部分大豆CONSTANS家族基因的克隆和功能分析-硕士论文

分类号 河南农业大学农学学位论文 密级 论文题目：部盆太戛丛呈型巡塞 迭基国的壶隆歪旦功篚分析 英文题目：L Q N 坠i 鱼趔旦里巡! I Q N L N L Y S I SQ S E V E R A LC ( 孙俘7 彳孓L I K EG E N E Sr N 导 专 论文提交 日。期： 学位授予 日期： f J f J J J | f Y 17 2 8 5 n x l n ! 1 6 I Ip l | | 0 1 1 I | 1 。 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 部分大豆C O N S T A N S 家族基因的 学位 文题目 克隆和功能分析级别 硕士研究生 学生学科导师陈新建教授 姓名 张清哲作物遗传育种 专业 姓名傅永福研究院 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月口 研究生签名：弱很准弱虢移导师签名：，锣) 一 日期：矽I 口年莎月，岁日日期沙J 年6 月少日 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。序沁、 研究生签名：l 拄净砚导师签名：肜形刎乡学钕领导签名：0 ， 芝7 日期：晖石1 月，；日日期：沙肆矿月厂鲫日姻年6 赠曲穸J ， 致谢 本论文是在陈新建教授和中国农业科学院作物科学研究所傅永福研究员的 悉心指导下完成的。从论文的课题设计、实施，到论文的撰写等方面两位导师都 倾注了大量的时间和心血，给予了悉心的指导和无私的帮助。陈老师博大精深的 学术功底，细致的治学风格，机智敏锐的科研洞察力，使我获益良多。傅老师渊 博的学识、开阔的思维、严谨的治学作风、执着的敬业精神、无数次的耳提面命 和谆谆教导使我受益终身，这将鼓舞和激励我在以后的学术和人生道路上奋发进 取，勇往直前。衷心感谢傅老师对我的生活无私的关怀和帮助，给了我一个很好 的研究平台，把我带入科研的大门，学生终生铭记。值此论文即将付梓之际，谨 向两位导师致以最崇高的敬意和最诚挚的感谢! 感谢中国农业科学院作物科学研究所大豆分子遗传课题组的成员对我工作 和生活上的鼓励和帮助。感谢实验室胡瑞波师兄和范成明老师教给我一系列实验 技术、实验方法，带我入门，感谢他们为我提供实验材料；感谢吴发强师兄在实 验材料、技术图片处理上给予的无私帮助；感谢陈福禄师兄、肖朝文师兄和张庆 祝师兄在试验和生活中给予的帮助。感谢张文婧师姐和同门学友马锦花硕士在课 题上的协作和帮助；感谢王旭博士在亚细胞定位实验以及其他实验技术上的热情 帮助，使我在学会相应技术的同时也被他耐心教授所感动；感谢张晓玫老师、江 颖师姐、柳霖坡师姐、王雅卉、朱金龙、盂颖师姐、吴卓品师姐的热忱相助。感 谢薛正刚、雷晨芳、李清等师弟师妹、黄国文博士和实验室工作人员贺淑丽、祁 美荣、孙士花在实验过程中给予的帮助。本实验的所有成员共同营造一个轻松、 和谐、温馨的氛围，使我能够J q 页, N 完成硕士论文工作。 感谢陈军营副教授给予我生活上的帮助和工作中的指导；感谢张艳敏、马平 安和王淑丽在我校内生活上的帮助。 特别要感谢的是我的家人，这么多年漫长的求学过程，我的父母在我做试验 期间给予我的理解、支持和鼓励，使我更加勇敢的面对。切凼难。他们在背后的 默默支持和鼓励是我坚强的后盾，是支持我不断向前的动力! 最后，对百忙之中审阅我的论文和参加答辩会的老师们表示深深的感谢! 张清哲 2 0 1 0 6 目录 摘要1 1 文献综述2 1 1 拟南芥的模式植物特性2 1 2 植物的开花调控途径2 1 2 1 光周期开花途径2 1 2 2 其他三个开花调控途径3 1 2 3 植物开花调控途径的交互作用4 1 3 植物C O N S T A N S 家族基囚的特性4 1 3 1C O 的结构、分类和进化4 1 3 2C O 的功能6 1 3 3C O 的表达与调控7 1 4 本课题研究的目的和意义8 2 引言1 0 3 材料与方法1 1 3 1 实验材料11 3 1 1 植物材料11 3 1 2 菌株及质粒11 3 2 试验方法1l 3 2 1 候选基因的确定1 1 3 。2 2 引物设计与P C R 扩增1l 3 2 3 基因的染色体定位1 3 3 2 4 系统进化树的构建1 3 3 2 5 基因内含子夕h 显子结构分析1 3 3 2 6 大肠杆菌感受态细胞的制备1 3 3 2 7P C R 产物的网收与连接反应1 4 3 2 8 连接产物的转化1 4 3 2 9 基凶表达载体的构建。1 5 3 2 1 0 基因的实时荧光定量R T P C R 表达分析1 5 3 2 1 2 拟南芥转化与筛选1 8 3 2 1 3 基因枪轰击法进行亚细胞定位1 9 4 结果与分析2 l 4 1 大豆C O 家族基因的克隆2 1 4 2 大豆C O 家族基因的生物信息学分析2 1 4 3 大豆C O 家族基因的结构和染色体定位2 5 4 4 1G m C O L 3 基因的表达模式2 5 4 4 2G m C O L 3 蛋白的亚细胞定位2 8 4 4 3G m C O L 3 在拟南芥巾过表达的表型分析2 8 4 4 4G m C O L 3 过表达植株的开花时间测定2 8 4 5G m C O L 4 基因表达模式与功能分析3 0 4 5 1G m C O L 4 基因的表达模式3 0 4 5 2G m C O L 4 在拟南芥中过表达的表型分析3 2 4 6G m C O L 5 基囚表达模式与功能分析3 2 4 6 1G m C O L 5 基因的表达模式一3 2 4 6 2G m C O L 5 蛋白的亚细胞定位3 3 4 6 3G m C O L 5 在拟南芥中过表达的表型分析一3 4 4 7G m C O L 6 基因表达模式与功能分析3 4 4 7 1G m C O L 6 基因的表达模式3 4 4 7 2 G m C O L 6 在拟南芥中过表达的表型分析3 6 4 8G m C O L 7 基因表达模式与功能分析3 6 4 8 1G 朋C 观7 基因的表达模式3 6 4 8 2G m C O L 7 在拟南芥中过表达的表型分析3 8 5 结论与讨论4 0 5 1 讨论4 0 5 1 1 大豆的C O 1 i k e 家族基因4 0 5 1 2 大豆C O - l i k e 的表达模式4 1 5 1 3 大百C O l i k e 基凶具有不l J 功能：4 2 5 2 结论：4 3 参考文献4 4 I I 摘要 在模式植物拟南芥( A r a b i d o p s i st h a l i a n a ) r 仁鉴定出4 条开花调控途径，而光周期开花途径 是其中之一。该途径整合光信号( 包括光暗周期、光谱、光强和光的持续时间) 来介导植物开 花。C O N S T A N S ( c o ) 是光周期开花途径中的一个关键基因，处在生物节律钟基因和开花基 因之间。C O 编码一个在氨基端有2 个锌指结构域( B b o xI 和I I ) 和在羧基端有1 个C C T ( c o ， C O L i k e ，T O C l ) 结构域的蛋白。拟南芥C O 家族有1 7 个成员，依据其功能域特征分为3 个亚组。 为了研究C O 在大豆开花中的功能，我们用R T P C R 的方法从大豆垦农1 8 , - 0 克隆到了2 3 个C O 1 i k e 基因，分别命名为G m C O L l 2 3 。通过生物信息学方法的分析发现其编码的蛋白均 含有2 个保守的结构域_ B b o x 和C C T 结构域。系统进化树分析的结果表明在拟南芥C O 家族 基因中有其对应基因。 同时，以G 脚C 阢3 7 ，G m C D J 3 和G m C O L 2 0 2 3 这1 0 个基冈为目标基因，G 研3 7 为研究的土要研究对象。用q R T P C R ( q u a n t i t a t i v er e a l t i m eR T P C R ，q R T P C R ) 的方法分析了 G m C O L 3 7 m R N A 的表达模式并发现，这5 个目标基因的表达表现出节律性，且主要受生物 节律钟的影响，受光的调节作J 肆j 较弱。组织器官特异性表达分析发现，这5 个目标基因主要 在叶片中表达，且开花期的表达量高丁J 单叶全腱期。结果表明这5 个同标基因是大豆光剧期 丌花调控途径中的重要基因。用基因枪轰击法，对G m C O L 3 和G m C O L 5 蛋白的业细胞定位做 分析，发现这2 个蛋白定位在细胞核内，与拟南芥C O 的定位一致。 本文结果为迸一步研究大豆C O 家族基闪的功能和大亚分子育种提供了重要的依据。 关键词：C O N S T A N S ：生物节律钟；光周期开花途径：开花：大豆 面存在很大差异。在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是L a n d s b e r ge r e c t a ( L 们、 C o l u m b i a ( C 0 1 ) 、W a s s i l e w s k i j a ( W s ) ，其中C o l 生态型用于拟南芥的全基因组测序。 拟南芥具有基因组小、染色体数目少、世代周期短、个体较小、生长发育的快、生命周 期短、结籽多、生活力强易栽培等优点，利于对其基因的克隆和室内种植。2 0 0 0 年，拟南芥 成为植物界第一个被完整测序的物种 2 】，5 条染色体总共含约1 1 5 亿个碱基对，尽管基因组小， 拟南芥的2 5 万多基因在功能类别上却和其他开花植物大致相似。并且拟南芥足白花授粉植 物，基因高度纯合，因而有利丁其基因的克隆和饱和突变体库的建立，所有这些都使得拟南 芥成为一种特别理想的遗传学和分子生物学研究材料，广泛用于植物生命奥秘的研究探索。 1 2 植物的开花调控途径 植物做为同着生物，其生长发育、开花结实都只能在一个地点完成，而其生长的环境却 不是一成不变的，这使得植物需要及时对变化的环境做出反应。植物的生长发育f i 但受环境 影响，还受到自身发育程度的调控。这两个因子的相互作用决定了植物的发育是一个可塑性 很强的过程。植物的整个生命蒯期中，成化转变是其生命周期中重要事件之一。开花是植物 由营养牛长向牛殖牛长转变的标志，受复杂的信号途径的调控。对模式植物拟南芥的研究表 明，植物开花受p q 个截然不同的信号途径的调控，即光周期开花途径( p h o t o p e n o dp a t h w a y ) 、 春化途径( v e r n a l i z a t i o np a t h w a y ) 、赤霉素途径( G Ap a t h w a y ) 、自主途径( a u t o n o m o u sp a t h w a y ) 【3 - 5 】。其中自主途径和赤霉素途径是植物内在因素的调控途径，而光周期开花途径和春化途 径是植物对光照和温度条件的反趔6 7 1 。 1 2 1 光周期开花途径 2 0 世纪2 0 年代，W i g h t m a nG a r n e r 等首次提出植物对口照长度的昼夜节律变化作出响应 的现象，称之为植物光周期现象1 8 】。随后，其他的生物体中的光周期反应也被发现【9 】。光周 期是调控植物开他的重要代谢途径之一，是控制温带植物开花的重要因了之一。拟南芥是一 种兼件的K 日植物，在长、短日照条件下均开花，但在短日照条件下比在长日照条件下晚开 花。通过分子遗f 乏学的方法，鉴定出植物在对日长做出反应时所必需的基凶，这些基凶编码 的蛋白有光信号转导途径的元件，涉及到生物节律钟的蛋白和特异调控植物开花的蛋白。这 样光受体( P h o t o r e c e p t o r s ) 、生物节律钟( C i r c a d i a nc l o c k ) 和调节开花的基因这三个组件构成了 光周期开花途径的重要组成部分。 光受体感受不同波长和不同长度的光信号并将光信号传递给内源的生物节律钟。主要由 吸收红光和远红光的光敏色素( P h y t o c h r o m e ，P h y ) t l o l 和吸收蓝光和紫外光的隐花色素 2 ( C r y p t o c h r o m e ，C r y ) 1 1 - 1 3 】以及主要介导蓝光依赖的向光性反应的向光素( p h o t o c h o p i n ) 【1 4 组 成。光敏色素足最甲发现的一种光受体，拟南芥中至少存在5 种：P h y A E ；隐花色素在拟南 芥中已发现了三种：C r y l 一3 ，以及近期研究发现的含有F b o x 的Z T L 也是一种蓝光受体蛋白 1 5 】。前两种光受体对植物开花有影响，而向光素尚未发现与植物开花时间相关报道【1 6 】。 生物节律钟是植物对光周期作出感应的重要组分，它整合光受体传递来的光信号，并将 其转换成新信号，新信号通过信号输出途径传递给生物钟的卜游基因。科学家们曾针对“植 物如何区分黑夜和白天? ”这个问题提出了内吻合假说( i n t e r n a lc o i n c i d e n c e ) 和外吻合假说 ( e x t e r n a lc o i n c i d e n c e ) 。2 0 0 4 年H a y a m a 和C o u p l a n d l 箪 述了生物节律钟与外部光周期信号共同 作用诱导植物开花【1 7 】，从而证明了外吻合假说的成立。通过组成分析预测出拟南芥生物节 律钟至少有3 个连锁反馈环组成( 图1 1 ) 18 ，1 9 】：早晨表达的C I R C A D I A NC L O C K - A S S O C I A T E Dl ( C C A l ) L A T EE L O N G A T E DH Y P O C O T Y L ( L H Y ) 和P S E U D OR E S P O N S E R E G U L A T O R7 ( P R R 7 ) P R R 9 组成第一反馈环，夜晚达到峰值的T I M I N GO FC A B E X P R E S S I O Nl ( T O C l ) 和假设的生物钟Y 元件构成第二反馈环，第三反馈环与前两个反馈环 负反馈调节，是由C A A l L H Y 和T O C l 所组成1 2 0 。T O C l 蛋白在早晨间接地诱导C C A l 和L H Y 的表达，这两个蛋自结合到阳C ，启动子上抑制其表达1 2 ，接着大部分T O C l 蛋白在黄昏时 由Z T L 蛋白降解t 1 5 ，2 2 】：深夜T O C I 的表达达到高峰，从而又激活C C z J 和三舢表达2 ，进而 构成了复杂的第三反馈环。 G I G A N T E A ( G 1 ) 处于生物节律钟和调节歼花的基因之问，是生物节律钟输m 途径中的一 个火键基因拉川。g i 突变体开花延迟，而J t L H Y 不H C C A l 的昼夜节律表达模式明显改变，表明 凹在启动植物开花和维持牛物钊r 的节律性上有作用。此外，a 还有其他的功能：在光形态 建成和牛物钭t 中央振荡器的反馈调节上有功能【2 3 - 2 8 1 。G ，在牛物钟上的功能是近期提出的， 其蛋白与Z T L 蛋f 相互作用导致生物钟组成元件之T O C l 蛋白的降解【1 5 , 2 1 】。 调节开化的基因目前研究的比较多的是C O N S T A N S ( ) 、F L O W E R I N G L O C U S T ( F T ) 、 S U P P R E S S O RO Fo y E R E 艘R E S S l o NO FC O N S T A N Sl0 s o c l ) 、L E A F Y q F Y 、昶A P E T A L Al ( A P l ) 。C O 在光周期开花途径中起着重要的作用。在茎尖，F T 与b Z I P 转录因了F D 形成蛋白 复合体，激活花分生组织基因A P l 的表达【2 9 ，3 0 1 。腿开花时间和花分生组织基凶，在拟南 井花的发育中起着重要的作用 3 1 , 3 2 】。 1 2 2 其他三个开花调控途径 春化途径：植物放置在低温条件下。段时问可以诱导开花，将这种低温刺激和处理过程 称为春化作用。不同物种对这个处理的敏感性不一样，拟南芥的许多品种在没有经历过低温 处理就会晚花，但置于低温4 8 周后就会早花【 引。自然条件下，过冬生长的植物一般都需要 低温处理后才开花。它们具有典型的特征：夏季丌始萌发，通过整个冬季直到春初才开始营 养生长，之后转入生殖生长，通常在春季或者夏季对日长作出开花响应【3 4 1 。F L O W E R I N G L O C U SC ( F L o 编码M A D S - b o x 转录因子，是春化途径的一个关键基因，在拟南芥成花转变 3 中起抑制作用，触突变体表现为早花表型【3 5 3 6 1 。 自主途径：一些拟南芥的开花突变体在长、短日照条件下均比野生型晚开花，但其对开 花的调控作用独立于春化作用与光周期途径之外，该信号转导途径称为自主途径。自主途径 是通过对一系列晚花突变体研究提出的，在这些突变体中F L C m R N A 表达水平均高于野生型 【3 5 3 6 1 。由此推测，自主途径突变体的晚花表型是由凡C 表达量增I J n 弓l 起的。调控自主途径的 基因目前已发现的有：编码两个R N A 结合结构域和一个W W 蛋白相互作用结构域的F C A ，编 码R N A 结合蛋白的职爿和F L O W E R I N GL O C U SK ( E L K ) 3 7 - 3 9 ，编码含有同源异型域蛋白的 LU M I N I D E P E N D E N S ( L D ) 【柏】。 赤霉素途径：加入外源的赤霉素( G i b b e r e l l i na c i d ，G A ) 可以引起拟南芥早花 4 。G A 还 参与植物其它的生长发育过程，如茎的伸长，种子的萌发和花器官的发育【4 2 】。与G A 途径功 能相关的基因有G A I ( G I B B E R E L L I CA C I DI N S E N S I T I V E ) ，R G A ( R E P R E S S O RO FG A I 一3 ) 和 R G L l ( R G A L I K E ，) 。其他涉及至I J G A 途径的蛋白有P H O R l ( P H O T O P E I L I O DR E S P O N S I V E 1 ) 、F P F l 和S H I 。P H O R l 转移到核内对G A 作出响应。用下J 在成花转变时的茎顶端分生组织 中起到一个正调控的作肘【4 3 1 。而幽f 突变体表型表现出晚花，与G A 缺失突变体相似 4 4 , 4 5 1 。 1 2 3 植物开花调控途径的交互作用 光周期开挖途径、春化途径、自土途径和赤霉素途径彼此独立地对小同的环境信号作出 响应，却又相瓦交汇于调控相同的下游基因的表达来调节开花( 图1 2 ) ，如刀、A P I 和F y 自勺 表达【6 】。L F Y 是最早发现的开化特异基因，对光周期丌花途径和G A 途径作出响应【6 】。，m 表 达量在光周期和自辛途径发牛突变的突变体中下调：在C O 过量表达植株中，F T f l 勺表达被激 活，从而认为F 砬4 条途径的下游起作用【州引。s o c l 突变体在长短F i 条件下开花均延迟，而 过量表达舳C J 能引起早花，并且能够逆转光周期途径和自主途径中基凶突变造成的晚花农 型，表明如C 能够整合来自不同开花途径中的信号并促进开花4 9 ，5 们。 1 3 植物删T A N S 家族基因的特性 C O N S T A N S ( c o ) 基因在响应光周期调节巾起着重要作用，是调控植物开花的重要基因 之一。P u t t e f i l l 等最早报道了拟南芥中的C O 基因【5 2 1 。通过大量的研究发现C O 介于生物节律 钟与下游开花基因之间，将光信号转变为开花信号【53 1 。随着基凶组学和牛物信息学的兴起 和发展，小同物种L J 酐j c o , l = o I 星 o f 4 ” O 爹爹 D a y sa f t e rf l o w e r i n g 拿等荸苓0 对枣 T i s s u e sa n do r g a n s T i s s u e sa n do r g a n s 图4 7G m C O L 3 在不同发育时期和不同器官中的表达模式 A ：在不同组织器官；B ：在不同发育时期：C ：在不同发育时期的种子：D ：存不同发育时期地卜部。样品缩写见表3 - 1 。 F i g 4 - 7S o y b e a nG m C O L 3m R N Ae x p r e s s i o np r o f i l e si nd i f f e r e n tt i s s u e s o r g a n sa n da td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s A ：I nd i f f e r e n tt i s s u e s o r g a n s ；B ：A td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s ；C ：I ns o e d sa td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g 髂；D ：I na e r i a lp a r t sa td i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a ls t a g e s A b b r e v i a t i o n so f s a m p l e sa r ea si nt a b l e3 - 1 4 4 2G m C O L 3 蛋白的亚细胞定位 为了真实的反映G m C O L 3 基冈在人豆体内的定位，构建了其与黄色荧光货I 刍( Y F P ) N - 端融合的表达载体，用大豆幼嫩币叶为受体材料，用基凶枪轰击，进行瞬时表达，对G r n C O L 3 蛋白进行亚细胞定位分析。由图4 1 2 可以看出，大豆G m C O L 3 蛋白定位在细胞核中。 4 4 3G m C O L 3 在拟南芥中过表达的表型分析 将人豆G m C O L 3 摹冈构建过表达载体，转化到拟南芥c 0 2 突变体植株中进行功能验证。 长日照条件下G m C O L 3 基因在拟南芥突变体植株中过表达后导致拟南芥早花现象在T l 代不 明显( 图4 1 8A ) 。 4 4 4G m C O L 3 过表达植株的开花时间测定 在筛选单纯合体的同时统计了过表达植株的开花时间。取3 5 S ： G m C O L 3 c o 一2T 3 2 3 3 、 3 5 S ：G m C O L 3 c o 2T 3 2 3 - 4 、3 5 s ： G m C O L 3 c o 2T 3 2 3 7 帮3 5 S ：G m C O L 3 c o 2T 3 2 3 9 橼， ” ， ：! ： ” ” o 葺。一ssp_lav国oll爵一p鬣 4 2 O 8 6 4 co一2盘越o=嚼一Q配 与野生型L e r 和突变体C O 一2 同时点播在长日照条件和短日照条件下，统计抽苔时莲座叶的 数目来测定开花时间( 图4 8 ) 。 长日照条件下，野生型L e r 抽苔时莲座叶片数为1 0 3 4 - 1 7 4 8 ，突变体c o - 2 抽苔时莲座叶 片数为2 3 2 4 - 3 6 3 0 ，而转化植株3 5 S ：G m C O L 3 c o 一2T 3 2 3 3 、3 5 & ? G 聊C 0 吧3 c D 2T 3 2 3 - 4 、 3 强j G ，”讹D 2T 3 2 3 7 和3 5 受? G 所C 阢3 尼D 一2T 3 2 3 9 抽苔时叶片数分别为1 2 4 士1 9 1 0 、 1 5 5 士3 5 0 2 、1 1 4 士2 9 3 l 和1 3 3 士3 4 2 0 。结果表明，长日条件下，在拟南芥中过表达G m C O L 3 有促进开花的作用，但不能完全恢复拟南芥C O 一2 突变体的晚花表型。 短日照条件下，野生型L e r 抽苔时莲座叶片数为2 5 1 士4 1 6 2 ，突变体C O 一2 抽苔时莲座 叶片数为2 2 3 - 4 - 2 7 8 9 ，而转化植株3 5 S ：G m C O L 3 c o 2T 3 2 3 3 、3 5 & j G m 3 石一2T 3 - 2 3 _ 4 、 3 拇：G i n 3 c o 一2T 3 2 3 7 和3 5 S ：G m c D 3 c o 一2T 3 2 3 9 抽苔时叶片数分别为1 0 5 + 1 3 6 8 、 1 0 6 士0 7 2 6 、1 0 8 i - 0 9 7 1 和1 1 2 5 士1 5 4 4 。结果表明，在短日照条件下，拟南芥中过表达G m C O L 3 有促进开花的作用，且比长日照条件下的作用明显。 长口照条件 癞 夔 缓 缀 l O 8 6 4 2 0 1 0 8 6 4 2 O L 叫豳且k 随盟l ； O5I O1 52 03 0 L J J J J J h 0 ：_ l l l | _ ih h O 短门照条件 L 。l LL l j 量蚴；j 。 1 01 52 02 5弼 O L 龆f a u m l m 5 I O1 52 5如 L f 咖b e r 图4 - 8G m C O L 3 过表达植株的开花时间测定 F i g 4 - 8I d e n t i f i c a t i o no f t h ef l o w e r i n gt i m eo f o v e r - e x p r e s s i o nG m C O L 3p l a I l t s 船抑”m ，o 孽8一譬_冀母聪k拳_I皇E3z 4 2 O b 阳5 O 4 3 2 O lu目一nJoI羔暑llz 4 5G m C O L 4 基因表达模式与功能分析 4 5 1G m C O L 4 基因的表达模式 4 5 1 1G m C O L 4m R N A 昼夜节律性表达分析 根据图4 9 所示结果分析，L D 下，开灯后8h 内，G m C O L 4 的表达量较低，随后逐渐上 升，在Z T1 2 ( 开灯后1 2 ”和Z T1 8 ( 黑暗开始时) 到达峰值，关灯后逐渐降低，在开灯后2h 降到最低。在S D 下，G m C O L 4m R N A 自开灯后开始积累，在Z T1 0 ( 关灯后2h ) 达到峰值，随 后在开灯前4h 达到最低值。比较G m C O L 4m R N A 的表达峰值发现，生长在短日照条件下植 株的G m C O L 4 转录水平高丁生长在长日照条件下的植株。 长日照下的植株转移到L L 和D D 条件下，在L L 第一天G m C O L 4 的m R N A 在开灯后2 h 降到最低，在开灯后8h 内表达量低，随后逐渐积累，这与长日条件下的表达模式相似，表 现出一定的节律性，而D D 条件下的表达规律要弱的多。当短日照下的植株转移到L L 和D D 后，发现G m C O L 4 的m R N A 在连续光照或黑暗第一天表现出短日条件下的节律性，第二天 的这种表达规律就明显减弱。 图4 - 9 不同条件下G m C O L 4m R N A 的表达 A ：在长E J 连续光照( L m u ) 条件；B ：在长口- 连续黑暗( L m D D ) 条件；C ：短日- 连续光照( s 肛L L ) 条件；D ：在短口连续黑暗( s 阻D D ) 条件。 F i g 4 - 9 E x p r e s s i o np a t t e r n so fG m C O L 4m R N A i nd i f f e r e n tc o n d i t i o n s A ：I nl o n gd a y - c o n t i n u o u sl i g h t ；B ：I nl o n gd a y - c o n t i n u o u sd a r k ；C ：I ns h o r td a y - c o n t i n u o u sl i g h t ：D ：I ns h o r td a y - c o n t i n u o u Sd a l k 4 5 1 2G m C 阢4m R N A 在不同组织器官和不同发育时期的表达模式 G m C O L 4m R N A 在不同组织器官表达模式：分析G m C O L 4 在单叶全展期和开花期的1 9 个组织器官中的表达情况后发现，G m C O L 4 在大豆根、茎、叶、花、英中均有表达，其中在 单叶全展期的子叶中表达_ 最比较高，在开花期叶柄中表达量达到峰值。另外，从整体趋势上 看，G m C O L 4 在开花期的表达量明显高于单叶全展期。G m C O L 4 在根中的表达量很低，叶片 中的表达鼍较高，尤其足开花期的单叶、第l 和第2 复叶中的表达量更高；在幼苗、单叶全 展期的茎顶端和未成熟荚中的表达量低于叶片中的表达量。同时，G m C O L 4 在开花期茎中的 表达也比较高。 G m C O L 4m R N A 在不同发育时期的表达模式：通过分析不同发育时期的表达模式发现， G m C O L 4 在不同时期的单叶中第1 复叶全展期的表达量最高；在不同时期的第l 复叶中，开 花期的表达量最高；在不同时期第2 复叶中，开花期的表达量最高；最后其表达峰出现在第 3 复叶全展期第3 复叶。单叶中排除第l 复叶全展期，其他4 个时期中G m C O L 4 的表达量呈 现出递增的趋势。第l 、第2 复叶的不同时期中G m C O L 4 的表达量也出现逐渐升高的趋势。 这与组织器官中的表达模式一致。 进一步分析G m C O L 4 在不同发育时期的种子和地上部分的表达模式，发现G m C O L 4 在 成熟种子中的表达量明显高于未成熟种子，布单叶全展期和第l 复叶全展期地， ：部表达量较 高，而存第3 复叶全腱期地 二部表达量低丁I 开花期的表达量，却高- 丁第2 复叶仝展期的表达 量( 图4 一i o ) 。 1 钿H I “a n do a 扩，矿，r ，、。， T 毓瞄m a do q I - n o ，o ，、t T i 瑚舢a n do 憎m 壕 图4 1 0G m C O L 4 在不同发育时期和不同器官中的表达模式 A ：在小同组织器官：B ：在不同发育时期；C ：在才i 同发育时期的种子；D ：在不同发育时期地上部。样品缩写见表3 - 1 。 F i g 4 - 10S o y b e a nG m C O L 4m R N Ae x p r e s s i o np r o f i l e si nd i f f e r e n tt i s s u e s o r g a n sa n da td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s A ：I nd i f f e r e n tt i s s u e s o r g a n s ；B ：A td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s ；C ：I ns e e d sa td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s ；D ：I na e r i a lp a r t sa td i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a ls t a g e s A b b r e v i 砒i o n so f s a m p l e s 啪a si nt a b l e3 - 1 3 l 圉隧豳翳且腻 盥 毋 d一卜【努一h龃 r”，。： ”m ，。，n 柚oln蓉卷a莆苗譬 差q露墨嚣黑孟釜 錾t隔圈翳弦缓沥臻溺隧鏊蠢隧辫蹦阱孩懿鞋 一 致曝豳嘲豳翰豳翻豳窿爨阪基翰驻阻蠡翻豳翻隧 B 艮 j 目 ： 暑!臻2口蕃譬葛一钲茹 4 5 2G m C O L 4 在拟南芥中过表达的表型分析 将大豆G m C O L 4 基因构建过表达载体，转化到拟南芥C 0 1 0 体植株中进行功能验证。 长日照条件下G m C O L 4 基因在拟南芥野生型植株中过表达后有晚花现象，且种子有败育现 象( 图4 1 8B ) 。 4 6G m C O L 5 基因表达模式与功能分析 4 6 1G m C O L 5 基因的表达模式 4 6 1 1G m C O L 5m R N A 昼夜节律性表达分析 L D 下，G m C O L 5m R N A 在开灯后有一个逐渐积累的过程，Z T4 有一个峰值，之后在 Z T1 6 到Z T1 8 之问有一个峰值( 在长日照条件下的第一天是Z T1 8 达到峰值，而第二天是 Z T l 6 。因为第一天的误差线相对比较大，故不确定获得峰值的时间) 。S D 下，其表达量也 有两个峰值，在Z T4 和Z T1 4 ( 关灯后6h ) 时。比较长、短日照下的峰值发现生长在短日照 条件下植株的G m C O L 5 转录水平相似丁生长在长日照条件下的植株( 图4 1 1 ) 。 长同照卜| 生长的植株转移到L L 和D D 条件下，分析G m C O L 5m R N A 的表达量发现， 连续光照和连续黑暗的第一大表达规律相似，一开始是一个逐渐降低的过程，之后在Z T1 4 有峰值。这似乎表现出一个生物钟自，J 移2h 的现象。短日照卜生长的植株转移到L L 和D D 条件后，连续光照第一天与短U 照条件下的节律陆相似，而连续黑暗条件下的峰值出现在 Z T1 2 ，表现 l 生物钟前移2h ( 图4 11 ) 。 图4 1 l 不同条件下G m C O L 5m R N A 的表达 A ：在长日连续光照( L 口L L ) 条件；B ：在长日连续黑暗( L m D D ) 条件；c ：短日- 连续光照( s 阻L L ) 条件；D ：在短日- 连续黑暗( s D - D D ) 条件。 F i g 4 - ll E x p r e s s i o np a t t e r n so fG m C O L 5m R N Ai nd i f f e r e n tc o n d i t i o n s A ：I nl o n gd a y - c o n t i n u o u sl i g h t ；B ：I nl o n gd a y - c o n t i n u o u sd a r k ；C ：I ns h o r td a y - c o n t i n u o u sl i g h t ：D ：I ns h o r td a y - c o n t i n u o u sd a r L 3 2 1，in_ Ilz0t蒜一oo#口 4 6 1 2G m C O L 5m R N A 在不同组织器官和不同发育时期的表达模式 G m C O L 5m R N A 在不同组织器官表达模式：分析G m C O L 5 在单叶全展期和开花期的1 9 个组织器官巾的表达水平后发现：G 肌C D U 在根和单叶全展期卜胚轴中的表达毒= 很低；在 幼苗、单叶全展期茎顶端、上胚轴、单叶、开花期第4 复叶、花蕾和荚表达量低；在其他组 织中的表达量相对比较高，其中单叶伞展期予叶中和开花期的第l 和2 复叶中表达量很高。 整体上看G m C O L 5 在开花期的表达萤高于单叶全展期，在开花期第l 复叶中达到峰值，且 在开花期的不同复叶中表达量呈递减趋势。 G m C O L 5m R N A 在不同发育时期的表达模式：分析G m C O L 5 不同发育时期的表达模式 发现，其表达量在不同时期的单叶中变化不人，呈轻微递增的趋势：在4 i 同时期第l 复叶中， 表达量随着植株的生长逐渐增加，在开花期第1 复叶中达到峰值；在不同时期第2 复叶中，开 花期第2 复叶中的表达量最高，且是其他时期第2 复叶的很多倍；在不同时期第3 复叶中， 开花期第3 复叶大约是第3 复叶全展期第3 复叶的两倍；在开仡期第4 复叶中的表达量不高。 这与组织器官中的表达模式相吻合。 进。步分析G m C O L 5 在不同发育时期的种子和地上部分的表达模式，发现G m C O L 5 在 成熟种子中的表达量很高，高 H 未成熟种子上百倍；在单叶全展期地上部中高表达，存第2 复叶全展期地上部表达量较低，而在第l 、3 复叶全展期和开花期地上部中的表达量相差不 人( 图4 - 1 3 ) 。 4 6 2G m C O L 5 蛋白的亚细胞定位 为了真实的反映G m C O L 5 基冈在大豆体内的定位，构建了其与黄色荧光蛋( j ( Y F P ) N 端融合的表达载体，用大豆幼嫩单叶为受体材料，用基冈枪轰击，进行瞬时表达，对G m C O L 5 蛋白进行弧细胞定位分析。由图4 1 2 可以看出，大豆G m C O L 5 蚩r 1 定付在细胞核中。 一一一 一一一 “：_ 二，： h “ “儿潮l I 咐啪竹P I H m 吣 5 1 4 t 1 5 Im l 图4 - 1 2G m C O L 3 5 在大豆叶片中的亚细胞定位 F i g 4 - 1 2T h e s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no f Y F P - G m C O L 3 5i ns o y b e a nl e a v e s 矗一珊鼬口删嘲氍譬酬佩 譬哪_删n疆圈删隧蝴强 歹o 穸o 奄拳掌苓鼋苓 T i s s u e sa n do r g a n s B 一 _ 1 霸置圈囊墨置_ 。置墨曩 3 0 暑2 5 呈o 茁 警1 5 o a I O S 0 爹梦 D a y sa f t e rf l o w e r i n g ，矿 T i s s u e sa n do 毽a n s 图4 一1 3G m C O L 5 在不同发育时期和不同器官中的表达模式 A ：在不同组织器官：B ：在小同发育时期：C ：在不吲发育时期的种子；D ：在4 M 发育时期地I | 部。样n L n f 缩弓见表3 - 1 。 F i g 4 - 1 3S o y b e a nG m C O L 5m R N Ae x p r e s s i o np r o f i l e si nd i f f e r e n tt i s s u e s o r g a n sa n d a td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s A ：I nd i f f e r e n tt i s s u e s o r g a n s ；B ：A td i f f e r e n td e v