■基因工程题库版.doc

各种题型确定题目重要题目候补题目不确定答案的题目试卷与题库重复题目名词解释同裂酶（同切点酶）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们来源各异，识别的靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,特称为同尾酶。测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3-5外切酶活性，只有5-3聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶酶解后，其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。6. 星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。（“非最适的”反应条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。)克服星号活性的方法：维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等。7. 载体(vector): 在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工具。克隆载体：主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。主要有：质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、人工染色体（YAC和BAC）。YAC（酵母人工染色体）：是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。BAC（细菌人工染色体）：是基于大肠杆菌（E.coli）的F质粒构建的高通量低拷贝的质粒载体。表达载体是可携带外源基因进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。病毒表达载体：是以病毒基因组序列为基础，插入必要的表达元件所构建成的真核基因转移工具。T-载体：Taq酶的末端转移酶活性可在PCR产物的3端加上一个不依赖于模板的A，根据这一特性，为方便进行PCR产物的直接克隆而开发出T-载体。 Ti质粒（tumor inducing plasmid）：是在根癌农杆菌中发现的可决定冠瘿病（即可诱发寄主植物产生冠瘿瘤）的质粒。大小在200kb左右。12. 粘粒载体：由人工构建的、大小一般在 57kb左右、含有DNA的cos序列和质粒复制子的一类特殊的质粒载体。17.一元载体：含目的DNA的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体。18.双元载体：是指由两个分别含有T-DNA和vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。16. 卸甲载体：将Ti质粒上的T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅保留其两边界及与T-DNA转移所必需的25bp序列而构建成的载体。8.质粒的相容性：是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞，如果能够共存则叫相容又叫亲和。质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象，出现这种现象的原因主要是它们常常共用同一复制系统。9. 转移性：质粒具转移性是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。不含tra基因的质粒则不具备转移性。 T-DNA ：能导入宿主细胞并插入其DNA中发挥作用的Ti质粒部分DNA片段。T-DNA区： 即转移DNA，能转移并整合在植物细胞核基因组上的、决定植物形成冠瘿瘤的一段DNA。LTS和RTS对于T-DNA的转移和整合是不可缺少的。-互补 ：指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶（-galactosidase，由 1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。11. cos序列（cohesive endsite）：DNA分子两端各有12碱基(5-GGGCGGCGACCT-3)的单链互补粘性末端，当噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速按碱基互补配对结合形成双链环状DNA分子。COS位点：当DNA进入细菌细胞后，便迅速粘性末端配对形成双链环状DNA分子，这种粘性末端结合形成的双链区域叫做COS位点.13. 端粒重复序列（telomeric repeat，TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。14. 自主复制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。 22. 多克隆位点：含有紧密排列的多个限制性内切酶识别位点的一段DNA片段。23、分子杂交：是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在及其分子量大小。24、菌落原位杂交：是将菌落或噬菌斑转到固相膜上，原位裂解细胞后使核酸固定在膜上，然后与探针杂交。用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织细胞间期染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。26、真核细胞原位杂交：是一项组织化学与分子杂交相结合的技术，使探针与固定在载玻片上的细胞组织切片内的变性染色体杂交。27、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）：对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，后用原位杂交方法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体（单个细胞增殖形成的细胞群所产生的抗体）来确定该DNA序列在染色体上的位置。28、凝胶阻滞试验：（gel retardation assay）：又叫DNA迁移率变动试验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。26. 盒式诱变：就是用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。这就好象用各种不同的盒式磁带插入收录机中一样，故而称合成的片段为“盒”，这种诱变方式为盒式诱变。27. 定点诱变（寡核苷酸介导；重叠延伸PCR、大引物PCR）：（site-directed mutagenesis）是使已克隆基因或DNA片段中任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失突变的过程。27、体外随机诱变：指随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突变。28、探针：指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列，这些序列在使用之前需标记。29、DNase I足迹试验：DNase I足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。30. 衔接物：是指人工合成的由1012nt组成的、具有一个或数个限制性内切核酸酸识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 此方法适用于没有衔接物限制性内切核酸酶酶切位点的外源DNA片段。DNA接头（人工接头）:是指人工合成的含有限制酶识别顺序的核苷酸片段。人工合成的一类具有某种限制性内切酶粘性末端，另一头为平末端的双链寡核苷酸片段。31. 接头分子连接法（DNA接头连接法）：将具有平末端的外源DNA片段与人工接头分子在T4 DNA连接酶的作用下连接起来；然后与具有同样粘性末端的载体DNA分子在T4 DNA连接酶作用下连接成重组体。 32. 转化（transformation）：把重组质粒DNA导入受体细胞（大肠杆菌、酵母、动植物细胞等）,使其遗传性状改变的过程。转染（transfection）:把重组的噬菌体或病毒导入受体细胞的过程。相互关系：转化一词严格地说是指，感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；而转染一词，则是专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。但从本质上讲，两者并没有什么根本的差别。无论转化还是转染，其关键的因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性，从而使外源DNA分子能够容易地进入细胞内部。33.转化子（transformant）：经转化获得外源遗传物质/DNA的细胞，是向有功能缺陷的细胞补充相应功能。34、感受态（competence）：作为受体细胞的细菌经一定处理 (如冰冷的CaCl2溶液）后处于易于接受外源DNA的状态。35. “选择（selection）” ，是指通过某种外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。“筛选（screening）”则是指通过某种特定的方法，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需要重组DNA分子的特定克隆的过程。 36. 启动子：是RNA聚合酶识别和结合的一段DNA序列，位于基因的上游。是基因表达调控的重要顺式元件，具有以下特征：序列特异性；方向性；位置特异性；种属特异性37.增强子：是能够增强启动子转录活性的一段DNA序列，由多个元件组成，每一个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。38.沉默子(silencer)：是参与基因表达负调控的一种元件（降低转录效率的一段DNA）39.绝缘子(insulator)：既是基因表达的调控元件也是一种边界元件。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。40.衰减子（attenuator）:衰减发生处的一种内部终止子序列。衰减子结构本身不能实现衰减作用，必须借助核糖体与前导序列的结合来发挥其作用。41.终止子:为转录提供终止信号的一段DNA序列，是基因表达的顺式负调控元件。42. 目的基因：指那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段。融合基因：是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸系列的新型基因。报告基因：是指编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组织），是否表达的一类特殊用途的基因。44、报告基因与选择基因的区别： 选择基因往往要与外界存在的筛选压力如抗生素等相互作用，以筛选出被转化的细胞；而报告基因是提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段，它的应用不依赖于外界选择压力的存在。44.代表性差异分析：利用了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线形形式扩增单链模板的特性，设计独特的接头和引物，扣除共有序列，以指数形式扩增特有序列，通过消减和富集，使得目的基因得到特异性扩增的一种基因克隆的方法。48、2m质粒：是酿酒酵母含有一个长度为2微米的内源质粒，它的DNA分子通常与蛋白质结合构成复合物，存在于核区。2微米质粒含有自主复制起始区和STB区，STB系列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。49、mRNA差异技术：也是利用基因在一些组织或器官中的特异表达的原理，将两种组织的mRNA提取出来，通过反转录和进行电泳，找出差异的带。50、动物生物反应器：从转基因动物体液或血液中收获基因产物即是所谓的动物生物反应器。51、转基因动物：指用人工的方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因整合，并随细胞的分裂而增殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。52、原位PCR：是指对组织、细胞中特异DNA或RNA进行扩增，然后再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法。不需抽提组织细胞中的核酸，形态结构不被破坏；与探针原位杂交相比，灵敏度一般可提高100倍左右。反向PCR：用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。平台效应：在PCR反应后期，产物的积累按减弱的指数速率增长。原因： 底物浓度因消耗而降低，dNTPorprimers，掺入速度减慢； dNTP或酶的稳定性下降末端产物抑制（焦磷酸、dsDNA）非特异性竞争（非特异性引物或引物二聚体）特异性产物自身复性（10-8M）高浓度产物下，变性不彻底。RAPD技术：是建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板,以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10nt)为引物,在Taq酶作用下,进行PCR扩增。AFLP：以PCR为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3端有3个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力聚丙烯酰胺凝胶电泳进行PCR产物分离分开这些扩增产物，从而产生DNA指纹，用荧光法或银染染色法均可检测之。RT-PCR：以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应，可用于测定基因表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，克隆mRNA的5和3末端序列，从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。53、松弛型质粒：细菌细胞中质粒的数目有很大差异。多的每个细胞里可以达几十乃至几百份拷贝，少的则只有一到几份拷贝。高拷贝数的质粒称为松弛型质粒，有的质粒拷贝数较多，可随时复制，与染色体的复制不相关，称为松弛型质粒。55、亚克隆：对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，即将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体的转移的过程。目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改照等。56、核酸疫苗：核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗，是利用基因重组技术将编码抗原的基因装入载体，然后直接导入动物体内，通过机体细胞的转录系统合成蛋白，产生的蛋白作为抗原诱导免疫系统产生免疫应答，即通过细胞和体液免疫反应产生抗体，从而达到预防和治疗疾病的目的。基因工程疫苗：将基因工程技术应用于疫苗生产所得的疫苗即为基因工程疫苗。疫苗一般是由灭活或减毒的病原体做成的可预防相应病原物引起疾病的药物, 通过接种人或动物在其体内建立抗感染免疫反应而产生保护作用. 58、基因组文库：某种生物的全部基因组的遗传信息通过克隆载体储存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种含有某种生物全部基因组遗传信息的重组体即为这种生物的基因组文库。cDNA文库：将一种生物mRNA,经反转录产生cDNA,以cDNA构建的克隆群体叫做该种生物的cDNA文库.。45.复杂基因病：不是由于某一个基因核苷酸序列的改变造成基因编码错误而引起疾病，而可能是由于基因“控制失调”所致。基因治疗：是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，达到治疗目的的方法。46 基因芯片：又称DNA芯片或DNA微阵列。即在玻片、硅片、薄膜等载体很小的基质表面上有序地、高密度地（点与点之间的距离一般小于500m）排列、固定了大量的靶DNA片段或寡核苷酸片段。这些被固定的DNA分子在基质上形成的高密度DNA微阵列则称为DNA芯片。RDA 和 SSH ： RDA不能解决高丰度序列对低丰度序列富集的干扰，因此通常需要进行多轮的扣除杂交过程。针对此缺陷，1996年,Diachenko等人在RDA的基础上发展出了SSH技术。SSH在保留RDA的差减富集和动力学富集因素的同时，通过在杂交之前对cDNA的丰度进行均一化处理，使丰度上有差别的单链cDNA相对含量基本一致，从而解决了高丰度序列对低丰度序列富集的干扰。 转座子标签技术/T-DNA标签技术：当转座子或T-DNA转入生物基因组,整合到染色体上的时候,有可能是插入到染色体上的某个基因中,这时会破坏该基因的结构，从而引起表型变异，把变异个体的DNA提取出来，构建成基因组文库，再用转座子或T-DNA为模板制备探针，克隆出该突变基因，再用该突变基因作探针从野生型个体中克隆出目的基因。目的基因：指那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段。Randomprimer随机引物，对于一段待测的未知序列DNA片段，往往已装载在载体上，因此待测DNA片段的两端相当于添加了已知的载体片段。这样就可以根据载体序列设计的通用引物测定待测DNA片段两端的序列。Primerwalking引物步移，引物依次推进法是从目的片段（在待测片段中若知道部分核苷酸序列）的一端开始，利用载体上的序列为依据，设计第一次反应的反应引物进行测序，然后，依次根据前一次测序结果，设计下一次反应引物，递进测序，直至完成。ddNTP: 与普通的dNTP不同之处在于ddNTP脱氧核糖的3端位置的羟基缺失，它们可以在DNA聚合酶的作用下，通过DNA聚合酶其掺入到正在增长中的DNA链中，因自身脱氧核糖的3位置的羟基缺失导致链延伸反应终止。问答题第一章基因克隆、基因操作、基因重组、基因工程的概念及其相互联系。（重要）答：基因克隆（Genecloning）：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。基因工程：是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。基因重组：不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。它们的相互关系：基因工程是通过基因重组实现的，但基因重组并不都是严格意义上的基因工程，基因重组是基因操作范畴的概念，包括实验研究和生物技术的基因重组事件，而基因工程则专指为实践应用而进行的重组事件。基因操作是基因工程的技术基础；基因克隆很多时候并不涉及遗传的改良。1、试述基因工程技术的发展给人类带来的影响？答：1、在工业领域的应用（第四次工业大革命）2、在农业领域的应用3、在医药领域的应用（第二次医学大革命）46、基因工程建立的理论基础合技术基础：理论上的三大发现： 证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）； DNA的双螺旋结构和半保留复制机理；遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立。技术上的三大发现：限制性内切酶和DNA连接酶的发现；载体的使用；大肠杆菌转化体系的建立。2、试述基因工程技术的发展方向？答：生物的遗传改良，生物反应器、基因治疗和基因疫苗等。3、简述基因工程的基本过程和四个基本条件？（重要）答：1、目的基因克隆；2、载体的准备；3、目的基因和载体的连接；4、重组DNA转化/转染/转导；5、重组体的筛选与鉴定；6、重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发利用。四个基本条件：1、目的基因；2、载体；3、工具酶；4、受体细胞。第二章4、切口平移标记DNA前，用DNaseI处理DNA时应注意什么？答：应注意Mn2+离子不能存在和Mg2+的浓度及其处理时间、温度。5、DNA聚合酶有哪些类型，各有什么活性？（重要）答： E.coliDNApolI：5-3DNA聚合酶活性；5-3DNA外切酶活性；3-5DNA外切酶活性。 E.coliDNApolI大片段（Klenow酶）：53DNA聚合酶活性；35DNA外切酶活性；5-3DNA外切酶活性 。 T4噬菌体DNApol：53DNA聚合酶活性（与lenow酶相似）； 35外切酶活性（lenow酶200）：在无dNTP时只有该活性。（常用于填平dsDNA的3缩进末端及水解dsDNA的3突出末端。） T7噬菌体DNApol及测序酶：53DNA聚合酶活性; 35外切酶活性（lenow酶1000）。 耐热DNA聚合酶（Taq酶）：在高温下仍具活性的DNA聚合酶。53DNA聚合酶活性；5-3DNA外切酶活性 。 反转录酶（依赖于RNA的DNApol）：53DNA聚合酶活性(需Mg2+）；RNaseH活性（53及35RNA外切核酸酶活性)； 末端转移酶（terminaltransferase）（DNA修饰酶）：不依赖于模板的DNA聚合酶，在二价阳离子存在下，催化dNTP加在DNA分子的3-OH端。6.在分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物？7、生产限制性内切酶的细菌如何保护自己的DNA不被降解？（背）答：通过限制与修饰系统保护自己的DNA不被降解。几乎所有的限制性内切核酸酶都能和识别甲基相同DNA位点的甲基转移酶共同作用，构成限制修饰系统。由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。由于外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来DNA分子降解掉。所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。8、按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶有哪些？（重要）答：1、反转录酶以mRNA为模板复制出单链cDNA；2、DNA聚合酶以单链cDNA为模板合成双链DNA；3、S1核酸酶切割双链DNA形成平末端；4、用限制性内切酶切割载体；5、用DNA连接酶将cDNA插入载体。9、某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时出现了星号活性，分析可能的原因？（重要）答：(1)高甘油含量(5,vv)；(2)限制性内切核酸酶用量过高(100UugDNA)；(3)低离子强度(100Ug DNA)；(3)低离子强度(25 mmolL)；(4)高pH(8.0 以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。57、当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施？为什么？答：注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。68、简述影响型限制性核酸内切酶活性的因素有哪些？（背）答：DNA 样品的纯度：DNA 样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1g DNA 用10U 酶、加大反应总体积、延长反应时间.DNA 样品的甲基化程度：采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。 酶切反应的温度：多数标准反应温度是37，如SmaI 为25或30 ，SfiI 为50 。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。DNA 分子结构：某些酶切割超螺旋质粒DNA 时，酶量比切割线性DNA 时高出多位，可高达20 倍。核酸内切酶的缓冲液：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH 值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。71、什么是细菌的限制修饰系统?有什么意义?（背）答：细菌中有作用于同一DNA 的两种酶，即分解DNA 的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA 的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA 中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA 上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。由于外来的DNA 在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将人侵的外来DNA 分子降解掉。所以DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。73、某DNA序列中存在酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现酶切不动，试分析可能原因？（背）可能这种酶属于依赖于甲基化的限制系统，只识别经过甲基化的序列。该DNA序列中的酶切位点在体内是甲基化的，而体外合成的DNA序列没有经过甲基化酶的修饰，不能被该酶识别。DNA不干净，杂质多（如多糖、蛋白质、酚类、有机溶剂等）反应体系中存在酶的抑制剂操作不当，酶或DNA加至管壁上，反应体系没完全混合反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适酶的活力不够。第三章15. 用Sal切割从噬菌体J2分离的DNA时，得到8个片段，分别是：1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1和11.4kb。但是，用Sal切割从被感染的寄主细胞中分离到的J2噬菌体DNA时，只得到7个片段，分别是：1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9和11.4kb。根据这些结果，你得到哪些信息？答：(1)J2噬菌体是一种双链线性的DNA分子；(2)基因组全长是475kb；(3)进入宿主后成环状；(4)53和36kb的片段分别位于线性DNA的两端。16.以置换型噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体？（重要）答：改造的置换型噬菌体载体，重组人外源片段之后，总体积不能超过基因组的105，不能少于基因组的75。以置换型噬菌体DNA作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA重组。如果没有外源片段，仅是两臂连接，长度短于基因组的75，不能被包入噬菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，总长度超过丸基因组105后，也不能包入噬菌体颗粒，自然不能形成噬菌斑。17.如何以细菌（或者大肠杆菌E.coli）质粒DNA为载体克隆一个编码大鼠生长激素的基因，并转化到细菌（或者大肠杆菌E.coli）中进行表达。分析一下在实验中可能遇到哪些问题及可能的解决办法？（重要）答：（一）要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。（解决办法：在cDNA前加上细菌的启动子。）(2)大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。（以激素基因的mRNA为模板反转录成cDNA。）(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分工加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成胰岛素的a、b链。（有时可以在离题的条件下进行蛋白质加工过程。）(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。（选用合适的突变型宿主。）（二）针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因。这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及12个终止密码：ATG编码序列TGATAG。现在，这个合成基因可被插入载体中。有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难，可以用合成基因，从而免除加工过程。选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。18.以E.coli为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能原件，各有什么生物学功能？（重要）（1）启动子：转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程。与RNA聚合酶识别、结合、启动转录，启动子的强弱是影响表达量的决定因素之一。（2）转录终止子 转录启动以后的转录过程并不是永无止境的，会受到模板DNA序列结构的影响，当遇到经环结构时转录便会终止，或遇到因子介导的终止信号转录也会终止。转录终止子稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性。（3）核糖体结合位点 转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻译出目的蛋白。细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效核糖体结合位点以及其中的SD序列，启动蛋白质翻译。19.简述利用YAC克隆载体构建基因文库的原理。（重要）答：当用BamH切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如ARS、着丝粒和位于两端的端粒。当再用EcoR或Sma切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。装载了外源DNA片段的重组子导致sup4插入失活，从而形成红色菌落；而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源DNA片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了YAC文库。20.BAC克隆载体有哪些显著的优点（重要）答：BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，并且还可以减少外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。BAC载体可以通过-互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆DNA的NotI酶切位点和用于克隆DNA片段体外转录的SP6启动子和T7启动子。BAC与YAC和PAC相似，没有包装限制，因此可接受基因组DNA大小也没有固定的限制。21、何为-互补，在载体构建中有何作用？（重要）答：-互补 ：指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶（-galactosidase，由 1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。-互补是基于在两个不同的缺陷-半乳糖苷酶阴性的突变体之间可实现的功能互补而建立的。将缺失编码第11-41位氨基酸的-半乳糖苷酶基因称为lacZ M15基因而将半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和编码-半乳糖苷酶N端140个氨基酸的序列称为lacZ.这两个基因的产物单独存在时都无酶学活性,但混合在一起时却有酶学活性.所以在载体上加lacZ/(MSC),并在受体菌中引入lacZ M15即可实现-互补.IPTG是lac操纵子的诱导物,底物X-gal被-半乳糖苷酶分解后可以产生蓝色.如果质粒载体中插入了外源DNA, lacZ 的产物则不能与lacZM15基因的产物实现-互补，在IPTG诱导下不能产生有活性的-半乳糖苷酶，菌落便不可能呈现蓝色。白色菌落便是含有插入了外源DNA的重组质粒。因此可利用菌落颜色变化来筛选插入外源DNA的重组质粒。这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌-半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的载体转入lac的宿主菌后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。22.一个具有卡那霉素（Kan）和氨苄青霉素（Amp）抗性基因的质粒，BglII酶切位点在Ampr基因中。将BglII酶切质粒DNA和BglII酶切的果蝇（Drosophila）DNA进行退火，然后转化大肠杆菌中，回答下列问题：（重要）1、在培养基中需要加入哪种抗生素才能保证筛选出含有质粒的克隆？（卡那霉素）2、在平板上生长的菌落是具有哪种抗生素抗性的？（卡那霉素）3、DrosophilaDNA具有哪种表型？如何筛选具有这一表型的克隆？（答：DrosophilaDNA具有卡那霉素抗性，没有氨苄青霉素抗性。可以将在卡那霉素培养基平板上的菌落影印到氨苄青霉素培养基平板上。能同时在两种培养基中生长的为含有空质粒的大肠杆菌，能在卡那霉素培养基平板上生长而不能在氨苄青霉素培养基平板上生长的为DrosophilaDNA的克隆。）74、YAC载体具有什么样的功能性DNA序列？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？（背）YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。75、何为载体?一个理想的载体应具备那些特点？（背）将外源DNA或基因携带入宿主细胞（hostcell）的工具称为载体载体具备的特点：在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制;有一定的选择标记，用于筛选；最好具有较高的拷贝数，便于制备。62、简述噬菌体载体的克隆原理及一般步骤? （背）原理：载体和外源DNA经酶切后，外源DNA片段插入到载体的适当位置，或置换载体的填充片段。连接形成重组子在体外噬菌体蛋白作用下，包装形成噬菌体颗粒，通过噬菌体颗粒感染大肠杆菌将重组DNA注射到宿主中，经过裂解生长，可增殖重组DNA。步骤：通过裂解过程增殖载体回收、分离纯化载体载体与外源DNA的酶切外源DNA与载体的连接重组噬菌体的体外包装包装噬菌体颗粒感染宿主筛选。43、以pB322质粒为载体，从四环素抗性基因（tetr）区克隆外源DNA时，可采用环丝氨酸富集法筛选重组体，请说明其基本原理和基本操作过程？（背）答：基本原理：由于四环素的作用是抑制细菌蛋白质的合成，而不是杀死细菌；而氨基酸类似物环丝氨酸如果掺入蛋白质，则是致命的。因此再有四环素的条件下，环丝氨酸能够杀死tetr而不杀死tets的细菌。经过环丝氨酸处理后，存活的细胞中tets型得到很大的富集，而经过若干次连续处理，既能获得在基因内含有插入物的质粒的细胞。基本操作：转化后有三种表型的细菌，其中只有一种是重组体AprTcs。用重组DNA转化受体菌后，将受体菌培养在加有四环素和环丝氨酸的培养液中培养，此时只有非重组的双抗性菌可以生长，其他都被抑制。由于有环丝氨酸的存在，AprTcs表型的菌生长到一定程度就会死亡.由于四环素只有抑菌而无杀菌的作用，此时若解除四环素（离心洗涤），加入氨基苄青霉素继续培养，则可使重组体大量生长。77、什么是质粒的相容性？什么是不相容群？机制是什么？（背）质粒的相容性：是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞，如果能够共存则叫相容（又叫亲和），不能共存则称为不相容。从本质上说，能够共存于同一个细胞中的质粒具有不同的复制机制，因而复制时互不干涉，并保持稳定。根据质粒的这一特性将质粒分为若干个不相容群。同一个不相容群中的质粒不能共存于同一个细胞，因为他们的复制机制相同，因而饭能共存于同一个细胞中的质粒属于不同的不相容群，因为他们的复制机制不同。80、Cosmid的工作原理是什么？（背）Cosmid的工作原理类似噬菌体载体，外源片段Cosmid连接时，粘粒载体相当于噬菌体载体的左右臂，COS位点通过粘端退火后，再与外源片段相间连接形成多联体，此多联体与噬菌体包装蛋白混合，A蛋白切割COS位点，包装形成噬菌体颗粒。感染E.coil后，线形重组DNA注入并通过COS位点环化，在宿主中像质粒一样复制，重组粘粒在辅助噬菌体诱导下可再次包装进入噬菌体中。可克隆45Kb片段，大小与Cosmid自身大小、噬菌体头部大小有关。2.从噬菌体MS2中提取出来的裸露染色体可以感染大肠杆菌的原生质球（去除胞壁的细菌），这会产生和具感染能力的噬菌体一样的噬菌体颗粒。如果染色体先用RNA酶处理，就失去感染能力；如果标记感染的RNA，在子代中不出现标记。解释这些现象。答：MS2噬菌体的染色体为单链（+）RNA，它的复制过程如下：以（+）链作为模板合成一个碱基互补的（-）链；以这条（-）链作为模板合成大量的（+）病毒链，原始的（+）链被完全保留，相应的酶是RNA复制酶，它是MS2一个基因的产物。第四章：23、印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。（重要）答：Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，用于外源基因整合的鉴定及分析。Northern杂交是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。Western杂交是利用抗原与抗体的特异结合的原理检测外源基因表达产物特异蛋白质的生成。24、核酸分子标记有哪些方法，各有何特点？（重要）（一）均匀标记:需要复制一段新的探针分子,在复制过程中掺入标记的核苷酸,从而使整个新分子被均匀地标记.显著特点是探针分子的标记不局限在一个位点上,因此,均匀标记可使探针的标记信号扩大,得到高比活度的探针.（1）切口平移标记,新合成的被标记的分子可以代表该待标记DNA分子的绝大部分核苷酸序列.（2）随机引物标记,扩增出来的DNA产物包括从任意某个位点起始的单链DNA片段,产物群体包含了目的DNA所有核苷酸序列信息,多用来标记DNA片段.（3）PCR扩增标记,尤其适合于探针DNA浓度很低的情形.（4）单链探针,不存在互补双链,因此可以消除探针的两条链在杂交过程中形成无效双链的可能性,从而增加探针与靶序列探针与靶序列之间形成杂合体的稳定性,提高检测的灵敏度.（二）末端标记:直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子,或直接在探针分子上加入标记的原子或复合物。（1）DNA片段的末端标记,末端标记主要通过酶促反应来完成,Klenow