国家重点基础研究发展计划（973计划）项目申报书-帕金森病发病机制和干预策略的基础研究

项目名称：帕金森病发病机制和干预策略的基础研究首席科学家：王晓民 首都医科大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部 卫生部二、预期目标总体预期目标在本项目组已有的前期工作（原973项目“神经变性病的机制和防治的基础研究”）成果和基础之上，通过对PD发生发展过程中DA能神经元选择性、进行性变性死亡的机制研究，对疾病发生发展的认识有重大推进，形成新理论，并指导预警、早期诊断、预防和治疗，使我国在PD的基础研究和临床诊断与治疗上形成自己的特色，达到国际先进水平。五年预期目标1、 建立1-2种PD关联基因的相互作用模式；初步揭示老化、遗传和环境因素的共同作用与PD发生发展的关系；建立基于中国人PD风险基因的早期预警指标。2、 初步揭示黑质DA能神经元特异异常表达蛋白质、金属离子选择性聚集、线粒体功能障碍以及神经元-胶质细胞网络功能失衡在神经元选择性、进行性变性死亡中所起的作用及相关机制，提出与PD黑质DA能神经元选择性、进行性变性死亡相关的新假说。3、 阐明NMS在PD的发生率以及与临床病程的相关性，建立以NMS预测PD的风险评估量表，综合评价其作为PD临床预警指标的可能性。将该量表与生物化学、影像学检测指标相结合，建立有助于PD早期诊断的综合指标体系。4、 研究PET、SPECT分子探针，开发出具有自主知识产权的PD早期影像学诊断试剂；阐明若干候选化合物的作用机制，为开发新药奠定基础；建立灵长类iPS 细胞移植治疗PD的技术，为PD的治疗提供新策略。 5、发表文章、人才培养和专利（1）发表相关SCI收录文章不少于120篇，其中IF5.0的文章30篇。（2）培养博士后25-30名，博士与硕士生300-320名。（3）申请专利15项。三、研究方案总体学术思路：在前期工作基础上，结合目前国际学术前沿，从启动因素、关键环节和渐进性加重机制三个层面，探讨老化、遗传和环境因素相互作用在启动DA能神经元变性死亡的机制；认识黑质特异性表达的蛋白质以及金属离子异常聚集、线粒体功能障碍等关键环节在神经元选择性变性死亡中所起的作用；阐明神经元-胶质细胞网络功能失衡最终导致神经元变性死亡进行性加重的过程及其机制；关注严重影响患者生活质量的非运动症状并开展机制研究；建立基于遗传学、生物化学、非运动症状以及影像学等为基础的早期预警和诊断的指标体系；深入研究具有自主知识产权或前期工作基础的神经保护性先导化合物或候选靶标，积极开展灵长类iPS细胞移植治疗PD的相关研究。课题设置思路和各课题概况本项目拟从PD是以“黑质多巴胺能神经元选择性、进行性变性死亡”为主的全身性病理过程这一关键科学问题。结合国际学科前沿及我们已有的研究基础来设置课题。从老化、遗传和环境之间的相互关系在触发PD起始中所起的作用（课题一）；从黑质DA能神经元本身的特性（课题二）以及神经元-胶质细胞的相互关系（课题三）入手，探讨黑质DA能神经元选择性、进行性变性死亡的机制，力求对疾病的发生发展有更深入的认识；对PD所致全身性的NMS进行研究，探讨其发生机制以及作为临床预警指标的可能性（课题四）；建立基于NMS的PD风险评估量表、遗传学、生物化学和影像学检测手段的疾病早期预警、早期诊断的综合指标体系，深入研究具有良好前景的候选化合物的作用机制，建立灵长类iPS细胞移植治疗PD的技术，为PD的治疗提供新策略（课题五）。通过该项目的实施，使我国在PD研究领域的工作总体上达到世界先进水平。本项目拟设置的五个课题为： 课题1：老化、遗传及环境因素在帕金森病发病中的作用及机制研究主要研究内容：老化、遗传及环境因素的相互作用在PD发病机制中起关键作用，其中遗传易感性是基础。本项目在前期研究中发现了数个中国人PD独特风险基因变异及环境易感因素，但其参与发病的具体机制尚未阐明。本研究将在此基础上，从临床和基础两方面深入探讨风险基因之间、基因变异与环境暴露因素、年龄增长之间的相互作用规律，以进一步揭示PD的分子发病机制及其对PD临床表型和疾病进展的影响，探讨风险基因在PD早期预警和早期诊断中的作用。研究目标：1、阐明中国人PD独特的风险基因变异(如LRRK2-G2385R、GBA-L444P、SNCA-rs356165等)之间的相互作用方式，评价这些基因在PD早期预警和早期诊断中的作用；2、初步揭示特定风险基因突变/多态性与特定环境因素及老化之间的交互作用规律；阐明PD相关环境危险因素及其与遗传基因相互作用的模式及其作为风险人群和早期预警指标的可能性；3、利用食蟹猴模型，阐明相关基因和环境毒素单独和相互作用的机制； 4、确定1-2个可作为PD诊断标记物的PD致病基因及其编码蛋白，奠定其作为PD检测技术方法的基础；5、发表相关SCI收录文章不少于25篇，IF5.0的文章不少于6篇； 6、培养博士后3-5名，博士与硕士生60-65名； 7、申请专利3-5项。承担单位：首都医科大学课题负责人：陈彪课题参加人员：唐北沙，于顺经费比例：16.3%课题2：黑质多巴胺能神经元选择性变性的特征及机制研究主要研究内容：研究表明，PD是在老化、遗传和环境因素相互作用的触发下引起的以黑质DA能神经元变性死亡为主的全身性疾病。为何PD会发生这种区域性和神经元种类选择性的变性死亡？根据我们前期工作的基础和国际最新研究成果，我们提出神经元选择性变性的新假说，即DA能神经元内在固有特性（差异表达的蛋白、金属离子以及线粒体等代谢及功能障碍）是其选择性变性死亡的基础。为此，将已知的黑质区域特异性异常表达的蛋白与铁代谢、线粒体功能有机结合起来进行研究，将有助于揭示DA能神经元选择性变性死亡的机制。研究目标：1、 利用转基因动物模型和细胞模型，鉴定可能与黑质DA能神经元选择性变性有关的蛋白，提出DA神经元选择性损伤的关键分子模型；2、 深入探讨铁离子代谢异常在PD发病中的作用；阐述胶质细胞在其中的作用；3、 阐述已知的PD致病蛋白（-Syn、PINK1、DJ-1）的相互作用，以及在线粒体损伤中的作用机制，探讨多巴胺能神经元中线粒体损伤对其进行性和选择性损伤的机制。通过对PD相关蛋白的相互作用对线粒体损伤和保护作用的研究，力求在PD的发病机制上提出新观点，提出预防或减缓DA能神经元损伤的新策略；4、 研究发表SCI论文25篇以上，其中IF5的不少于7篇；5、 申请发明专利2-3项；6、 培养博士后2名，博士/硕士生60-65名。承担单位：中科院上海神经科学研究所课题负责人：周嘉伟课题参加人员：谢俊霞、王光辉、柯亚经费比例：16.3%课题3：神经元-胶质细胞相互作用在帕金森病发生发展中的作用及机制研究主要研究内容：神经元周围的胶质细胞在维持神经元微环境的动态平衡中发挥重要作用。在内外因素的作用下，受损的神经元以及过度激活的胶质细胞将导致神经元所处微环境的恶化，使神经元的损伤呈现进行性加重态势。本课题拟通过系统地研究神经元-胶质细胞之间的相互作用，阐明胶质细胞在维持神经元正常功能以及在病理状态下导致神经元死亡中的作用，以揭示在PD时黑质DA能神经元进行性、选择性死亡的机制以及发现潜在的新的治疗靶点。研究目标：1、阐明Kir6.1/K-ATP是调控DA能神经元损伤、小胶质细胞和神经干细胞功能的重要生物学靶点；阐明其对星形胶质细胞功能和胶质传递的调节作用及其与PD的相关性，以揭示“Kir6.1家族细胞”在PD发生发展中的作用，为PD神经保护治疗提供新策略。2、明确内、外源性神经毒素对神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的影响；阐明小胶质细胞和星形胶质细胞在PD免疫炎症与氧化应激过程中发挥的不同作用以及与神经元的相互影响；明确PHOX、MMP9在PD发病中的作用以及相关信号转导机制，及其作为PD神经保护靶点的可能性。3、阐明p75-Trk、p75-sortilin途径介导活化胶质细胞调控DA能神经元发育、生存和凋亡的作用机制；发现干预p75-Trk、p75-sortilin途径的神经保护治疗新靶点。4、明确线粒体功能障碍氧化应激及自噬在PD发病相关基因a-Syn和PINK1激活胶质细胞的过程中的作用，探讨干预胶质细胞活化的靶点，为防止PD进行性发展提供线索。5、发表SCI论文30-40篇， IF5.0的文章5-8篇；培养博士后6-8名，研究生80-85名；拟申请专利5-6项。承担单位：首都医科大学课题负责人：王晓民课题参加人员：胡刚、陈良为、杨慧经费比例：29.4%（含首席经费）课题4：帕金森病非运动症状发生机制及早期临床预警指标的研究主要研究内容：非运动症状（non-motor symptoms, NMS）作为PD临床表现的重要组成部分，在最近的PD临床与科研研究中受到人们越来越多的关注。然而NMS在PD发展过程中所起的重要作用以及其具体发生机制目前尚不清楚。因此本课题旨在探讨PD患者中各种NMS的发生率、病因、发生机制及与临床进程的关系，研究和阐明与各种NMS发生相关的因素及其机制。从而明确NMS与PD发生风险的关系，确定其在PD早期预警和早期诊断中的作用和意义，建立有助于PD早期诊断的综合指标体系。研究目标：1、 通过回顾性/前瞻性研究，明确PD患者出现不同亚型的嗅觉、便秘、抑郁、睡眠障碍、认知功能障碍等各种NMS的发生率，分布频率及相关特点；通过探讨NMS与发病年龄、病程、药物治疗以及不同NMS之间的关系，明确NMS与PD发生风险的关系，确定其在PD早期预警和早期诊断中的作用和意义；2、 明确各种NMS发生与PD相关基因（Tau、-Syn或LRRK2）多态性和环境暴露（接触农药、杀虫剂、脑外伤等）的关系；3、 掌握社区老年人中（60岁及以上）各种NMS的分布频率；以及这些NMS对预测PD发生的敏感性和特异性；4、 建立特异性强、灵敏度高的各种NMS预测PD的风险评估量表，综合评价其作为PD临床预警指标的可能性。将该量表与生物化学、影像学检测指标相结合，建立有助于PD早期诊断的综合指标体系；5、 发表相关SCI收录文章25篇，IF5.0的文章6篇；6、 培养博士后6-8名，博士与硕士生60-65名。拟申请专利1-2项。承担单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院课题负责人：陈生弟课题参加人员：贾建平、张巍经费比例：16.3%课题5：帕金森病预警、早期诊断与干预的新策略研究主要研究内容：研究PD相关基因的预警价值；研发针对PD患者NMS的诊断技术和方法，评价其对PD早期诊断的价值；研究PD早期诊断的生物标记物；研发PD影像学分子探针。同时，研究PD干预新策略，包括以GSK-3/作为靶标的研究；对中药单体T10/天然海洋药物海带褐藻硫酸酯/中药提取物远志皂苷的神经保护作用机制，为研发具有神经保护作用的药物奠定基础；以及对iPS 细胞转化的神经干细胞在PD细胞治疗和抗 PD 药物筛选中的应用研究。以期对PD的预警、早诊和干预提出新的策略。研究目标：（一）PD病的预警、早期诊断1、获得PD早期诊断的生物标记物（血清-SYN、LRRK2、DJ-1 抗体/蛋白）；2、通过分子设计、化学合成，制备系列小分子化合物及其125I和18F标记物等手段，完善神经退行性疾病分子影像技术平台，研发出具有自主知识产权的PD影像学诊断分子探针：（1）完成 18FAV-133 、99mTc-Trodat-1及G964申报新探针药物的各项临床前研究并进行新药临床研究申报；（2）研究设计针对-SYN蛋白和5-HT能神经元的受体及转运载体新的分子探针，评价其对PD，帕金森病痴呆和路易体痴呆（Dementia with Lewy Bodies）诊断和鉴别诊断的价值。（二）PD病的干预新策略研究1、揭示GSK-3/促神经元死亡和介导PD发生的本质，为确立GSK-3/为PD的治疗新靶标提供科学依据；2、明确PD防治候选药物在多种PD模型中的神经保护作用；揭示药物对神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的作用及其发挥神经保护与神经营养作用的靶细胞；探讨PHOX/MMP9/JNK3与药物神经保护作用之间的关系，确定药物作用靶点和信号转导机制，为开发PD防治新药或复方药物提供可选择的分子靶点；3、建立具有特定遗传缺陷 PD 患者的 iPS 细胞模型，用于研究 PD发病机制及药物筛选；建立iPS 细胞移植治疗 PD 猴模型的新技术，为临床 iPS细胞治疗PD患者奠定实验基础。（三）发表文章、人才培养和专利1、发表SCI论文30-40篇；2、培养博士后6-8名，研究生80-85名；3、申请专利3-5项；争取1个药物进入“新药临床前研究”阶段。承担单位：中山大学课题负责人：黎明涛课题参加人员：周江宁、朱霖、段维明经费比例：21.7%各课题之间相互关系研究方案与技术路线：课题1：老化、遗传及环境因素在帕金森病发病中的作用及机制研究随访动态对比PD风险基因突变或多态性筛查中国人群PD风险基因位点社区老年人群PD患者高风险低风险风险变异携带者未携带者临床、影像、嗅觉综合评估临床表型影像改变治疗反应疾病进展遗传因素对发病风险的影响风险基因对表型和疾病进展的影响基因-环境-老化相互作用规律多位点联合分析风险基因相互作用模式涉及多风险基因的分子通路风险基因突转基因猴模型风险基因和环境因素对多巴胺神经元影响机制风险基因变异与环境因素相互作用参与PD发病的分子机制随访环境暴露因素调查环境因素干预课题2：黑质多巴胺能神经元选择性变性的特征及机制研究DA能神经元选择性死亡PD所致特异性异常修饰（磷酸化、SUMO化）线粒体功能障碍蛋白异常聚集铁离子选择性聚集铁离子摄入和转出障碍黑质/腹侧被盖区差异表达蛋白HSP22等黑质对损伤的易感性增高易感性增高已知的差异表达的蛋白PD致病蛋白(DJ-1等)与3组交叉：胶质细胞的作用选择定位于线粒体基因敲除或转基因免疫组化Co-IP/基因敲减基因敲减细胞共培养铁离子测定常规染色细胞共培养课题3：神经元-胶质细胞相互作用在帕金森病发生发展中的作用及机制研究MPTP/MPP+/6-OHDA/LPS/Lactacystin 胶质细胞-神经元共培养体系基因敲除鼠/野生鼠胶质细胞-神经元共培养体系基因敲除鼠/野生鼠胶质细胞-神经元共培养体系 NGF/BDNF等营养因子ProNGF/ProBDNF等前体分子 PHOX/ MMP9 Kir6.1 K-ATP通道 线粒体抑制剂p75-Trk神经元 胶质细胞存活 p75-sortilin凋亡线粒体损伤氧化应激PP2A/JNK凋亡/自噬课题4：帕金森病非运动症状发生机制及早期临床预警指标的研究全身单胺能神经元功能障碍与NMS发生的关系利用PD患者及健康社区老年人群队列回顾性病例-对照研究前瞻性追踪研究了解PD病人NMS的分布及其与关键风险基因、环境暴露、疾病进展和药物疗效反应的关系NMS对PD早期预警和诊断的敏感性和特异性通过对有NMS的老年人群追踪观察PD发生的风险及其与遗传和环境因素交互作用的规律和特点动物模型（食蟹猴和转基因鼠）关键基因探索建立基于NMS的PD患病风险评估量表老 化环境因素帕金森病NMS研究课题5：帕金森病预警、早期诊断与干预的新策略研究PD（非运动症状）脑脊液、血液PD早期特异性功能改变1、PD的预警、早期诊断针对-SYN蛋白和5-HT能神经元的探针设计与研究蛋白质组学、蛋白芯片筛选新标记物及已有的-SYN、LRRK2、DJ-118FAV-133、 99mTc-Trodat-1及G964临床前研究研究临床大样本验证功能影像学检测早期诊断2、PD的干预新策略研究DA神经元变性死亡iPS 诱导 增殖、扩增T10、褐藻多糖硫酸酯、远志皂苷、姜黄素切割及磷酸化如何调控GSK-3体外分化成PD疾病模型获得PD治疗新靶点新药物PD动物模型PD猴模型GSK-3如何稳定BimPHOX/MMP9/JNK3通路变化DA能神经细胞行为学变化，脑组织形态学变化为细胞移植治疗提供新理论PD患者iPS 诱导 增殖、扩增进一步阐明PD发病机制PD发病机制/药物靶点筛选研究特色及创新点：本项目在原973项目工作的基础上，结合国际PD研究的前沿科学问题，以转化医学理念为本，充分发挥我们临床基础相结合的团队和资源优势，进一步深入研究PD发生发展机制及防治新策略，其主要特色和创新点是：1、 新视角：从临床实际出发，将PD视为“由运动和非运动症状组成的一种全身性疾病”；系统研究非运动症状与运动症状的相互关系及其产生机制，不仅有助于更加全面的认识PD发病机制，还可以为PD的早期诊断和系统治疗提供理论依据。2、 新假说：将DA能神经元特异表达蛋白、线粒体功能障碍、金属离子特异性聚集和不同类型胶质细胞交互作用等前期工作的新发现有机融合，提出黑质部位神经元-胶质细胞网络相互作用的研究理念，系统揭示PD多巴胺能神经元选择性、进行性变性死亡的机制。3、 新体系：汇集国人特有风险基因、生物标记物、临床非运动症状和影像学新探针等综合指标，通过本项目的充分验证，形成较完善的PD早期预警和早期诊断的综合体系。4、 特色资源：充分利用已经建立的、具有国际领先水平的全国多中心PD患者和社区老年人群队列临床数据库和样本库，保证本项目研究工作的创新性和整体性。可行性分析：本项目是在原973项目主要研究工作的基础上，经过分析该领域国内外研究现状后提出的，具有扎实的工作基础和理论基础，有较强的目的性和可行性。主要研究基础包括：在PD的病因学研究中：（1）建立了3000多例PD全国多中心临床数据库、样本库，建立了12000人的社区老年人群队列；（2）发现多种基因突变/多态性可能会增加个体的PD发生风险；（3）初步证明了某些基因位点分型及其与吸烟、饮茶、农药接触、脑外伤等环境暴露因素对PD发病风险的影响；（4）建立了-Syn基因转染猴模型和毒素暴露食蟹猴模型；（5）研究了老化对正常猴DA能神经元以及人脑黑质-SYN和TH表达的增龄性变化。在DA能神经元选择性和进行性变性死亡机制的研究中：（1）用蛋白质组学技术，已在PD患者黑质中找到多个差异表达的蛋白质；（2）在 PD动物模型黑质DA能神经元中，发现铁过度聚集的新机制；（3）发现-SYN在线粒体的异常聚集是导致线粒体功能障碍的新机制；（4）初步揭示了神经元-胶质细胞网络中的Kir6.1、Kir6.2/K-ATP通道、PHOX 、MMP9、proNGF、proBDNF等关键分子异常可导致DA能神经元生存稳态的改变及进行性变性死亡。在NMS的相关研究中：（1）发现NMS在PD中具有高发生率，并与临床进程相关；（2）发现PD模型猴黑质以外的、与NMS发病相关的神经元内存在较高水平的-SYN；（3）利用上述样本库，对PD-NMS的相关性进行了初步研究。在早期诊断和干预策略领域研究中：（1）已设计合成了靶向DAT及 VMAT2的具有自主知识产权的新化合物，并已基本完成临床前研究，具有良好应用前景；（2）已发现多种具有抗PD作用的候选药物和若干潜在的药物作用靶点；（3）已建立了诱导iPS细胞的慢病毒体系及体内外诱导神经干细胞向DA能神经元分化的方法体系。参加本项目的学术骨干绝大多数参与了原973项目的研究工作，并且根据研究工作的实际需要，增补了新生力量，使研究队伍更趋合理，基础和临床搭配得当。他们都是全职在国内工作的、精力充沛的中青年研究工作者，对科学研究态度积极，注重创新，是我国在PD研究领域中的中坚力量，均多年从事PD基础和临床研究，已建立了相关的研究体系和技术平台，技术方法全面，主要仪器设备齐全，对本项目的开展起积极推动作用。本次973项目是原973项目的延续。原973项目在科技部的领导下，在领域专家组的直接支持帮助下，充分发挥项目专家组的引领作用，项目组内已经形成了良好有效、团结奋进的协作氛围，建立了高效完善的管理监督体系，秉承了实事求是的科学精神。经过五年的磨合，已经具备了很大的凝聚力，为新项目的完成奠定了坚实的团队基础。总之，本项目已具备了完成预期目标的可行性。四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 研究相关基因各个多态位点的独立或联合效应；研究环境暴露对携带风险基因的患者和健康对照在PD发病中的作用；在老化食蟹猴模型，观察PD致病基因（GBA, -Syn, LRRK2）表达的增龄性变化。2. 纯化Hsp22 Tg与 knockout 小鼠；研究DA受体对DA神经元变性的作用；PD相关蛋白表达载体构建；Knockdown实验研究Omi、Parkin和PINK对线粒体复合物I活性的影响和抑制作用；观察激活的PKC亚型，以及PKC激活引起的IRPs的磷酸化水平，并在IRP1/IRP2基因敲除的动物上进一步证实上述研究内容。3. 应用Kir6.1敲除鼠，制备MPTP-PD模型；体外建立神经元-胶质细胞共培养体系；在MPTP/6-OHDA/Lactacystin建立的PD动物模型中神经营养因子合成、及其p75-Trk神经保护途径；建立PINK1和-Syn基因异常表达的细胞及动物模型。4. 在已建立的PD和社区老年人群队列中，通过回顾性病例-对照研究，分析PD患者各种NMS分布特点及其相关基因（Tau、-Syn或LRRK2）和环境因素，了解其与PD疾病进展、预后以及药物疗效反应的关系；建立各种动物与细胞相关模型。5. 显像探针的临床前药学研究；-SYN蛋白和5-HT能神经元的受体及转运载体显像的新分子探针的设计合成；以GSK-3/为靶点研究其在PD发病中的作用及其抑制剂的治疗作用；在PD模型中观察中药疗效；完善iPS细胞的诱导、增殖、向神经干细胞分化、神经干细胞分选和体外扩增的方法体系。1. 阐明中国人PD独特的风险基因变异之间的相互作用方式；得出上述基因在PD早期预警和早期诊断中的作用；初步揭示特定风险基因突变/多态性与特定环境因素及老化之间的交互作用规律；阐明PD致病基因及其编码蛋白的增龄性变化与PD敏感脑区线粒体功能之间的关系。2. 对Hsp22的作用做出初步评价；确认DA受体的作用，并研究胶质细胞相关的细胞机理；获得-SYN、DJ-1、Omi、Parkin和PINK的野生型和突变体的表达载体及稳定表达细胞系；建立Knockdwon体系并进行功能研究；IRPs的异常激活是通过PKC的活化进而引起IRPs的磷酸化所致。3. 建立PD模型及共培养体系。基于脑内Kir6.1/K-ATP通道对星形胶质细胞、小胶质细胞和神经干细胞的调节，阐明PD时DA能神经元选择性损伤的细胞和分子机制；初步阐明PD动物模型黑质-纹状体系统星形胶质细胞和小胶质细胞活化对p75-Trk、p75-sortilin细胞生存和凋亡途径的影响问题；证实PINK1和-Syn基因异常表达与胶质细胞活化的关系。4. 完成各种NMS相关问卷的准备工作，并完成在社区人群和PD队列中环境因素分组与基因分型，了解PD患者各种NMS分布及其关键风险基因、环境暴露、疾病进展和药物疗效反应的关系；完成建模体系。5. 按照SFDA放射性新药申报要求完成99mTc-Trodat-1和18FAV-133的各项试验；明确GSK-3/ Ser21/9磷酸化与PD发生的关系及GSK-3多肽抑制剂对PD动物的治疗作用；明确药物在多种PD模型中的疗效；确定药物抗炎、抗氧化神经保护机制；建立稳定的iPS细胞的诱导、增殖、向神经干细胞分化、神经干细胞分选和体外扩增的方法体系。第二年1. 进一步收集PD家系，利用已建立的PD致病基因突变检测技术平台对收集的家系进行已知致病基因的突变筛查，鉴定新的与PD相关的基因和基因突变；比较携带不同风险基因PD患者的临床表型、疾病进展和药物疗效反应的影响；分析PD致病基因-Syn的磷酸化和硝基化以及LRRK2磷酸化对衰老过程中线粒体功能的影响。2. 研究HSP22的作用机理；研究vav在DA神经元的表达和水平的差异对其易感性的影响；Omi、Parkin和PINK对自噬的调控作用；铁代谢相关蛋白在神经元和胶质细胞中的表达异同；小胶质细胞对其他胶质细胞以及DA神经元铁代谢功能的影响。3. 应用Kir6.1敲除鼠，研究PD时脑内神经再生的调节作用及其机制；应用星形胶质细胞Kir6.1条件敲除鼠，制备MPTP-PD模型；分别应用内外源性神经毒素MPTP/6-OHDA/LPS建立炎症和氧化应激PD动物模型；研究星形胶质细胞的BDNF等神经营养因子合成分泌、DA能神经元和DA前体细胞的保护效应、p75-Trk介导途径、及其细胞内信号转导机制；检测Bcl-2上游分子PP2A或JNK对胶质细胞的活化的影响。4. 通过前瞻性研究，对社区老年人群进行风险分层，并对具有相关因素风险的个体进行NMS相关随访并进行大规模基因多态性研究，分析其遗传特点；对建模后的动物进行病理标记物与行为学观察。5. 显像探针的临床前药理药效学研究；建立新探针的生物评价方法与筛选方法；评价calpain切割GSK-3这一事件在PD发生中的作用；体外建立神经元-胶质细胞共培养体系，观察药物对神经元的营养、对小胶质细胞和星形胶质细胞激活的作用；定向诱导iPS细胞定向分化为DA能神经元。1. 发现1个新的与PD相关的基因和基因突变；得出携带不同风险基因对PD患者临床表型、疾病进展和药物疗效反应的影响的相关数据；阐明PD致病基因编码蛋白的修饰对线粒体功能影响的机制。2. 获得HSP22的作用机理；确定vav在DA神经元易感性中的可能的作用；获得自噬相关的的表达载体以及建立EFGP-LC3稳定表达细胞株，和自噬调控蛋白EGFP-Hax-1、EGFP-Bcl-xl及EGFP-Beclin-1的稳定表达细胞株；明确Omi、Parkin和PINK对损伤线粒体的自噬清除与否以及其对自噬相关蛋白的影响；小胶质细胞内铁的水平影响其活化与功能。3. 阐明Kir6.1/K-ATP通道对星形胶质细胞的功能调节及其与PD的相关性；明确PD时黑质-纹状体系统中小胶质细胞和星形胶质细胞的激活和分布，及其激活与神经元损伤的先后时间关系及相互作用；明确PD脑内免疫异常和氧化应激水平的改变；阐明活化星形胶质细胞通过其释放BDNF等神经营养因子、激活p75-Trk途径和下游细胞内信号、发挥其DA能神经元的神经保护效应机制；明确PINK1和-Syn对胶质细胞活化的信号通路。4. 明确NMS老年人群中，NMS与环境、遗传交互作用的规律和特点；确定其在PD早期预警和早期诊断中的作用和意义；发现不同风险等级的社区老年人群；建立不同年龄段动物模型的病理组织库。5. 按照SFDA放射性新药申报要求完成显像探针的药理药效学研究；筛选所合成的新探针；.明确calpain切割GSK-3这一事件在PD发生中的作用并获得PD治疗短肽；阐明药物的神经营养和神经保护作用机制是否与抑制小胶质细胞激活、放大星形胶质细胞营养作用有关，初步明确药物作用的靶细胞类型；稳定获得iPS细胞定向分化来的DA能神经元。第三年1. 筛选、随访追踪社区人群中携带易感基因或暴露环境危险因素的个体；进一步收集PD家系，利用已建立的PD致病基因突变检测技术平台对收集的家系进行已知致病基因的突变筛查并鉴定；在不同年龄模型猴研究环境毒素（MPTP、鱼藤酮）对PD致病基因及编码蛋白表达以及化学修饰的影响，研究上述蛋白与环境毒素相互作用对线粒体功能的影响及其机制。2. 研究vav在DA神经元选择性变性中的作用和机理；进一步深入探讨Omi、Parkin和PINK调控的保护作用的信号通路；应用细胞和动物模型研究环境因素（农药及药物）对Omi、Parkin和PINK作用的影响；星形胶质细胞释放的神经营养因子对神经元铁代谢的影响。3. 继续研究Kir6.1敲除对星形胶质细胞释放D-Serine/ATP/Glu等胶质递质传递的影响及其与PD的相关性；应用小胶质细胞Kir6.1敲除鼠，制备MPTP-PD模型；分析调控PHOX/MMP9表达和功能的信号转导机制；研究活化小胶质细胞的proNGF、proBDNF等神经营养因子前体分子的合成分泌、诱导DA能神经元凋亡作用、p75-sortilin途径、及其细胞内信号转导机制；通过检测LC3-II的水平，确定自噬水平与胶质细胞活化的关系。4. 对风险人群进行进一步随访；对建模动物进一步观察；以不同龄动物（食蟹猴和转基因鼠）为模型，分析嗅球、脑干相关神经核团、肠道及心脏自主神经中-Syn等关键基因的改变，及其与NMS的变化关系。1. 初步完成对选定社区人群易感基因和环境危险因素暴露的调查情况，掌握易感或高危人群；争取发现1-2个与PD相关的风险基因或多态性；证明环境毒素如何在衰老基础上加重PD致病基因编码蛋白的修饰和对线粒体功能的影响与机制。2. 力争在hsp22研究中取得成果发表论文；发表可从信号通路角度阐述Omi、Parkin和PINK的作用机制，明确激酶信号通路；阐述环境因素对PD相关蛋白引起的多巴胺能神经元的损伤的影响机制；星形胶质细胞通过神经营养因子BDNF影响神经元铁代谢。3. 阐明Kir6.1/K-ATP通道对胶质递质释放及其胶质传递的调节在PD发生发展中的作用；阐明Kir6.1/K-ATP通道对小胶质细胞介导的免疫炎症的调节及其与PD发生发展的相关性；确定PD时PHOX/MMP9的表达以及在黑质-纹状体系统中的分布是否与小胶质细胞激活程度一致；阐明PHOX/MMP9受MAPKs/NF-kB信号转导通路调控的机制；阐明活化小胶质细胞释放proNGF、proBDNF等前体分子、激活p75-sortilin途径和相关下游信号、诱导DA能神经元凋亡的作用；明确-Syn和PINK1引起氧化应激和自噬与胶质细胞活化的关系。4. 初步分析不同风险等级人群出现NMS及PD的情况；初步分析建模动物病理变化与NMS之间的相关性；研究-Syn等关键基因与年龄、以及NMS三者之间的关系。第四年1. 继续筛选、随访追踪社区人群中携带易感基因或暴露环境危险因素的个体；进一步收集PD家系，利用已建立的PD致病基因突变检测技术平台对收集的家系进行已知致病基因的突变筛查并鉴定；研究上述基因编码蛋白在外周血的增龄性变化以及与PD病理进展之间的关系；进一步在环境毒素所致PD模型猴研究中判定上述蛋白在外周表达的变化作为PD早期诊断标志物的可能性。2. 开展GSTO1与选择性退变机理的研究；建立DJ-1的SUMO化位点突变动物/细胞模型，明确作用靶位，在此基础上筛选促进损伤线粒体清除的化合物；iNOS的激活对胶质细胞参与神经元铁代谢的影响。3. 继续研究Kir6.1敲除对小胶质细胞活化、致炎因子生成与释放的影响及其与DA能神经元损伤的相关性；应用神经干细胞Kir6.1条件敲除鼠，研究Kir6.1/K-ATP通道对PD时脑内神经再生的调节及其相关的信号转导机制；在PHOX/MMP9基因敲除鼠中观察MPTP/6-OHDA/LPS对DA能神经元损伤、DA含量和动物行为学的影响,检测胶质细胞激活、炎症反应和氧化应激水平的变化；研究干预p75-Trk、p75-sortilin途径作为神经保护治疗新靶点的价值、及其相关的表达调控因素和激活机制；检测不同时间点自噬的信号通路Beclin-1，mTor的变化与胶质细胞活化的时相关系。4. 对风险人群进行NMS和PD终点随访对建模动物进行终点观察；利用-Syn基因转基因鼠及毒素暴露鼠模型研究-SYN与环境毒素（百草枯或鱼藤酮）的相互作用关系对NMS的影响，在原代细胞及动物水平上研究其作用机制。5. 显像探针自动化合成标记SOP的完善和应用研究；新探针的放射性标记方法研究与应用；阐明GSK-3/调控Bim稳定性的机制及其在神经元死亡/PD发生中的作用；在急性和长期动物实验中，检测药物有效剂量对重要组织器官的毒性作用，并系统进行药物毒性、药代动力学研究；建立携带特定基因突变PD患者的iPS细胞模型，研究细胞变性死亡机制和筛选抗PD药物。1. 对社区人群中存在危险遗传基因和环境暴露个体进行检查和确诊；争取发现1-2个与PD相关的风险基因或多态性；证明PD致病基因编码蛋白在外周血的变化作为PD早期诊断标志物的可能性。2. 力争在vav研究中取得成果发表论文；阐述翻译后修饰对PD相关蛋白的功能影响以及其在疾病发生中的作用；初步获得具有保护作用的化合物；胶质细胞通过iNOS的激活参与神经元铁代谢。3. 阐明Kir6.1/K-ATP通道对神经干细胞功能（增殖、分化、迁移和生存）的调节作用及其与PD神经损伤与修复的关系；明确PHOX/MMP9与小胶质细胞介导的免疫炎症和氧化应激的关系，及其在DA能神经元损伤和PD发生发展中的作用；初步阐明p75-Trk、p75-sortilin分子表达和激活的相关调控机制、及其作为促进DA能神经元生存和抑制凋亡的神经保护治疗新靶点的意义；明确-Syn和PINK1引起自噬活化胶质细胞的信号通路。4. 阐明-Syn基因与环境毒素的相互作用对黑质多巴胺神经元损伤及NMS的作用机制；初步描绘-SYN与环境毒素机制线路；预期随访到200例新发PD与400例出现NMS的个体；预期建立不同年龄段各动物模型不同部位组织样本库。5. 确定显像探针自动合成工艺；明确药物有效剂量的毒性范围，药物的半衰期、药代动力学特点，为进一步的药物开发奠定基础；初步明确PD细胞变性死亡机制并筛选出抗PD药物。第五年1. 继续筛选、随访追踪社区人群中携带易感基因或暴露环境危险因素的个体；研究候选神经保护剂（如EGCG、姜黄素等）对上述基因及其编码蛋白在外周和中枢表达的影响，分析其保护DA神经元的机制，找出其神经保护作用的靶点。2. 对前一年获得的保护作用的化合物的保护作用在动物模型上进一步鉴定，并探讨其作用机制；调节脑内高铁的药物在脑铁过量聚积选择性损伤多巴胺能神经元致帕金森病的中的作用及其生物学机制。3. 研究MPP+/LPS对各种混合培养体系中DA能神经元损伤的影响及其机制；长时程实时观察Kir6.1/K-ATP通道对胶质细胞-神经元网络的调节作用；体外建立PHOX/MMP9基因敲除鼠黑质神经元-胶质细胞共培养体系，观察MPP+/6-OHDA/LPS对神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的影响，分析相关信号转导通路；应用生物信息学、蛋白功能域分析鉴定和单克隆抗体封闭等技术，进一步研究p75与Trk、sortilin分子相互作用的关键功能结构域、及其作为药物效应新靶位的意义；通过检测线粒体的膜电位（）变化、细胞色素C释放、AIF及Annexin-V/PI的量以明确凋亡与自噬的关系。4. 最终明确PD患者PDD等NMS的发生率、病因、发生机制、与临床进程的关系；了解各因素与PD疾病进展、预后以及药物疗效反应的关系；寻找检测PDD等NMS发生的敏感指标、基因位点及相关量表；综合药物和认知康复的结果，建立系统的干预方案；阐明与NMS发生相关的因素及其机制。5. 显像探针药盒和制剂标准的制定及质量控制研究；对新探针进行动物（模型）显像评价和其它评价。1. 对社区人群中存在危险遗传基因和环境暴露个体进行检查和确诊；发现神经保护剂保护DA神经元的潜在靶点。2. 明确保护作用化合物的功能机制；对线粒体损伤在PD