组：罗正荣教授 获得学位名称：农学硕士 蔡礼鸿 夏仁学 彭抒昂 刘继红 研究方向：果实品质生理 学位授予日期：2 0 10 年6 月 华中农业大学园艺林学学院园艺植物生物学教育部重点实验室 二。一。年六月 授授授授教教教教 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是如需保密，解密时间2 0 1 2 年6 月2 0 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意 研究生签名：谢耋霞 时间：z 咖年月罗日 糊黼张眦霞粥名多珊p 签名日期：I 口年月7 日 签名日期：, a 。t t n 刍月7 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 柑橘果实发育过程中抗坏血酸积累及相关酶活性的分析 目录 摘要1 A b s t r a c t 3 缩略词表5 l 前言。6 1 1 课题的提出6 1 2 抗坏血酸的研究进展6 1 2 1 触A 的结构及其在植物中的作用6 1 2 2 抗坏血酸的生物合成8 1 2 3 抗坏血酸的转运、代谢和再生1 0 1 2 4 影响A s A 积累的因素1 2 1 2 5 果实中A s A 研究现状1 4 1 3 本研究的目的、内容和意义1 5 2 材料与方法1 7 2 1 试验材料1 7 2 。2 试验方法。1 7 2 2 1 果实可溶性固形物和可滴定酸含量测定1 7 2 2 。2 抗坏血酸含量测定17 2 2 3G a l L D H 酶提取和活性测定18 2 2 4A A 0 、A P X 及M D H A R 、D H A R 酶提取和活性测定。1 8 2 2 4 数据统计分析1 9 3 结果与分析2 0 3 1 柑橘果实发育过程中抗坏血酸的积累2 0 3 1 1 宽皮柑橘果皮中T - A s A 、A s A 及D H A 的积累2 0 3 1 2 宽皮柑橘果肉中T A s A 、A s A 及D H A 的积累2 2 3 1 3 脐橙果皮中T - A s A 、A s A 及D H A 的积累2 4 3 1 4 脐橙果肉中T A s A 、A s A 及D H A 的积累2 6 3 2 柑橘果实发育过程中相关酶活性的变化。2 8 3 2 1 国庆一号温州蜜柑果实发育过程中A A O 和A P X 活性的变化。2 8 3 2 2 国庆一号温州蜜柑果实发育过程中M D H A R 和D H A R 活性的变化2 8 3 2 3 国庆一号温州蜜柑果实发育过程中G a l L D H 活性的变化2 9 3 2 4 纽荷尔脐橙果实发育过程中A A O 和A P X 活性的变化3 0 3 2 5 纽荷尔脐橙果实发育过程中M D H A R 和D H A R 活性的变化3 0 3 2 6 纽荷尔脐橙果实发育过程中G a l L D H 活性的变化3 1 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 4 讨论。3 2 4 1 柑橘果实中抗坏血酸含量的积累：- 3 2 4 2 柑橘果皮中抗坏血酸含量与其相关酶活性之间的关系。3 2 4 3 柑橘果肉中抗坏血酸含量与其相关酶活性之间的关系。3 4 参考文献3 5 致谢4 3 柑橘果实发育过程中抗坏血酸积累及相关酶活性的分析 捅曼 本研究主要以国庆一号温州蜜柑( C i t r u su n s h i uM a r e C V G u o q i n g N o 1 ) 和纽荷 尔脐橙( Cs i n e n s i sO s b e c kC V N e w h a l l ) 为材料，对果实发育和成熟过程中果皮和果 肉的抗坏血酸( A s A ) 含量，A s A 生物合成、分解和循环再生代谢相关关键酶L 一半 乳糖酸1 ，4 内酯氧化酶( G a l L D H ) 、抗坏血酸氧化酶( A A O ) 、抗坏血酸过氧化物 酶( A P X ) 、单脱氢抗坏血酸还原酶( M D H A R ) 和脱氢抗坏血酸还原酶( D H A R ) 的活性动态变化进行研究，并对两个品种的总抗坏血酸( T - A s A ) 、还原型抗坏血酸 ( A s A ) 和脱氢抗坏血酸( D H A ) 含量变化的生化酶学机制进行了探讨。主要研究 结果如下： 1 、国庆一号温州蜜柑和纽荷尔脐橙T - A s A 和A s A 在果实发育过程中变化趋势 不一致，其组织之间也表现出差异。另外，纽荷尔脐橙果实中的A s A 含量要高于国 庆一号温州蜜柑果实的A s A 含量；无论是国庆一号温州蜜柑还是纽荷尔脐橙，果皮 中的A s A 含量都显著高于果肉中的A s A 含量。 2 、在果皮中，G a l L D H 活性大小变化和A s A 含量的变化趋势一致；但是在果肉 中，G a l L D H 活性大小在整个果实发育过程中没有明显的变化。并且无论是在果皮 还是果肉中，纽荷尔脐橙的G a l L D H 活性都要显著高于国庆一号温州蜜柑。 3 、国庆一号温州蜜柑果皮中的A A O 和A P X 活性均显著高于纽荷尔脐橙，纽 荷尔脐橙果肉中的A A O 和A P X 活性都显著高于国庆一号温州蜜柑；对于国庆一号 温州蜜柑来说，A A O 活性在果皮和果肉中没有显著差别，A P X 活性在果皮中却显 著高于果肉；但是在纽荷尔脐橙中，果皮中A A O 和A P X 活性均显著高于果肉中A A O 和A P X 活性。 4 、对于同一品种来说，无论是在果皮还是果肉中，D H A R 活性都要显著高于 M D H A R 活性；另外，在同一时期果皮中两个酶的活性分别比果肉中两个酶活性要 高。两个品种进行比较发现，果皮中的D H A R 和M D H A R 活性相当；M D H A R 活性在 国庆一号温州蜜柑和纽荷尔脐橙的果肉中虽然表现出差异，但是规律不明显；而纽 荷尔脐橙果肉q b D H A R 活性在整个发育过程中都要略高于国庆一号温州蜜柑。 5 、通过本研究发现：G a l L D H 活性可能是影响柑橘果皮A s A 含量的一个主要因 素；而果肉中的A s A 含量与G a l L D H 活性关系不明显。A s A 氧化酶活性差异更有可能 影响库组织中A s A 和D H A 的比例而不是抗坏血酸的总水平。纽荷尔脐橙A s A 含量高 于国庆一号温州蜜柑可能与较强的A s A 合成能力有关，而果皮中A s A 含量高于果肉 除开与较强的合成能力有关外，还可能涉及到其它不确定的因素。比如果肉中A P X 是将A s A 氧化形成D H A 的主要酶，它可能是影响果肉中A s A 含量的一个因素。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 关键词：国庆一号温州蜜柑；纽荷尔脐橙；抗坏血酸；L 半乳糖酸1 ，4 内酯脱 氢酶；抗坏血酸氧化酶；抗坏血酸过氧化物酶 2 柑橘果实发育过程中抗坏血酸积累及相关酶活性的分析 A b s t r a c t T h ec o n t e n t so fa s c o r b a t ei n c l u d i n gt o t a lA s A ( T - A s A ) ，L - a s c o r b i ca c i d ( A s A ，T h e r e d u c e df o r m ) a n dd e h y d r o a s c o r b a t e ( D H t h eo x i d i z e df o r m ) ，a l o n gw i t ht h ea c t i v i t i e s o fL g a l a c t o n o 1 ，4 - l a c t o n ed e h y d r o g e n a s e ( G a l L D H ) ，a s c o r b i ca c i do x i d a s eO 认O ) ， a s c o r b a t e p e r o x i d a s e ( A P X ) ，m o n o d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e ( M D H A R ) a n d d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e ( D H A R ) w e r ea s s a y e dd u r i n gt h e f r u i td e v e l o p m e n ti n G u o q i n gN o 1 ( C i t r u su n s h i uM a r c C V G u o q i n gN o 1 ) a n d N e w h a l l ( Cs i n e n s i s O s b e c kC V N e w h a l l ) T h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s ： 1 A s c o r b a t ea c c u m u l a t i o nd u r i n gf r u i td e v e l o p m e n tv a r i e di nt w oc i t r u ss p e c i e sa n d i nd i f f e r e n tf r u i tt i s s u e sa sw e l l O nt h eo t h e rh a n d ，t h eA s Ac o n t e n ti nn a v e lo r a n g e sw a g h i g h e rt h a nt h a ti nt h em a n d a r i nf r u i t s ；A s Ac o n t e n t si np e e lw e r eh i g h e rt h a nt h o s ei n f r u i tp u l pe i t h e ri nn a v e lo r a n g e so ri nm a n d a r i nf r u i t s 2 I nt h ep e e l ，t h ec h a n g e so fG a l L D Ha c t i v i t ya n dA s Ac o n t e n ts h o w e das i m i l a r t r e n d , w h i l ei nf r u i tp u l p ，G a l L D Ha c t i v i t ya l m o s tk e p tc o n s t a n td u r i n gf r u i td e v e l o p m e n t W h e t h e ri nt h ep e e lo rp u l p ，t h eG a l L D Ha c t i v i t i e so f N e w h a l l w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h o s ei n G u o q i n gN o 1 3 A c t i v i t i e so fA A Oa n dA P Xi nt h ep e e lo f G u o q i n gN o 1 w e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h o s eo fN e w h a l l ，w h i l ei nt h ep u l p ，a c t i v i t i e so f A A Oa n dA P Xo f G u o q i n g n o 1 w e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h o s eo f N e w h a l l A d d i t i o n a l l y , n os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eW a sf o u n da b o u tA A Oa c t i v i t yb e t w e e np u l pa n dp e e lo f G u o q i n gN o 1 H o w e v e ri n N e w h a l l ，a c t i v i t i e so fA A Oa n dA P Xi np e e lw e r eh i g h e rt h a nt h o s ei nf r u i t p u l p 4 I nt h ep u l pa n dp e e lo fe a c hc u l f i v a r , t h eD H A Ra c t i v i t yW a sh i g h e rt h a nt h e M D H A R a c t i v i t y A te a c hs a m p l i n gp o i n t ，a c t i v i t i e so fD H A R a n dM D H A Ri nf r u i tp e e l w e r eh i g h e rt h a nt h o s ei nf r u i tp u l p C o m p a r i s i o nb e t w e e nt h et w os p e c i e sW a sf o u n dt h a t a c t i v i t i e so fD H A Ra n dM D H A Ri np e e lo f G u o q i n gN o 1 w e r es i m i l a ra si np e e lo f N e w h a l l ；s o m ed i f f e r e n c e 谢t h o ms p e c i a lr e g u l a r i t yw e r ef o u n da b o u tM D H A R a c t i v i t y b e t w e e np u l po f b o t hc u l t i v a r s A d d i t i o n a l l y , t h ea c t i v i t yo f D H A Ri nt h ep u l po f N e w h a l l W a sh i g h e rt h a nt h a to f G u o q i n gn o 1 d u r i n gt h ef r u i td e v e l o p m e n t 5 T a k e nt o g e t h e r , G a l L D Hm i g h tp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so fA s A a c c u m u l a t i o ni n 也ep e e lr a t h e rt h a ni nt h ep u l p n l ed i f f e r e n c e so fA s Ao x i d a s ea c t i v i 哆 w e r em o r el i k e l yt oa f f e c tt h ep r o p o r t i o no fA s Aa n dD H Ai n s t e a do fa s c o r b a t et o t a ll e v e l O nt h eo t h e rh a n d ，h i g h e rA s Ac o n t e n ti n N e w h a l l t h a ni nS a t s u m am a n d a r i nm a yb e 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 d u et oi t sh i g hs y n t h e s i sa b i l i t y H o w e v e r , h i g h e rA s Ac o n t e n ti nf r u i tp e e lt h a ni nf i l t i t p u l pm a yb er e l a t e dw i t ho t h e rf a c t o r se x c e p tf o ri t sh i g h e rs y n t h e s i sa b i l i t y F o re x a m p l e ， A P Xw a st h em a j o re n z y m et oo x i d a t et h eA S At oD H Ai nt h ep u l pa n dm a yb ea n i m p o r t a n tf a c t o rt oa f f e c tA s Ac o n t e n tt h e r e i n K e yw o r d s ：C i t r u su n s h i uM a r c C V G u o q i n gN o 1 ，Cs i n e n s i sO s b c c k C V N e w h a l l ， A s c o r b a t e ，L - g a l a c t o n o - 1 ，4 - 1 a c t o n ed e h y d r o g e n a s e ，A s c o r b i ca c i do x i d a s e ，A s c o r b a t e p e r o x i d a s e 4 柑橘果实发育过程中抗坏血酸积累及相关酶活性的分析 缩略词表 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 前言 1 1 课题的提出 抗坏血酸( A s c o r b i cA c i d ，A s A ) 且P 维生素C ( V i t a m i nC ，V c ) ，在植物体内存在两 种形式，即还原态V c ( L 抗坏血酸，A s A ) 和氧化态V c ( 脱氢抗坏血酸，D H A ) 。 在植物体中，它们不仅在抗氧化和清除自由基、光合作用和光保护、细胞生长和分 裂等方面起到重要作用，而且还是一种重要的辅酶因子( D a v e y , 2 0 0 0 ) 。同时，A s A 也是人类和动物维持生长、繁殖和保证健康所必需的营养物质。A s A 不仅参与神经 递质( n e u r o t r a n s m i t t e r ) 、脂类和胶原质的代谢( K o j o ，2 0 0 4 ) ，而且还能促进人体对 铁和锌的吸收，降低血液中的胆固醇和预防病毒和细菌的感染( F r o s s a r d , e ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。另外，A s A 还在预防和治疗各种与氧化胁迫相关的疾病，如癌症、心脏血管 疾病和衰老等方面起到重要作用( F r e ia n dL a w s o n , 2 0 0 8 ) 。和植物、微生物及动物 不同的是，人类自身不能合成A s A ，必须依靠日常饮食获得，其中新鲜蔬菜和水果 是人类获取A s A 的主要来源( N a i d u , 2 0 0 3 ) 。 目前A s A 积累和代谢生理生化或分子机制在刺梨( 安华明等，2 0 0 5 ) 、苹果( L i e ta 1 ，2 0 0 8 ) 、芒果和番石榴( G o m e ze ta 1 ，2 0 0 9 ) 、猕猴桃( B u l l e ye ta 1 ，2 0 0 9 ) 、番 茄( I o a n n i d ie ta 1 ，2 0 0 9 ) 和樱桃( B a d e j oe ta 1 ，2 0 0 9 ) 等许多果实中均有报道，表明 不同果实中A s A 积累代谢机制存在特异性。柑橘果实富含A s A ，是人们喜爱并经常 食用的果品，已经成为人们获取A s A 的重要食物来源( T a y l o r ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。但是不 同柑橘品种的A s A 含量差异很大( 如宽皮柑橘类果肉A s A 含量平均约3 0 m g 1 0 0 9 ，橙 类约5 0 m g 1 0 0 9 ) ( N a g y , 1 9 8 0 ) ，而有关差异原因的研究目前报道较少。因此，研究 柑橘A s A 合成和代谢调控机制，对最终调控柑橘A s A 含量，保持和提高柑橘品质( 保 健功能) 具有重要意义。 1 2 抗坏血酸的研究进展 1 2 1A s A 的结构及其在植物中的作用 A S A 的化学名称是L 苏糖型六2 烯醇1 ，4 内酯，它是由烯二醇基团和五元杂 环内酯构成的二羧酸。A s A 的稳定性源自于兀电子在羧基和烯二醇基团系统上的离 域，它的酸性由C 3 决定。A s A 的氧化产物是脱氢抗坏血酸( D H A ) ，D H A 是由 C 6 上的羟基和C 3 闭合而成的双环离子基，未成对的电子落在C 4 区域，使得离子 基显电中性( D a v e y , 2 0 0 0 ) 。A s A 是植物组织内广泛存在的高丰度小分子物质，它 具有很多特殊的功能。在植物中，A s A 通过作为一些酶的辅酶( G a r aL ，e ta 1 ，1 9 9 1 ) 、 自由基清除剂( T s a o ，1 9 9 7 ) 、叶绿体和质膜电子供体或受体( A s a r d , 1 9 9 5 ) 以及作 6 柑橘果实发育过程中抗坏血酸积累及相关酶活性的分析 为植物草酸盐和酒石酸盐生物合成的底物( G a r a , e ta 1 ，1 9 9 4 ) 等四个方面的作用而 发挥其生物学活性。 一 一 首先，A s A 在植物体内的一个重要功能是调节一系列重要的酶促反应。包括活 性位点含有铁和铜的单氧或二氧化物酶，如赖氨酸羟基化酶、脯氨酸一2 一酮戊二酸一3 - 二氧化物酶和氨基环丙烷羧基氧化酶等，都需要A s A 作为辅酶，A s A 可以使这些酶 反应中心的金属离子保持还原状态而提高酶的活性( D a v e y , 2 0 0 0 ) 。A s A 还可直接参 与植物羟脯氨酸富集的糖蛋白的生物合成( C o n l d i n , 2 0 0 1 ) 。除此之外，A s A 还能够 专一地活化黑芥子酶( 葡萄糖硫苷葡糖水解酶) ，该酶能使芥子油苷水解为D - 葡萄 糖和一个糖苷配基片段；也能作为氨基环丙烷羧基氧化酶( A C C 氧化酶) 和赤霉素 3 二氧化物酶的辅酶而参与植物激素乙烯和赤霉素的生物合成( D a v e y , 2 0 0 0 ) 。在光 保护系统中，A s A 也是催化黄素循环中紫黄质生成玉米黄质的酶紫黄质脱环氧 化酶( 在黄素循环中催化紫黄质生成玉米黄质) 的辅因子( M u l l e r - M o u l e ，e la 1 ，2 0 0 4 ) ， 对于过剩光能的非光化学猝灭和保护作用的正常进行具有非常重要的意义( C o n l d i n , 2 0 0 1 ) 。 其次，A s A 作为一种很重要的抗氧化剂，在抗各种生物胁迫和非生物胁迫方面 起着很重要的作用。植物体内会因为各种原因产生活性氧( R e a c t i v eO x y g e nS p e c i e s ， R O S ) ，如过氧化氢( H 2 0 2 ) 、超氧化物、氢氧自由基等，从而引起氧化胁迫。一定 浓度的R O S 是植物正常的生理过程所必需的，但如果R O S 生成过多就会导致正常 的生理过程遭到破坏，引起植物未成熟衰老和死亡，所以严格控制R O S 水平是生命 活动正常进行的前提( I s h i k a w a , 2 0 0 6 ) 。这个控制是通过各种抗氧化剂之间的相互作 用完成的，其中A s A 起到重要作用：一方面，A s A 具备直接清除各种R O S ，包括单 线态氧、超氧化物和H 2 0 2 的能力( L i ，e ta 1 ，2 0 0 7 ) ；另一方面，它还可以通过抗坏 血酸过氧化氢酶( A P X ) 的活性间接清除过氧化氢( A s a d a , 1 9 9 2 ) 。如对苹果的研究也 表明，A s A 是苹果果实适应强光，防止光氧化伤害( 日烧) 的重要调节物质，对防 御光氧化胁迫具有重要的作用( M a ，c ta 1 ，2 0 0 4 ) 。同时施加外源A s A 能增加植物对 高盐、干旱、0 3 、衰老等逆境的抗性( 何文亮等，2 0 0 4 ；庞勇等，2 0 0 5 ；马春花等， 2 0 0 6 ；郑启伟等，2 0 0 6 ；许丙军等，2 0 0 6 ；C h e n , e ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 第三，A s A 不仅能够影响植物细胞分裂和分化，而且影响细胞增殖和伸长。很 多相关证据表明A s A 参与植物细胞分裂。在植物分生组织内，A S A 的含量很高；而 在细胞分裂发生很少的区域，如玉米根静止区，A s A 的含量很低( S m i r n o f f , 1 9 9 6 ) 。 同样，在处于静止期的细胞内，抗坏血酸氧化酶( A A O ) 的m R N A 和活性都很高。 但是，当静止期的细胞进入细胞周期时，它们都变得很低( K a t o ，1 9 9 9 ) 。此外，用 外源A s A 处理可以加快豌豆根系中细胞分裂感受态细胞从G 1 至S 期的进程( C i a e f i o ， e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。用石蒜碱处理( 1 y e o r i n e ，抗坏血酸的抑制剂) 处于分裂期的细胞，发 现细胞的分裂受到抑制，而重新补充A s A 后，细胞分裂得以恢复( A r r i g o n i ，1 9 9 4 ) 。 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 虽然这些都可以表明A s A 参与了细胞分裂，但是具体的机制却还没有更深入的研究。 在影响细胞增殖和伸长方面，S m i r n o f f ( 1 9 9 6 ) 假设，在细胞壁内A s A 能够在A A O 的作用下生成单脱氢抗坏血酸( M D H A ) ，依赖N A D P H 的连接细胞色素b 的原生质 膜将M D H A 还原成A s A ，然后被转运到非原生质体区域。在这个循环中，依据酸形 成理论，电子通过原生质膜的转运刺激了细胞伸长( R a y l e ，1 9 9 2 ) 。此外，A s A 和 D H A 在细胞壁中更可能是通过影响细胞壁蛋白和多糖体、木质化和钙含量之间的交 联来控制细胞伸长的( S m i r n o f f , 1 9 9 6 ) 。K a t o 和E s k a ( 1 9 9 9 ) 在烟草细胞中发现， 当细胞延伸时，A s A 和A A O 活性以及它的m R N A 都增加了。该发现为前面的假说 提供了有力的证据。A s A 还能够直接清除参与木质素合成的单木质素自由基，它是 由细胞壁或质外体过氧化物酶负责形成的。A s A 能可逆性地抑制此酶的活性，抑制 单木质素自由基的翻转和向质外体或细胞壁的分泌( T a k a h a m a , 1 9 9 4 ；C a r m e n ，e ta 1 ， 1 9 9 6 ) 。此外，A s A 还可以作为草酸生物合成的底物，A S A 降解生成的草酸能通过 与C a 2 + 的结合，降低C a 2 + 依赖性果胶的固定进而抑制细胞壁的硬化( S m i r n o f f , 1 9 9 6 ； A r r i g o n i ，1 9 9 4 ) 。 第四，A s A 还与花期的调控和衰老的启动有关。A s A 缺乏的拟南芥突变体( v c t l ) 的A s A 含量只有野生型的2 0 5 0 ，当生长在长日照下时，它在表型上表现出提前 开花和叶片衰老的启动提前( B a r t g2 0 0 6 ) 。通过增加A s A 含量，能推迟拟南芥 ( D a n i e l a , 2 0 0 7 ) 和白菜仔长日照下的开花时间( A t t o l i c o ，2 0 0 6 ) 。B a r t h 等( 2 0 0 6 ) 认为，A s A 的这种功能可能和它作为酶的辅酶因子有关，它可以通过调控赤霉素、 脱落酸或乙烯等这些激素的合成过程来间接地调控开花时间和衰老启动。K o t c h o n i 等( 2 0 0 9 ) 进一步研究发现A s A 可以通过影响拟南芥光周期途径和自主途径上游基 因的表达来调控开花时间。 1 2 2 抗坏血酸的生物合成 A s A 广泛存在于植物体内。在叶绿体基质中，A s A 的浓度大约为3 0 0 r a m ，在叶 片中大约是1 - 5 r a m ( S m i m o f f , 2 0 0 0 ) 。但是关于A s A 的合成途径却经过了很长一段 时间的研究。早在2 0 世纪5 0 年代，人们初步明确哺乳动物体内的A s A 合成途径。 从动物淀粉中得到的U D P D 葡萄糖被认为是A s A 合成的主要底物，中间物质包括 D 葡萄糖醛酸酯、L 古洛糖酸和L 古洛糖酸1 ，4 内酯，该途径的最后一步发生在 线粒体内，其余各步定位于细胞溶质( H a s s a ne ta 1 ，1 9 5 6 ) 。通过放射性标记研究得 到的证据表明植物体内的生物合成途径和动物的不同( L o e w u s ，1 9 9 9 ) 。目前，人们 提出了四条植物A s A 生物合成的可能途径，即L 半乳糖途径、D 半乳糖醛酸途径、 L 古洛糖酸途径和肌醇途径( 图1 ) ( 邹礼平，2 0 0 5 ) 。 L 半乳糖途径被公认为是高等植物合成A s A 的主要途径。很早以前，人们就发 8 柑橘果实发育过程中抗坏血酸积累及相关酶活性的分析 现L 半乳糖是A s A 合成的重要前体物质，L 半乳糖脱氢酶促进L 半乳糖转化为L 半乳 糖酸1 ，4 内酯，然后在L 半乳糖酸1 ，4 内酯脱氢酶( G a l L D H ) 的作用下，L 半 乳糖酸1 ，4 内酯直接转化为抗坏血酸( M a p s o ne ta 1 ，1 9 5 8 ；O b ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。后来， W h e e l e r 等( 1 9 9 8 ) 发现D 甘露糖也是A s A 合成的前体，可以通过G D P D 甘露糖3 ， 5 差向异构酶的催化和L 半乳糖相互转化。综合他们的研究结果，他们提出A s A 生物 合成的L 半乳糖途径， I P A s A 合成主要是通过D 葡萄糖6 磷酸一D - 果糖6 磷酸 _ D 甘露糖6 磷酸一D 甘露糖1 磷酸_ G D P D 甘露糖- - + G D P L - 半乳糖_ + L 半乳 糖1 磷酸- L - 半乳糖一L 广半乳糖内酯_ A s A 。在该途径中，半乳糖内酯脱氢酶 ( L g a l a e t o n o 1 ，4 1 a c t o n ed e h y d r o g e n a s e ，G a l L D H ) 直接催化半乳糖内酯形成A s A ， 起着非常关键的作用。O b a 等( 2 0 0 1 ) 利用同位素1 4 C 甘露糖饲喂实验，进一步证实 该途径存在，编码G a l L D H 基因的e D N A 已在多种植物中得到克隆( 安华明等，2 0 0 5 ； I s h i k a w a , e ta 1 。2 0 0 6 ) ，G o m e z 和F m n c o ( 2 0 0 8 ) 也证实L 半乳糖途径的代谢物和转 录水平在番茄中很高，这表面该途径是舡A 生物合成的主导途径。 艄秘专 土灼k 拳乳熹，二黢 仉半 赣 飘酵、I。占洛雅二磷酸 k 拳乳芏。1 7 黢 I 7 1 2 薹3 蝴洛篡；衅* K 夕籼争运_ 也 图1 植物和动物抗坏血酸合成途径( 邹礼平，2 0 0 5 ) F i g 1B i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fL a s c o r b i ca c i di np l a n t sa n da n i m a l ( 邹礼平，2 0 0 5 ) 1 G D P 甘露糖焦磷酸化酶；2 G D P 甘露糖3 ，5 差向异构酶；3 磷酸二酯酶；4 L - 半 乳糖1 磷酸磷酸酶；5 L - 半乳糖脱氢酶；6 L 半乳糖酸1 ，4 内酯脱氢酶；7 甲基酯酶； 8 D 半乳糖醛酸还原酶；9 醛糖内酯酶：1 0 磷酸二酯酶；1 1 糖磷酸酶； 1 2 肌醇氧 酶； 1 3 葡萄醛酸还原酶；1 4 醛糖内酯酶；1 5 L 古洛糖酸1 ，4 内酯脱氢酶。 1 G D P - m a n n o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e ；2 G D P m a n l l o s e - 3 ，5 - e p i m e r a s e ； 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 3 p h o s p h o d i e s t e r a s e ；4 L - g a l a c t o s e 一1 - p h o s p h a tp h o s p h a t a s e ； 5 L - g a l a c t o s ed e h y d r o g e n a s e ；6 L g a l a c t o n o - 1 ，4 l a e t o n ed e h y d r o g e n a s e ；7 m e t h y l e s t e r a s e ； 8 D g a l a e t u r o n i ca c i dr e d u c t a s e ；9 a l d o n o l a c t o n a s e ；10 p h o s p h o d i e s t e r a s e ； 11 s u g a rp h o s p h a t a s e ；12 m y o I n o s i t o lo x y g e n a s e ； 1 3 g l u c u r o n a t er e d u c t a s e ；1 4 a l d o n o - l a c t o n a s e ；1 5 L - g u l o n o 一1 ，4 - l a c t o n ed e h y d r o g e n a s e 虽然A s A 的L 半乳糖途径( W h e e l e r , e ta 1 ，19 9 8 ) 较符合植物生理实际，但该途 径并不是植物A s A 生物合成的唯一途径。在L 半乳糖途径提出后不久，D a v e y 等 ( 1 9 9 9 ) 在植物中检测到了L 古洛糖酸( L G u l L ) 。随后J a i n 和N e s s l e r ( 2 0 0 0 ) 发现老 鼠L 古洛糖酸1 ，4 内酯氧化酶( 伽L O ) 在烟草和莴苣中的过量表达能够使A s A 的 含量增加近7 倍。而且该基因还能使拟南芥A s A 缺乏突变体v c t l 的A s A 含量恢复到正 常野生型的水平( R a d z i oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 。这些研究结果都表明在植物体内存在一种能 先合成L G u l L ，然后通过G u l L O 催化形成A s A 的途径，I I I J L 古洛糖酸途径。不过目 前该途径中催化G D P L 古洛糖到L 古洛糖的两步反应的酶在植物中还没有鉴定出 来，所以该途径在植物中是否本身就存在还需要进一步的研究和验证。 D 半乳糖醛酸途径的发现所经历的时间比较长。最初I s h e r w o o d 等在1 9 5 4 年就发 现用D - 半乳糖醛酸甲酯饲喂水芹幼苗和拟南芥培养细胞，可以使抗坏血酸含量显著 增加。L o e w u s 等( 1 9 8 7 ) 在分离的成熟草莓果实中通过D 半乳糖醛酸经碳链倒位途 径成功合成了A s A 。接着A g i u s 等( 2 0 0 3 ) 从草莓果实中成功克隆到D 半乳糖醛酸还 原酶( 叫U R ) 基因，最终证实D 半乳糖醛酸合成抗坏血酸这一途径在植物体内存 在。在这条途径中，首先是D 半乳糖醛酸被还原成L 半乳糖酸，L 半乳糖酸接着转 变成L 半乳糖酸1 ，4 内酯，然后在L 半乳糖酸1 ，4 内酯还原酶的作用下合成A s A 。 另外在植物体内还可能存在类似动物的肌醇途径。D 葡萄糖醛酸酯是动物A s A 生物合成途径中的中间产物，它是由肌醇( M I ) 在肌醇氧化酶( M I O X ) 的作用下生成 的。由于拟南芥基因组测序计划的完成，研究者在植物中找到了猪M I O X 基因的同 源物。并且在拟南芥第1 、2 、4 、5 染色体上找到4 个与这个基因同源的开放读码框。 进一步的精细搜索发现第4 染色体的编码区是最合适的。将该基因克隆并在细菌中 表达之后发现重组蛋白显示M I O X 活性。肌醇氧化酶基因的表达显著增加了转基因 拟南芥中A s A 的含量( L o r e n e ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。但是L o e w u s ( 1 9 8 7 ) J J 2 1 4 C M I 喂养 成熟草莓果实后，标记物能生成D 葡糖醛酸，但不能生成A s A 。因此，此途径的生 理可能性还需要进一步的证实。 1 2 3 抗坏血酸的转运、代谢和再生 A s A 在植物体内的转运分为胞内转运和长距离转运( 胞外转运) 两种情况。当 A s A 在线粒体内膜合成之后，它可以向所有的亚细胞区域分散，包括非原生质体。 l O 柑橘果实发育过程中抗坏血酸积累及相关酶活性的分析 因为A s A 的分子体积较大，并且生理p H 呈负电荷，所以它不能穿过油脂双分子层。 虽然D H A 是一个中性分子，比A s A 的疏水性更强，但是因为D H A 对油：水的分 散系数要比甘露糖小，而甘露糖会被油脂双分子层排除在外( R o s e ，1 9 8 7 ) ，所以D H A 穿过油脂双分子层的简单扩散也是可以忽略的。因此，A s A 和D H A 的转运体系主 要由协助扩散或主动运输调节。虽然利用孤立完整的细胞器或原生质体吸收A s A 的 研究表明高等植物体内的转运体系确实存在，但是具体机制还没有被阐明。例如， B e c k 等( 1 9 8 3 ) 和A n d e r s o n 等( 1 9 8 3 ) 表明完整菠菜叶绿体的A s A 吸收遵循米氏 动力学，然而K m ( 2 0 - 4 0 r a M ) 值却非常高。同样烟草B Y - 2 细胞的线粒体对A s A 吸收的亲和力很低( S z a r k ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。大麦原生质体对A s A 有着很强的亲和力 ( K m = 9 0 1 - L M ) ( R a u t e n k r a n ze ta 1 ，1 9 9 4 ) ，但是桦木叶的非原质体对A s A D H A 吸收 的K m 值为1 2 8 m M ( K o l l i s te ta 1 ，2 0 0 1 ) 。另一方面，A s A 进入液泡并没有饱和动 力学，这表明缺少特殊的载体( R a u t e n k r a n ze ta 1 ，1 9 9 4 ) 。和高等植物不同的是，哺 乳动物的A s A 载体( 依赖钠的维生素C 载体，S V C T l 和S V C T 2 ) ( D a r u w a l ae ta 1 ， 1 9 9 9 ) 已经鉴别出，这些蛋白质属于抗坏血酸碱基载体家族( N A T ) ，N A