




已阅读5页,还剩1页未读, 继续免费阅读
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
-本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档,如需本文,请下载-miz1基因siRNA表达载体的构建及影响HeLa细胞对阿霉素的敏感性本文从网络收集而来,上传到平台为了帮到更多的人,如果您需要使用本文档,请点击下载按钮下载本文档(有偿下载),另外祝您生活愉快,工作顺利,万事如意!【摘要】 目的:构建针对转录因子miz1基因的siRNA表达载体,观察其 影响 HeLa细胞对阿霉素的敏感性. 方法 :设计并合成针对miz1基因的siRNA寡核苷酸,克隆入siRNA表达载体,脂质体瞬时转染入HeLa细胞中,用RTPCR检测miz1基因的mRNA表达水平,用 Western Blot检测Miz1蛋白表达水平,用MTT法检测HeLa细胞活力. 结果:DNA测序和酶切鉴定证明针对miz1基因的siRNA表达载体构建成功,RTPCR和Western Blot表明其能降低miz1基因的mRNA表达和蛋白表达. 与对照组相比,转染上述干扰载体后的HeLa细胞,在加入阿霉素12 h后,细胞活力明显降低(P ),并且干扰质粒与阿霉素存在交互作用(P ),以加入阿霉素12 h和24 h后最明显. 结论:针对miz1基因的siRNA能够抑制人宫颈癌细胞系HeLa中miz1基因的表达并能增强HeLa细胞对阿霉素的敏感性. 【关键词】 转录因子Miz1;RNA干涉;转染;阿霉素 0引言 化疗是肿瘤 治疗 的常规手段,拓扑异构酶抑制剂阿霉素作为常用的化疗药物之一,其能引起DNA断裂,诱导细胞凋亡,并且这一作用与靶细胞内某些基因如cmyc的表达水平密切相关. Miz1为Myc相互作用的锌指蛋白,属于POZZF转录因子家族成员1. 目前 发现Miz1能调节细胞的增殖和分化2,并与细胞凋亡密切相关3. 在辐射引起细胞DNA损伤时,Miz1的敲弱可使细胞从G1期阻滞走向凋亡4,当阿霉素引起DNA损伤并诱导细胞凋亡时,Miz1的表达异常可能会影响阿霉素对靶细胞的杀伤效果. 为探讨Miz1的表达与肿瘤细胞对阿霉素敏感性的关系,我们采用RNAi技术,构建了针对Miz1的siRNA的表达载体转染入人宫颈癌细胞系HeLa, 通过半定量RTPCR以及免疫印迹检测内源性Miz1的表达并采用MTT法检测HeLa细胞的活力,为进一步 研究 Miz1影响肿瘤细胞对阿霉素的敏感性机制提供依据. 1材料和方法 材料pSilencerTM H1 neo载体(美国Ambion公司);RNA反转录试剂(美国Promega公司);各种限制性内切酶,T4 DNA连接酶和PCR试剂(美国Gibco公司);DNA提取及回收试剂盒(上海华舜公司);LipofectamineTM 2000(美国Invitrogen公司);Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国LICOR公司);大肠杆菌DH5菌种,人宫颈癌细胞系HeLa(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存);寡核苷酸片段(上海基康生物技术有限公司合成);抗Miz1抗体(美国Santa Cruz公司);IRDyeTM 800红外荧光标记的羊抗兔二抗(美国Rockland公司). 方法 H1 neomiz1基因载体的构建针对转录因子miz1基因的编码区选取19个核苷酸作为siRNA作用靶点,设计并合成两条寡核苷酸片段,5GATCCCGCCTTACCTGTGTGATAAGTTCAA GAGACTTATCACACAGGTAAGGCTTTTTTGGAAA3及5AGCTTTTCCAAAAAAGCCTTACCTGTGTGATAAGTCTCTTGAACTTATCACACAGGTAAGGCGG3,其中GATCC为BamH酶切位点,AGCTT为Hind酶切位点, GCCTTACCTGTGTGATAAG为设计的siRNA 序列,TTCAAGAGA转录后形成发夹环. 将上述两条寡核苷酸片段分别溶于双蒸水中至终浓度为50 pmol/L. 30 L退火体系中加入:10退火缓冲液3 L,两种寡核苷酸片段各 L. 加热至95,于37恒温孵箱内放置2 h. 退火产物与线性化的pSilencerTM H1 neo载体连接,之后转化大肠杆菌DH5,提取质粒,选取载体中的EcoRI酶切位点和克隆片断中的Hind酶切位点进行双酶切,鉴定片段是否插入目的载体中,选取阳性克隆由上海生工生物工程技术公司进行测序,以确定其是否为目的片段. 同时设计非特异性序列:5TTCTCCGAACGTGTCACGT3,与人类基因无同源性,可以作为阴性对照. 细胞转染将人宫颈癌细胞系HeLa以5105/孔接种于6孔细胞培养板, 37,50 mL/L CO2培养箱培养24 h,当细胞长至80%汇合时进行转染. 转染操作方法按照LipfectamineTM 2000说明书进行,转染48 h后收取细胞样品,用于RTPCR和蛋白印迹检测. PCR检测运用软件Primer Premier 针对miz1基因的cDNA设计引物,其上游引物为:5gatgacatggtcacgctggctacc3,下游引物为:5gcatgtgcgaatccacacagccca3,产物为248 bp的片段. 针对gapdh的cDNA设计引物,其上游引物为:5gcctcaagatcatcagcaat3, 下游引物为:5aggtccaccactgacacgtt3,产物为307 bp的片段. 按Trizol试剂盒操作说明提取转染所得细胞的总RNA,紫外分光光度计测定总RNA浓度,取1 g总RNA按照反转录试剂盒说明书进行反转录,并进行PCR扩增. PCR扩增反应总体积为50 L:其中10buffer 5 L, 25 mmolL MgCl2 3 L,10 mmolL dNTP 1 L,Taq聚合酶1 L,模板cDNA 2 L,用于扩增miz1基因cDNA或gapdh基因cDNA的引物各1 L,余下体积用无菌去离子水补足. PCR反应的参数为:94预变性4 min,94 1 min,55 l min,72 min,共25个循环:72延伸5 min. 扩增结束后取PCR产物5 L,在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳,观察并记录结果. 免疫印迹检测转染后48 h收细胞并裂解细胞,取20 g处理后的蛋白样品进行SDSPAGE,电转移至NC膜,50 g/L脱脂奶粉封闭1 h,与11000稀释后的一抗孵育1 h,TBST洗膜,然后与120 000稀释后的红外荧光标记的二抗孵育1 h,TBST洗膜后, Odyssey 红外荧光扫描成像系统 分析 . 法检测细胞增殖取对数生长期的HeLa细胞,于转染前1 d以5104/孔接种于96孔板中,将重组质粒和对照质粒分别转染入细胞中,36 h后往其中一部分转染后的细胞中加入阿霉素至终浓度为2 mg/L,根据是否转染干扰质粒和是否加入阿霉素分成4组:转染干扰质粒+加阿霉素组;转染干扰质粒组和转染对照质粒+阿霉素组;转染对照质粒组. 每组设6个复孔. 继续培养0,6,12及24 h后分别加入5 g/L MTT 20 L,37继续培养4 h,弃去培养基,加入150 L DMSO,酶标仪测定各孔A492 nm吸光度值. 统计学处理:采用SPSS 统计软件进行统计分析,各时间点中各组吸光度值均以xs表示,用析因分析对各时间内各组吸光度值进行
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 北京市市场场地租赁合同附件一4篇
- 约定婚前财产婚后收益协议2篇
- 气候协议执行机制-洞察及研究
- 统编版2025-2026学年三年级上册期末学业水平测试卷(含答案)
- 部队交通安全培训计划表课件
- 河南省驻马店市汝南县一中二中三中联考2024-2025学年八年级下学期3月月考生物试题(含答案)
- 部门安全培训汇报课件
- 迁徙动物导航分子基础-洞察及研究
- 国际标准与区域监管冲突下的人造宝石出口合规性思考
- 四氟苯甲酸衍生物在极端工况下的热稳定性与结构演变关系研究
- 无人机测量课件
- 党务工作论述知识课件
- 科研助理笔试题库及答案
- 小金库案例警示教育
- 自动扶梯应急救援预案
- GJB9001C体系推行实施计划
- 2025年时事政治考试116题及参考答案
- 工伤认定申请证人证言模板
- 红细胞检验的临床应用
- 2024届江西省南昌市高三上学期零模物理试题【含答案解析】
- 南京理工大学介绍课件模板
评论
0/150
提交评论