大肠杆菌质粒转化实验.ppt

质粒提取实验回顾,三大步、七小步、四离心,三溶液及三合一,两注意,大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化,2015.06.20,一、什么是感受态细胞（Competentcell）,细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性改变,成为能允许外源DNA分子进入的状态，处于这种状态的细胞称为感受态细胞。,Naturestate,Competentstate,载体（vector),病毒,质粒,噬菌体,二、什么是转化及与其相似的概念,转导（Transduction),转化（Transformation),转染（Transfection),/users/chagedor/biol_4684/Methods/genes.html,PEI,脂质体，磷酸钙等,载体（vector),病毒,质粒,噬菌体,转化、转染及转导之间的相同及不同,转导（Transduction),/kroberts/Lecture/Chapter%207/horizontal.html,三、如何筛选转化成功的细胞（发扬个性）,抗性筛选,蓝白斑筛选,四、制备感受态细胞的方法,通常制备感受态细胞的方法有两种：电击法和化学法,两种方法比较,电击法制备感受态及转化的原理,+,-,1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的生长期大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。,CaCl2方法的历史,CaCl2方法的历史,赫伯特波伊尔,斯坦利柯恩,StanleyCohen,HerbertBoyer,1973年实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞。,感受态制备及质粒转化,（1）实验材料,E.ColiDH5（无质粒）,（2）实验试剂,p32质粒,（实验五提取得到的质粒）,液体培养基,低渗MgCl2和CaCl2溶液,（1）CaCl2法制备大肠杆菌感受态过程,(大冷),0.5,(小冷),（2）质粒转化（Heatshock),100ul,5,5,（热激+复苏）,（共冷）,100,(0.5ul),10分钟,冰上放置10分钟,加入200微升含有氨苄青霉素的液体培养基中，37摄氏度，复苏30min.,100,（3）质粒转化后的培养及筛选,液培中，将上述液体加到含有氨苄青霉素的固体培养皿中，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀，放置30分钟。,氨卞霉素,(ug/ml),（个/ug）,CaCl2方法制备感受态的原理,1、在“小冷”条件下发生了什么改变？,（1）处于生长对数期的大肠杆菌细胞膜上存在大量的Adhensionzones,（2）低温使得细胞膜的膦脂双分子层的流动性变慢,2、在“大冷”条件下发生了什么改变？,（1）低渗的CaCl2和MgCl2溶液使得细胞发生膨胀,（2）Ca+2离子与细胞膜上的磷酸根离子结合,（3）低温条件下Ca+2会使细胞膜膦脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域。,（4）Mg+2对于Ca+2具有协同作用,质粒转化的原理,3、感受态细胞和质粒共同冰浴时发生什么改变？,（1）质粒DNA可以围绕在感受态细胞周围,（2）Ca+2又与质粒DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在感受态细胞膜的外表面上,4、在热休克时发生什么改变？,短暂的42热脉冲处理，感受态细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，致使细胞膜的通透性增加，质粒DNA分子便进入细胞内，完成转化。,总结,（1）在制备感受态细胞时一定要在低温进行（温度的要求）,（2）在热休克质粒转化的过程中一定要注意快速（时间的要求）,“四步冷、一步热”,重点及思考题,重点：,CaCl2方法制备大肠感受态细胞的原理；质粒转化过程的步骤及关