猪LXRα、HNF-4α基因多态性及其与生长性状的相关性分析-硕士论文

C l a s s i f i e dI n d e x ： U D C ： D i s s e r t a t i o nf o rt h eM a s t e rD e g r e e A SSO C I A T I O NL X R 仅、H N F 4 0 cG E N E P O L Y M O I 之P H I S M SA N DG R O W T H C a n d i d a t e ： T R A I T S S u p e r v i s o r ： A c a d e m i cD e g r e eA p p l i e df o r ： S p e c i a l i t y ： D a t eo f0 r a lE x a m i n a t i o n ： U n i v e r s i t y ： Z h u J i y u a n P r o f L i uD i M a s t e ro f A g r i c u l t u r e A n i m a lG e n e t i c sa n d B r e e d i n g J u n e ，2 0 1 0 N o r t h e a s t A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y 目录【Y17 8 7 3 8 6 I l l I I t l l l l t l l l l l l l l l l t l l l l l t l tl lll t l l t l l l l l l l l 目录 中文摘要I 英文摘要I I I l 弓I 言1 1 1 肝X 受体a 的研究进展1 1 1 1L X R a 基因的结构l 1 1 2 L X R a 的生物学功能2 1 2 肝细胞核因子4 a 的研究进展4 1 2 1H N F - 4 a 基因的结构4 1 2 2 H N F - 4 a 的生物学功能6 1 3 实验相关性状的研究7 1 3 1 初生重与断奶重7 1 3 2 出生体长、出生胸围和出生体高8 1 3 3 肌纤维的研究现状9 1 4 本研究的目的和意义1 2 2 材料与方法1 3 2 1 实验材料1 3 2 1 1 实验动物1 3 2 1 2 主要仪器设备1 3 2 1 3 主要药品、试剂及配制。1 4 2 2 实验方法15 2 2 1 性状测定一1 5 2 2 2 耳组织样D N A 的提取1 5 2 2 3 组织样总R N A 的提取1 6 2 2 4 引物设计与合成17 2 2 5 逆转录反应l8 2 2 6P C R 反应1 9 2 2 7P C R 产物的克隆测序2 0 2 2 8P C R S S C P 分析2 2 2 2 9 石蜡切片制作与染色过程2 3 2 2 1 0 基因多态性的统计方法2 5 2 2 1 l 主要分子生物学软件及统计分析软件2 6 2 2 1 2 相关生物信息学网站2 6 3 结果与分析2 7 3 1L X R a 基因的克隆、生物信息分析及P C R S S C P 分析2 7 3 1 1 总R N A 的质量检测2 7 3 1 2L X R a 基因e D N A 的克隆2 7 ，卜 东北农业大学农学硕十学位论文 3 I 3L x R 旺的结构、功能分析2 8 3 1 4L X R a 基因分子进化分析。3 0 3 1 5L X R 旺基因内含子的克隆3 2 3 1 6L X R c t 基因的多态性及其与生长性状的相关分析3 5 3 2H N F - 缸基因的克隆、生物信息分析及P C R S S C P 分析4 2 3 2 IH N F - 4 a 基因e D N A 的克隆4 2 3 2 2H N F - 4 a 的结构、功能分析4 3、 3 2 3H N F - 4 a 基因分子进化分析4 5 3 2 4H N F _ 4 a 基因的多态性及其与生长性状的相关分析4 7 1 4 讨论5 7 4 1 猪L X R a 基因、H N F - 4 a 基因的克隆分析5 7 4 1 1L X R a 基因的克隆分析。5 7 4 1 2H N F - 4 a 基因的克隆分析5 7 4 2 猪L X R a 基因、H N F - 4 a 基因的多态性及其与性状的相关性分析5 7 4 2 1L X R a 基因的多态性。5 7 4 2 2L X R a 基因的多态性与性状的相关性分析5 8 4 2 3H N F - 4 a 基因的多态性5 9 4 2 4H N F - 4 a 基因的多态性与性状的相关性分析5 9 4 3 本实验研究方法的讨论6 0 4 3 1 关于P C R S S C P 。6 0 4 3 2 关于石蜡切片6 l 5 结论6 3 致谢6 4 参考文献6 4 附录6 5 攻读学位期间发表的学术论文。7 0 1 1 C O N T E N T S C O N T E N T S I ：h i n e s eA b s t r a c t I E n g l i s hA b s t r a c t I I I 1 I n t r o d u c t i o n 1 1 1L i v e rXr e c e p t o ra ，R e s e a r c h 1 1 1 1L X R a g e n es t r u c t u r e 1 1 1 2T h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fL X R a 2 1 2H e p a t o c y t en u c l e a rf a c t o r4 ai nt h er e s e a r c h 4 1 2 1H N F - 4 ag e n es t r u c t u r e 4 1 2 2T h e b i o l o g i c a lf u n c t i o no fH N F - 4 a 6 1 3E x p e r i m e n t a ls t u d i e sr e l a t e dt r a i t s 7 1 3 1B i r t hw e i g h ta n dw e a n i n gw e i g h t 7 1 3 2B i r t hl e n g t h , c h e s tc i r c u m f e r e n c ea n db i r t hh i g h 。8 1 3 3R e s e a r c hm u s c l ef i b e r s 9 1 4P u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c e 1 2 2 M a t e r i a i sa n dM e t h o d s 1 3 2 1M a t e r i a l so f e x p e r i m e n t 1 3 2 1 1E x p e r i m e n t a la n i m a l s 1 3 2 1 2M a j o r e q u i p m e n t 1 3 2 1 3T h em a i nm e d i c i n e s ，r e a g e n t s ，a n dp r e p a r a t i o n 。1 4 2 2M e t h o d so f e x p e r i m e n t 1 5 2 2 1P r o p e r t yD e t e r m i n a t i o n 1 5 2 2 2E a rt i s s u es a m p l e sD N Ae x t r a c t i o n 1 5 2 2 3E x t r a c t i o no f t o t a lR N At i s s u es a m p l e s 1 6 2 2 4P r i m e rd e s i g na n ds y n t h e s i s 17 2 2 5R e v e r s et r a n s c r i p t i o nr e a c t i o n 1 8 2 2 6P C Rr e a c t i o n 1 9 2 2 7P C R p r o d u c t sc l o n e da n ds e q u e n c e d 2 0 2 2 8P C R - S S C P a n a l y s i s 2 2 2 2 9P a r a f f i ns e c t i o na n ds t a i n i n gp r o c e s s 2 3 2 2 10S t a t i s t i c a lM e t h o d sf o rg e n e t i cp o l y m o r p h i s m 2 5 2 2 1lM a i ns o f l w a r e s 2 6 2 2 1 2M a i nb i o i n f o r m a t i cW e b 2 6 3R e s u l t sa n a l y s i s ：1 7 3 1L X R a c l o n i n g ，b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sa n dP C R S S C Pa n a l y s i s 2 7 3 1 1T h eq u a l i t yo f t o m lR N AD e t e c t i o n 2 7 3 1 2L X R ag e n ee D N Ac l o n i n g 2 7 L r I I 1 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注! 翅遗直基丝盖噩缱剔直盟鳆! 奎拦豆窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：君耻猢嗯 日期：砌纱年6 即日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 、 学位论文作者签名：万 导师签名 日期：Z 归年己月1 日 日期：砌睥杉月7 日 l 卜 1 一 摘要 摘要 肝X 受体a ( L X R a ) 是一类与脂类代谢有关的核受体，是重要的脂质传感器，其主要 功能是通过其相应的配体过氧化物酶增殖受体( P P A R ) 和维甲酸X 受体( R X R ) 等形成异二聚 体，然后在特定的激活剂( 氧化固醇类) 的激活下调控靶基因的转录，从而影响机体内的脂类 和糖类的代谢，并且通过调节脂肪酸的合成来调控脂质的动态平衡。肝细胞核因子4 a ( H N F 4 a ) 是肝细胞核因子( h e p a t o c y t en u c l e a r f a c t o r ，H N F ) 家族成员之一，可在肝脏内高 表达，该家族基因对肝细胞的分化调控起关键作用，同时参与肝脏糖、脂代谢相关基因特异 性表达的调控。L X R a 基因和H N F - 4 a 基因参与调节生命代谢活动的诸多方面并且对动物生 长发育过程起着重要作用。 本研究以长白猪、法系大白猪、野猪、大民猪和北京黑猪为实验材料，采用P C R 方法克 隆了野猪L X R a 基因和H N F - 4 a 基因的全长编码区序列以及L X R a 基因内含子l 、2 、3 、4 、 5 、7 、8 ：采用生物信息学的方法对L X R a 基因和H N F - 4 a 基因结构功能域及分子进化进行分 析；采用P C R S S C P 的方法分析L X R a 基冈和H N F 4 a 基因单核苷酸多态性并探讨不同等位 基因在猪种中的分布规律及其与初生重、断奶重、出生体长、出生体高、出生胸围、肌纤维 直径、肌纤维密度和肌纤维横截面积的相关性分析。主要研究结果如下： 1 野猪L X R a 基因完整编码区长1 3 4 4 b p ，编码4 4 7 个氨基酸。L X R a 基因进化较保守， 猪与牛的同源性最高( 9 6 8 7 ) ，与鸭同源性最低( 7 0 4 7 ) 。 2 野猪H N F 4 a 基因完整编码区长1 4 2 5 b p ，编码4 7 4 个氨基酸。 n 虾- 4 q 进化较保守， 猪与人的同源性最高( 9 7 6 8 ) ，与斑马鱼同源性最低( 8 1 O l ) 3 L X R a 基因的内含子l 、2 、3 、4 、5 、7 、8 分别长6 4 6 b p 、6 8 9 b p 、7 4 8 b p 、2 1 1 b p 、3 0 4 b p 、 6 8 0 b p 。 4 在L X R a 基因的第二内含子和第四外显子上共寻找到5 个单核苷酸突变和1 个2 b p 的 插入缺失，其中在第四外显子上的两处单核苷酸突变均为同义突变。群体遗传学分析表明， 所检测的3 个位点在5 个品种间基因型的分布均存在着极显著的差异( P 0 0 1 ) 。 5 采用P C R S S C P 方法在H N F 4 a 基因的第二内含子、第八外显子、第八内含子和第九 外显子上共寻找到5 个单核苷酸突变。其中在第八外显子上的第1 0 1 9 7 8 碱基处单核苷酸突 变C - T 为同义突变，第1 0 2 0 0 1 碱基处单核苷酸突变G _ A 为错义突变，氨基酸变化为G E ， 第九外显子上的单核苷酸突变1 - C 为同义突变。群体遗传学分析表明，所检测的4 个位点 在5 个品种间基因型的分布均存在着极显著的差异( P o 0 1 ) 。 6 L X R a 基因1 1 3 3 多态位点基因型对法系大白猪的出生胸围显著相关( P 0 0 5 ) ，T B 4 多态位点基因型对法系大白猪的断奶重和出生体长显著相关( P 0 0 5 ) 。H N F 4 a 基因S H l 多 态位点基因型对法系大白猪的出生体长极显著相关( P o 0 1 ) ，S H 2 多态位点基因型对法系大 白猪的初生重显著相关( P O 0 5 ) 。H l 、I F 4 a 基因S H 2 多态位点基因型对大民猪的肌纤维直径和 肌纤维横截面积显著相关( P 0 0 5 ) 。 关键词猪：肝X 受体伍；肝细胞核因子4 伍；克隆；多态性： ，卅 东北农业大学农学硕十学位论文 A s s o c i a t i o nL X R a 、H N F 一4 aG e n eP o l y m o r p h i s m sa n d G r o w t hT r a i t s A b s t r a c t L i v e rXr e c e p t o ra ( L X R a ) i sac l a s so fl i p i dm e t a b o l i s mw i t ht h en u c l e a rr e c e p t o r , i sa n i m p o r t a n tl i p i ds e n s o r l t sm a i nf u n c t i o ni st h r o u g hi t sc o r r e s p o n d i n gr e c e p t o rl i g a n d so fp e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o ra n dr e t i n o i ca c i dXr e c e p t o r sf o r mh e t e r o d i m e r s T h e nt h ea c t i v a t i o no ft h et r a n s c r i p t i o n o ft a r g e tg e n e su n d e rt h ec o n t r o li na s p e c i f i ca c t i v a t o r ( o x i d a t i o ns t e r o i d ) ，t h u sa f f e c t i n gt h eb o d y S l i p i da n dc a r b o h y d r a t em e t a b o l i s m ，a n db yr e g u l a t i n gt h es y n t h e s i so ff a t t ya c i d st or e g u l a t el i p i d h o m e o s t a s i s H e p a t o c y t en u c l e a rf a c t o r - 4 a ( H N F - 4 a ) i sah e p a t o c y t en u c l e a rf a c t o r ( h e p a t o c y t e n u c l e a r f a c t o r , H N F ) f a m i l ym e m b e r , h i g h l ye x p r e s s e di nl i v e r t h ef a m i l yg e n e sr e g u l a t i n gt h e d i f f e r e n t i a t i o no fl i v e r c e l l sp l a yak e yr o l e ，i ta l s op a r t i c i p a t e si nl i v e rg l u c o s ea n dl i p i d m e t a b o l i s mi nt h er e g u l a t i o no fs p e c i f i cg e n ee x p r e s s i o n L X R ag e n ea n dH N F - 4 ag e n ei n v o l v e d i nr e g u l a t i n gm a n ya s p e c t so fl i f ea n dm e t a b o l i ca c t i v i t yi na n i m a l sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t I nt h i ss t u d y , Y o r k s h i r e ，L a n d r a c e ，W i l db o a r , Y o r k s h i r eXM i np i g ，B e i j i nb l a c kp i gl a r g ea st h e e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l U s i n gP C R , c l o n e dp i g sL X R ag e n ea n dH N F - 4 ag e n ef u l l l e n g t hc o d i n g s e q u e n c ea n di n t r o n1 , 2 ，3 ，4 ，5 ，7 ，8L X R a ；U s i n gt h em e t h o do fb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sL X R ag e n e a n dH N F - 4 ag e n es t r u c t u r e ，f u n c t i o na n dm o l e c u l a re v o l u t i o n d o m a i n ；u s i n gP C R - S S C Pm e t h o d t oa n a l y z et h eL X R ag e n ea n dH N F - 4 ag e n es i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m sa n dt oe x p l o r et h e d i f f e r e n ta l l e l e s T h ed i s t r i b u t i o no ft h ep i ga n di t sr e l a t i o n s h i pw i t hb i r t hw e i g h t ，w e a n i n gw e i g h t , b i r t hl e n g t h ，b i r t hb o d yh e i g h t , c h e s tc i r c u m f e r e n c ea tb i r t h , m u s c l ef i b e rd i a m e t e r , m u s c l ef i b e r d e n s i t ya n dm u s c l ef i b e rc r o s s s e c t i o n a la r e ao ft h ec o r r e l a t i o na n a l y s i s T h em a j o rf i n d i n g sa r ea s f o l l o w s ： 1 B o a rL X R a g e n ec o m p l e t ec o d i n gr e g i o n13 4 4 b p ，e n c o d i n g4 4 7a m i n oa c i d s T h es t r u c t u r e o fn u c l e a rr e c e p t o rD N Ae x i s t s b i n d i n ga n dl i g a n db i n d i n g L X R ag e n ee v o l u t i o nm o r e c o n s e r v a t i v e ，p i g sa n dc a t t l eh o m o l o g yW a st h eh i g h e s t ( 9 6 8 7 ) ，a n dd u c kt h el o w e s th o m o l o g y ( 7 0 4 7 ) 2 B o a rH N F - 4 ag e n ec o m p l e t ec o d i n gr e g i o nW a s1 4 2 5 b p ，e n c o d i n g4 7 4a m i n oa c i d s T h e s t r u c t u r eo fn u c l e a rr e c e p t o rD N Ae x i s t sb i n d i n ga n dl i g a n db i n d i n g H N F - 4 ae v o l u t i o no fam o r e c o n s e r v a t i v e ，p i ga n dh u m a nh o m o l o g yo ft h eh i g h e s t ( 9 7 6 8 ) ，a n dz e b r af i s h ，t h el o w e s t h o m o l o g y ( 8 1 0 l ) 3 L X R ag e n ei n t r o n1 , 2 ，3 ，4 ，5 ，7 ，8w e r e6 4 6 b p ，6 8 9 b p ，7 4 8 b p ，21 Ib p , 3 0 4 b p ，6 8 0 b p 4 L X R ag e n ei ni n t r o n2a n de x o n4w e r et of i n d5S N Pa n do n e2 b pi n s e r t i o n d e l e t i o n ， i n c l u d i n ge x o n4i nt h et w os i n g l e - c o r es y n o n y m o u sm u t a t i o n sa r en u c l e o t i d em u t a t i o n P o p u l a t i o n g e n e t i c sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ed e t e c t i o no ft h r e es i t e si nf i v ev a r i e t i e sg e n o t y p e st h e r ew e r e I l l 引言 1 引言 1 1 肝X 受体a 的研究进展 1 1 1L X l 地基因的结构 L X R ( L i v e rXR e c e p t o r s ) 是细胞核受体超家族的成员之一，是一类与脂质代谢有关的核 受体，可以调节几类重要的脂类物质代谢，也曾被称为孤儿受体。L X R a 最初是由W i l l y ( 1 9 9 5 ) 等从人的肝c D N A 文库分离得到的，因在肝脏表达最丰富而命名。L X R a 基因也被认为是重 要的脂质传感器，对L X R a 的研究已经成为国内外的热点。L X R 分为L X R a ( N R l H 3 ) 和 L x R B ( N R l H 2 ) 两种，L X R a 在肝脏高表达，在脂肪组织、肾脏、肠、肺、肾上腺、巨噬细 胞等也有一定表达，L X R I B 则广泛存在于动物体内。L X R a 缺失会造成肝脏胆固醇的蓄积， L X R 3 虽然存在，但是无法弥补L x R a 的功能，说明L X R a 与L X R B 具有不同的生物学功能。 但是在结构上两种亚型却有着共同的特征，分为六个部分，即A 、B 、C 、D 、E 和F 区，见 图1 1 。A B 区在长度、序列和结构上高度多变，该区含有一转录活化区，称为A F l ，其通 过和基础转录因子、辅活化子或其它转录因子的相互作用活化目标基因。C 区为D N A 结合 区( D N Ab i n d i n gd o m a i n ，D B D ) ，高度保守。各种核受体的D B D 有很高的同源性，在结构上 有两个锌指( z i n cf i n g e O 。D 区为一多变的绞链区，允许核受体蛋白曲折或者改变构型。E 区 相对较大( 约2 5 0 个氨基酸) ，并高度聚合，其功能较复杂，配体结合N ( 1 i n g e db i n d i n gd o m a i n ， L B D ) 在E 区，此外，E 区还具有和热休克蛋白结合、聚合、核定位、转录活化、分子内沉寂 和分子间阻遏的作用。核受体的F 区的转录活化区，称为A F 2 ，目前还没有发现其的特定功能。 A 矗1 朋CDEF 图1 1L X R a 的结构模式图 F i g 1 一iT h es t r u c t u r eo fL X R a A F 2 L X R a 的作用机制可分为以下三步：( 1 ) 配体缺乏时，辅阻遏物与以L X R o R X R a 结合抑 制转录：( 2 ) 激动剂与以L X R a 或R X R c t 结合，使辅阻遏物解离，产生基础转录；( 3 ) 辅助激活 因子补充结合到活化的L X R a R X R a 上，L X R a 相关靶基因的转录被完全激活。 控，其上游启动子区有L X R E 元件的存在。 1 1 2 2 调控脂类的吸收和转化 胆固醇在肝脏中转化成胆汁酸是体内胆固醇消耗的一个主要途径。胆汁酸是脂溶性维生 素和甾醇等化合物吸收、运输的重要载体，同时血管中胆固醇累积是造成动脉粥样硬化的一 个重要原因。C Y P 7 A ! ( C y t o c h r o m eP 4 5 0 ) 是体内胆固醇合成胆汁酸的限速酶，它是L X R 的靶基因之一。通过对L X R c t 基因敲除的小鼠模型的研究发现，它们由于无法正常表达 C Y P 7 A 1 ，从而导致肝脏部位胆固醇的累积。已经发现在人和小鼠C Y P 7 A 1 基因的上游启动 子区存在L X R E 顺式作用元件D R 4 ，所以利用合成出的L X R t t 激活剂来提高肝细胞内胆固醇 的转化以抑制动脉粥样硬化的发生是非常有意义的。 L P L ( L i p o p r o t e i nL i p a s e ) 脂蛋白脂酶，是脂蛋白代谢的关键酶，主要负责甘油三脂的水 2 引言 解，释放自由脂肪酸到外周组织中。L P L 是甘油三脂形成H D L 所必备的物质，而且胆固醇 在肝脏中被吸收的过程也需要L P L 起“桥梁”的作用。L P L 有利于机体利用巨噬细胞清除血管 中富含胆同醇的脂蛋白，把它运输到肝脏中并降解利用。在肝脏中，L P L 有利于H D L 摄取 和运输胆同醇。在病理情况下，含有过多胆固醇的巨噬细胞会在这个期间形成肥大细胞，从 而诱发动脉粥样硬化的发生。相关的研究还发现L P L 是L X R a 的靶基因，在L P L 的内含子 中含有L X R E 的D R 4 元件。 C E T P ( C h o l e s t r o lE s t e r T r a n s f e r P r o t e i n ) 胆固醇酯转移蛋白，经C E T P 修饰后的H D L 在 肝细胞表面更容易被水解吸收。P L l P ( P h o s p h o l i p i d T r a m f e rP r o t e i n ) 磷酸酯转移蛋白，P L T P 是H D L 代谢的关键酶，参与胆固醇的逆转运；P U P 还调节V L D L 的分泌，促使V L D L 、L D L 转化成H D L ，参与H D L 的代谢。进一步研究表明C E T P 和P L T P 基因的上游启动子包含L X R E 元件。 1 1 2 3 调节胆固醇等脂类的生物合成 S R E B P s ( S t e r o lR e g u l a t o r yE l e m e n t - B i n d i n gP r o t e i n s ) ，甾醇调节元件结合蛋白。它属于 转录调节因子参与调节胆固醇和脂肪酸的生物合成。已经发现的S R E B P s 有三种形式，分别 是S R E B P 1 a 、S R E B P 1 c 、S R E B P - 2 ，S R E B P s 在体内合成后，以前体的形式结合在内质网或 核膜上，随着甾醇类物质浓度的降低，前体蛋白经过两步切除反应，切掉N 末端转化成成熟 的S R E B P 进入细胞核中，结合到S R E 启动子区内的E b o x e s 上加强该基因的转录。它的激 活会引起脂肪酸合成的增加，合成胆固醇脂，从而保护细胞免受胆固醇过多造成的细胞毒性。 研究发现配体激活的L X R a R X R 异二聚体可以结合到S R E B P I c 的启动子上游的L X R E 顺式 元件上，调控S R E B P - I c 的转录，从而调控胆固醇和脂肪酸的生物合成。但研究发现L X R R X R 可能对于S R E B P 2 没有调控作用。 总之，L X R a 的靶基因参与了胆固醇等脂类的吸收、转运、转化和合成等一系列过程。 Z 脚k A 幽函 气 岍岫 l l X R q M 凡4 商GA p o t - ) l L p kC k - r l F p ”限 图l 3L X R a 与脂类代谢关系 F i g 1 - 3T h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nL X R aa n dl i p i dm e t a b o l i s m 3 厶 嘲+圭 东北农业大学农学硕十学位论文 1 1 2 4 参与糖类代谢调节 L X R 是糖代谢的重要调节者，在肝脏中通过抑制糖合成酶的生成来抑制糖合成作用。 L X R a 激活剂可显著抑制肝脏糖异生酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( P E P C K ) 、葡萄糖- 6 - 磷酸酶 ( G - 6 P a s e ) 和果糖1 , 6 - 2 磷酸酶( F B P I ) 的表达。肝脏x 受体a 、肝脏X 受体p 能够被葡萄糖激 发，起到食物传感器的作用，并能协调人体对营养物质的反应，并且还可以控制与胆固醇和脂 肪代谢相关基因的表达。所以肝脏X 受体a 综合了葡萄糖探测和控制脂肪生成的能力。 1 1 2 5 调控与炎症反应有关的细胞因子的表达 T N F a ( T u m o u r N e c r o s i sF a c t o r 吨) 是一种非常重要的细胞因子，表达量在单核细胞和巨 噬细胞中较高。T N F 0 t 可以引起局部的炎症反应，导致内皮细胞、平滑肌细胞的凋亡，另一 方面它还可以引起局部组织坏死和T 细胞的侵染。在动脉粥样硬化的发生过程中有促进病灶 形成的作用。研究发现L X R a 的激活剂可以提高巨噬细胞中T N F m R N A 的表达水平，而且 在T N F a 的启动子上有L X R E 存在。 1 1 2 6L X R a 存在自催化现象 人L X R a 受到L X R a P P A R y 的调节。L X R a 基因可能是P P A R R X R 或L X R R X R 的直接 靶基因。人巨噬细胞和脂肪细胞L X R a 基因的表达受到L X R c t 本身的诱导。但是在鼠的这些 细胞中却没有发现L X R a 的自我催化功能。L X R a 的自我调节可以把载脂细胞的信号进行放 大达到自动调节机体的功能。人和鼠的不同说明了人对于这一信号的反应要比鼠敏感得多。 1 2 肝细胞核因子4 a 的研究进展 1 2 1H N F 4 a 基因的结构 肝细胞核因子( H e p a t o c y t en u c l e a r f a c t o r , H N F ) 家族对肝细胞的分化调控起重要作用，研究 发现H N F 家族在肝脏内高表达并调节肝细胞众多功能基因特异性表达。H N F 家族主要包括 H N F I ( H N F - I a 、H N F q p ) 、H N F 3 ( H N F - 3 a 、H N F - 3 p 、H N F 3 _ r ) 、H N F 4 ( H N F - 4 a 、H N F - 4 1 , ) 、 H N F 6 、C C A A T 增强子结合蛋 刍( C E B P a 、C E B P I B 、C E B P y 、C E B P 5 、C E B P 、C E B P 0 5 止 D N A 2 0 4 0 n g S o l u t i o nl 5 斗L 加d d H 2 0 至l O 此 将上述反应液在1 6 反应2 3h 。 4 转化 ( 1 ) 从8 0 ( 2 冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。 ( 2 ) 将1 0 止连接产物加入到1 0 0 9 L 感受态细胞中，冰浴3 0 m i n 。 ( 3 ) 4 2 水浴热激9 0 s ，立即置入冰浴中2 m i n 。 ( 4 ) 加4 0 0 0 L 液体L B 培养基，3 7 1 2 振荡复苏9 0 m i n 。 ( 5 ) 取1 0 0 9 L 铺于L B 平板上，平板含0 1 ( V ，v ) 的氨苄青霉A m p ( 1 0 0m g m L ) 。 ( 6 ) 3 7 恒温培养1 0 1 5 h 。 5 转化菌落的P C R 鉴定与