海岛棉染色体组特异重复序列的筛选及亚克隆分析-硕士论文

分类号： 华中农业大学硕士学位论文 海岛棉染色体组特异重复序列 的筛选及亚克隆分析 一王830 1 工3 密级： S c r e e n i n go fg e n o m es p e c i f i cr e p e t i t i v es e q u e n c er e l a t e dw i t h Gb a r b a d e n s ea n ds u b c l o n i n ga n a l y s i s 研究生：杨晓芳 指导教师：王坤波研究员 指导小组：王坤波研究员 专业：作物遗传育种 获得学位名称：农学硕士 研究方向：棉花分子生物学 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学植物科学技术学院 二零一零年六月 一苓一苓，牛、月 I | I I II I II I II II I II II II II Y 17 9 9 3 9 4 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 系 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的_ y - 位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究蚴：捣谚也嘭 帆川年办日 学位论文使用授权书 撇黼鲐船观荔删名：砷矽 签名日期：2 州) 年月f 日 签名日期：x ，。年 月弓日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 目录 摘要I A b s t r a c t 缩略语表V 第一章：文献综述1 1 1 重复序列的种类1 1 1 1 串联重复序列1 1 1 1 1 端粒重复序列( T e l o m e r i cR e p e a t s ) 1 1 1 1 2 核糖体R N A 基因1 1 1 1 3 着丝粒串联重复序列家族2 1 1 1 4 亚端粒或臂间卫星D N A 家族3 1 1 2 散布重复序列3 1 1 2 1 转座因子( t r a n s p o s a b l ee l e m e n t s ) 4 1 1 2 2 反转录因子( r e t r o e l e m e n t s ) 4 1 1 2 3 短散布核因子( S I N E s ) 5 1 1 2 4 其它散布重复序列5 1 2 重复序列的功能与应用6 1 3 重复序列的分离和克隆方法8 1 3 1 超高速离心法8 1 3 2 重复序列中单酶切位点的酶酶切基因组法8 1 3 3 重复序列特异结合免疫蛋白法9 1 3 4B A C 或其它文库筛选法9 1 4 棉属中重复序列的研究概况1 0 1 4 1 棉属植物基因组简介1 0 1 4 2 棉花重复序列的同步进化1 0 1 4 2 11 8 S - 2 6 Sr D N A 的同步进化1 1 1 4 2 25 Sr D N A 的同步进化1 1 1 4 2 3 基因组的同步进化1 1 1 5 植物荧光原位杂交的原理及其发展1 2 1 5 1 荧光原位杂交技术的原理1 2 1 5 2 荧光原位杂交技术的发展1 2 1 5 3 荧光原位杂交技术的分类1 3 1 5 4 荧光原位杂交在植物研究中的应用1 4 1 6 菌落原位杂交1 5 1 7 本研究目的与意义1 6 第二章材料与方法1 7 2 1 实验材料1 7 2 1 1B A C 文库1 7 2 1 2 实验所用靶D N A 1 7 2 1 3 试剂1 8 2 2 试验方法1 8 2 2 1D N A 提取1 8 2 2 1 1P i m a - 9 0 基因组D N A 提取1 8 2 2 1 2B A CD N A 提取1 9 2 2 2 菌落原位杂交2 0 2 2 2 1 高密度杂交膜的制备2 0 2 2 2 2 探针的标记2 1 2 2 2 3S o u t h e r n 杂交2 l 2 2 3 荧光原位杂交2 2 2 2 3 1 体细胞染色体制片2 2 2 2 3 2 探针的标记2 2 2 2 3 3 原位杂交流程2 3 2 2 4 亚克隆2 4 2 2 4 1B A CD N A 部分酶切2 4 2 2 4 2 目的D N A 片段的试剂盒回收2 4 2 2 4 3 回收产物的链接2 5 2 2 4 4 连接产物的转化2 5 2 2 4 5 重组克隆的分析2 6 2 2 4 6 克隆的挑取和保存2 6 2 2 5 阳性克隆的序列测定2 6 第三章实验结果与分析2 8 3 1 棉花重复序列的筛选及染色体定位2 8 3 1 1B A C 文库的筛选及得到的阳性克隆2 8 3 1 2 阳性单克隆的原位杂交2 9 3 1 3 将4 2 8 K 2 0 、4 1 2 A l i 分别在A 、D 组棉上进行F I S H 验证3 1 3 24 2 8 K 2 0 、4 1 2 A I I 亚克隆文库的构建与筛选3 2 3 2 I S A U 3 AI 最佳酶用量的确定和酶切片段的回收3 3 3 2 2 连接与转化3 3 3 2 3 亚克隆文库的检测3 4 3 2 4 亚克隆文库的筛选3 4 3 2 5 亚克隆的序列分析3 5 3 3 以重复序列探针为基础海岛棉F I S H 核型分析4 2 第四章讨论4 4 4 1 四个阳性单克隆原位杂交结果的初步探讨4 4 4 24 2 8 K 2 0 与“基因组殖民化的现象4 4 4 34 1 2 A I l 的亚克隆分析4 6 4 4 关于实验方法的讨论4 6 第五章结论4 8 参考文献5 0 致谢5 9 摘要 本研究以海岛棉基因组为材料，从海岛棉P i m a 9 0 - 5 3B A C 文库中筛选棉属染色 体组特异重复序列。通过荧光原位杂交验证筛选出来的重复序列在四倍体海岛棉， 二倍体亚洲棉、草棉、阿非利加棉、雷蒙德氏棉染色体上的分布情况；将筛选出来 的B A C 重复序列构建亚克隆，对其亚克隆的序列进行了分析。主要研究结果如下： 1 从P i m a 9 0 - 5 3B A C 文库中共筛选了1 9 ，2 0 0 个克隆，以海岛棉有丝分裂中期 染色体为靶D N A ，将通过菌落原位杂交筛选出来的信号较强的B A C 单克隆作为探针 进行荧光原位杂交。根据荧光信号在海岛棉染色体上的分布情况来看，筛选出来的 B A C 单克隆共有4 种，其克隆编号分别为：4 2 8 K 2 0 、4 1 2 A 1 1 、3 3 4 E 1 5 、2 1 6 8 1 8 。 2 原位杂交结果表明：4 2 8 K 2 0 在海岛棉所有染色体上均产生了杂交信号，其 中在较大染色体( A 亚组) 上除染色体两端外其余部分均产生了强烈的杂交信号， 而较小染色体( D 亚组) 上仅在着丝粒区域产生明显的杂交信号，4 2 8 K 2 0 在亚洲棉 所有染色体上除染色体两端其余部分均产生了很强的杂交信号，但其在雷蒙德氏棉 上却没有产生信号；4 1 2 A 1 1 只在海岛棉较大染色体( A 亚组) 两端产生杂交信号， 在亚洲棉、草棉、阿非利加棉所有染色体两端均产生了明显的杂交信号，与4 2 8 K 2 0 一样在雷蒙德氏棉上没有信号产生，因此可证实4 2 8 k 2 0 与4 1 2 A 1 1 均由A 基因组特 异的重复序列组成，但4 2 8 K 2 0 还含有一种可转座的因子( 序列) 。P i m a 9 0 - 5 3 有丝 分裂中期染色体以3 3 4 E 1 5 作为探针进行荧光原位杂交，其杂交信号分布情况为： 在较大的染色体( A 亚组) 几乎整条染色体上都有信号分布，尤其在染色体中部信 号较强，为典型的较大染色体( A 亚组) 特异的重复序列；P i m a 9 0 - 5 3 有丝分裂中 期染色体以2 1 6 8 1 8 作为探针，几乎在所有的染色体上都有信号分布，其中有6 个 较强信号分布在6 条染色体的短臂端部，根据杂交信号来看，该B A C 克隆主要是含 有4 5 Sr D N A 重复序列和一种分布于整个海岛棉染色体的散布重复序列。 3 只对其中的4 2 8 K 2 0 和4 1 2 A 1 1 分别构建了亚克隆文库。对亚克隆测序并进一 步进行序列分析。序列比对结果显示：4 2 8 K 2 0 含有陆地棉m G h C I R 2 9 l 、J E S P R 2 7 2 、 L I B 5 3 2 7 0 1 7 A 1 - N 1 D 1 2PSG h 5 5 7 类型微卫星相关序列、其大部分序列均为 g y p s y 一类型反转座子( g y p s y 1 i k er e t r o t r a n s p o s o n ) ，而很可能正是这一类型g y p s y 反转 座子，参加了由较大染色体( A 亚组) 向较小染色体( D 亚组) 的入侵过程；4 1 2 A 1 l 则主要检测到了大量的预测基因、预测蛋白、表达m R N A 及陆地棉一微型反向重复转 座元件( m i n i a t u r ei n v e r t e dr e p e a tt r a n s p o s a b l ee l e m e n t ，M I T E ) ，根据A 基因组染色体 两端较强的杂交信号，推断A 基因组染色体靠近端粒或亚端粒区域可能含有很多微 型反向重复转座元件( m i n i a t u r ei n v e r t e dr e p e a ttr a n s p o s a b l ee l e m e n t ，M I T E ) 。 关键词：海岛棉、荧光原位杂交、B A C 单克隆、亚克隆、序列比对 A b s t r a c t I nt h i s s t u d y ，t h eg e n o m eo fG b a r b a d e n s eW a Su s e dt oi s o l a t es p e c i f i cr e p e t i t i v es e q u e n c e R e p e a t e ds e q u e n c ed i s t r i b u t i o n i n G b a r b a d e n s e ，G a r b o r e u m ，G h e r b a c e u m ，G h e r b a c e u m v a r a f r i c a n u ma n dG r a i m o n d i iw e r ev e r i f i e db yF I S Ha f t e rc o n s t r c t i o no fs u b c l o n e sa n ds e q u e n c e a n a l y s i s T h em a i nr e s u l t sw e r eo b t a i n e d 嬲f o l l o w s ： 1 19 2 0 0B A Cc l o n e sw e r es c r e e n e df r o mp i m a 9 0 - 5 3B A Cl i b r a r y F l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( F I S H ) W a Sc a r r i e do u tO nG b a r b a d e n s em i t o t i cm e t a p h a s ec h r o m o s o m e sb yu s i n gt h ep r o b e so f s p e c i f i cr e p e t i t i v es e q u e n c e A c c o r d i n gt ot h ed i s t r i b u t i o no fh y b r i d i z a t i o ns i g n a l ，w ef o u n df o u rB A C m o n o c l o n a l T h ec l o n en u m b e r sa r e ：4 2 8 K 2 0 ，4 1 2 A 11 , 3 3 4 E 1 5 ，2 1 6 8 1 8 2 I ns i r eh y b r i d i z a t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a t4 2 8 K 2 0C a np r o d u c es t r o n gs i g n a li na l lt h ec h r o m o s o m e s o fG b a r b a d e n s e , 4 2 8 K 2 0p r o d u c e das t r o n gh y b r i d i z a t i o ns i g n a li nb e s i d e st h ec h r o m o s o m ee n d sl a r g e c h r o m o s o m e s ( As u b g e n o m e ) o fG b a r b a d e n s e H o w e v e r ，h y b r i d i z a t i o ns i g n a lc o u l db ef o u n di nt h e r e g i o nn e a rt h ec e n t r o m e r eo fs m a l lc h r o m o s o m e s ( Ds u b g e n o m e ) I nG a r b o r e u m ，t h es i g n a ld i s t r i b u t i o n i na c c o r d a n c ew i t h l a r g ec h r o m o s o m e s ( As u b g e n o m e ) o fG b a r b a d e n s eb u t i tc a n tp r o d u c e h y b r i d i z a t i o ns i g n a li nG r a i m o n d i i ；4 1 2 A 11o n l yw a sp r o d u c e dh y b r i d i z a t i o ns i g n a li nl a r g et h e c h r o m o s o m e ( As u b g e n o m e ) e n d so fG b a r b a d d e n s e I ta l s oc o u l db ep r o d u c e dh y b r i d i z a t i o ns i g n a li n t h ec h r o m o s o m ee n d so fG a r b o r e u m 、G h e r b a c e u m 、G h e r b a c e u mv a r a f r i c a n u m B u ti td i d n tp r o d u c e h y b r i d i z a t i o ns i g n a l i nG r a i m o n d i i I ti st h e r e f o r ec o n f n r nt h a t4 2 8 K 2 0a n d4 1 2 A 11 a r e s p e c i f i c r e p e t i t i v es e q u e n c eo fAg e n o m e ，b u t4 2 8 K 2 0c o n t a i n sat r a n s p o s i t i o n a le l e m e n t ( s e q u e n c e ) ；3 3 4 E 1 5 p r o d u c e dh y b r i d i z a t i o ns i g n a li nb e s i d e st h ec h r o m o s o m ee n d sl a r g ec h r o m o s o m e s ( As u b g e n o m e ) o f G b a r b a d e n s e ，e s p e c i a l l yh y b r i d i z a t i o ns i g n a lw e r ev e r ys t r o n gi nt h em i d d l eo fl a r g ec h r o m o s o m e ( A s u b g e n o m e ) S u c hB A Cc l o n e sm a yb em o r er e l e v a n ti nt h ep i m a 9 0 - 5 3B A Cl i b r a r y I ti sat y p i c a lA s u b g e n o m es p e c i f i cr e p e a ts e q u e n c e ；2 16 B18C a np r o d u c eh y b r i d i z a t i o ns i g n a li na l lt h ec h r o m o s o m eo f G B a r b a d e n s eb u ts i xs 仃o n gh y b r i d i z a t i o ns i g n a lw h i c ha r el o c a t e da tt h ee n d so fs i xc h r o m o s o m e S u c h B A Cc l o n e sm a yb ea l s om o r er e l e v a n ti nt h ep i m a 9 0 5 3B A C l i b r a r y A c c o r d i n gt oh y b r i d i z a t i o n s i g n a l ，2 1 6 8 1 8m a i n l yc o n t a i n s4 5 So fr e p e t i t i v es e q u e n c ea n dak i n do fi n t e r s p e r s e dr e p e a ts e q u e n c e s w h i c ha r ed i 敛f i b u t e d i na l lc h r o m o s o m e sc 埴G b a r b a d e n s e 3 4 2 8 K 2 0a n d4 1 2 A 11W a so n l yc o n s t r u c t e ds u b c l o n el i b r a r y T h er e s u l to fs u b c l o n i n gs e q u e n c i n g d a t ai n d i c a t e dt h a t4 2 8 K 2 0w e r ec o n t a i nm G h C 匕91 、 H I I V 缩略语表 V 海岛棉染色体组特异重复序列的筛选及亚克隆分析 1 1 重复序列的种类 第一章：文献综述 植物重复序列按其在染色体上的分布方式，可分为串联重复序列( T a n d e m l y r e p e a t e ds e q u e n c e s ) 和散布重复序列( I n t e r s p e r s e dr e p e a ts e q u e n c e s ) 。 1 1 1 串联重复序列 串连重复序列由序列相关的D N A 重复单位首尾相连，成串排列而成。造成物种 间串联重复序列变异的主要遗传机理是扩增缺失( A m p l i f i c a t i o n d e l e t i o n ) 、突变 ( M u t a t i o n ) 和不等交换( U n e q u a le x c h a n g e ) 。串连重复序列在基因组的编码区和 非编码区都有分布，但由于真核生物基因组中编码区仅占了很少部分，其它大部 分均为非编码区，因此串连重复序列也主要分布在非编码区。植物中常见的研究较 多的串联重复序列有端粒重复序列、核糖体R N A 基因、着丝粒串联重复序列家族、 亚端粒或臂间卫星D N A 家族等。 1 1 1 1 端粒重复序歹1 ( T e l o m e r i cR e p e a t s ) 端粒是一种位于染色体最末端的染色体结构，由端粒序列和相关蛋白组成。真 核细胞线状染色体的末端端粒由于端粒酶以及D N A 聚合酶复制的特点形成了一个富 含G 的37 末端和互补的富含C 的57 末端，同时37 末端形成单链突出结构，一般有 1 4 1 6 个碱基。这一突出的G 链能够折叠形成特殊的四链结构，这种结构可识别端粒 结合蛋白并调节端粒的长度。一般认为G 链突出端存在于染色体的两个末端，这一 特异的末端与特殊的末端结合蛋白所构成的结构是细胞区分自然末端和双链断裂 的关键。W r i g h t 提出人类的染色体末端是不对称的。R i h a 研究显示植物染色体的末 端也是不对称的，一端是钝末端，另一端有G 链突出，但缺乏直接的证据。 1 1 1 2 核糖体R N A 基因 在高等植物当中，核糖体是合成蛋白质的主要场所。构成核糖体的主要成分是 r R N A 和蛋白质的复合物。编码r R N A 的基因有两种，一种是4 5 S r D N A ，另一种是 华中农业大学2 0 1 0 届硕十研究生学位论文 5 S r D N A 。核糖体R N A 基因是高度保守的重复序列家族，拥有几百乃至上千个拷贝， 成簇分布于一对或多对染色体上。 4 5 S r D N A 编码细胞质中1 8 S 、5 8 S 和2 8 Sr R N A ，集中分布在一个或数个位点， 大都与核仁组织区( N O R ) 相联系。5 S r R N A 基因是真核生物中另一类高度保守的串 联重复序列( 也称为5 S D N A ) ，重复单位为2 0 0 - - 9 0 0b p ，单倍体基因组的拷贝数为 1 0 0 0 - 5 0 0 0 0 。真核生物基因组中，5 S D N A 与r D N A 在染色体上的分布彼此独立。除 小麦、节节麦和黑麦等少数物种中两者处于相同的染色体上外，大多数物种中5 S D N A 并不位于核仁组织区所在的染色体上。 1 1 1 3 着丝粒串联重复序列家族 着丝粒是高等真核生物染色体上最具特征的一个显著标志，它是中 期染色体上主要的溢缩区，将一条染色体分成了长臂和短臂两个部分。植物着丝 粒主要由串联重复序列家族及类似反转录转座子成分的异染色质区域 构成( H e s l o pH a r r i s o ne ta 1 ，2 0 0 3 ；J i a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。从拟南芥中分离出 的18 0 b p 着丝粒卫星D N A 家族被认为是拟南芥着丝粒的核心成分 ( N a g a k ie ta 1 ，2 0 0 3 a ) ，该重复序列家族占拟南芥基因组的2 5 。拟 南芥着丝粒包含了几百万这样的串联重复单位，这些串联重复序列偶尔 被反转录转座子隔断( H e s l o p h a r r i s o ne ta 1 ，19 9 9 ；N a g a k ie ta 1 ，2 0 0 3 a ) 。 同样，其他植物例如水稻、玉米、小麦等的着丝粒D N A 也主要包含卫 星重复序列和反转录转座子成分( K i s h i ie ta 1 ，2 0 0l ；K u m e k a w ae t a 1 ，2 0 0 1 ；C h e n ge ta 1 ，2 0 0 2 ；N a g a k ie ta 1 ，2 0 0 3 b ) 。在多细胞的高等生物基因 组中，着丝粒所起的作用是不可或缺的，在有丝分裂和减数分裂的早期，染色体复 制后，着丝粒将复制后的姐妹染色单体连在一起。同时它也是减数分裂和有丝分裂 时染色体上纺锤丝结合的位点，介导了染色体的配对和分离。毫无疑问，着丝粒对 于保证细胞的正常分裂和遗传物质的稳定遗传起着重要的作用。正因为如此，着丝 粒的研究一直是人们关注的热点之一，遗传学、细胞学和现在正迅速发展的基因组 学等多学科手段的应用使得有关着丝粒的研究取得了飞速进展。 生物物种不同，着丝粒D N A 的组成和大小变化非常大。根据其组成D N A 的长度 和复杂程度，着丝粒主要可以分为三类：一是极为简单的D N A 序列，如低等真核生 物酿酒酵母染色体着丝粒是由一段仅为1 2 5b p 的单一D N A 序列组成，不存在复杂 的D N A 重复序列单元；第二类主要由高度重复的卫星序列构成，如人类的0 【s a t e l l i t e D N A 就是有功能的着丝粒的主要成分，它是由1 7 1b p 的重复单元串联起来形成的， 长度从2 5 0k b 到4M b 不等。人类的着丝粒中除了a s a t e l l i t eD N A 外，也有少量的转 2 海岛棉染色体组特异重复序列的筛选及哑克隆分析 座子等结构，但不占主要地位，和着丝粒功能关系不大；第三类也是高等真核生物 染色体着丝粒最普遍的一种，它包含了由不同类型的重复序列组成的复杂的D N h 结 构，如高度重复的卫星序列，不同类型的转座子和逆转座子等等，果蝇，拟南芥， 水稻等都属于这一类。第三类着丝粒因为组成复杂，大小多在M b 水平，研究起来 相对困难一些。 着丝粒作为F I S H 标记的使用在细胞学图的构建中起着重要的作用。C h e n g 等 ( 2 0 0 1 ) 利用水稻的着丝粒重复序列在粗线期染色体上辅助构建水稻的细胞学遗传 图。但到目前为止，还没有关于棉花着丝粒的相关报道。 1 1 1 4 亚端粒或臂间卫星D N A 家族 亚端粒或臂间卫星D N A 家族也广泛分布于植物基因组中，具有种属或染色体特 异性。现在已经得到了多种植物亚端粒串联重复序列家族，如来源于二倍体山羊草 ( A e g i l o p st a u s c h i i ) 的D 基因组的高度重复亚端粒卫星D N A 家族硝s l 广泛分布于 麦类植物中，其在小麦、大麦及黑麦基因组中都有分布；来源于黑麦( s e c a l ec e r e a l e ) 的p S e l1 9 2 家族重复单位为l1 8 b p ，也广泛分布于麦类植物中，该重复序列家族主 要位于所有黑麦染色体及部分小麦染色体的端部，而在黑麦染色体及小麦染色体的 臂间存在几个主要分布位置( M c I n t y r ee ta 1 ，1 9 9 0 ) 。黑麦特异的亚端粒串联重复序 列家族p S e 7 4 、p S c 7 2 3 5 、p S c 2 0 0 及p S c 2 5 0 以3 8 0 3 2 8 b p 为重复单位。它们占了黑 麦基因组的1 O 一2 5 ( B e d b r o o ke ta 1 ，1 9 8 0 ；A p p e l se ta 1 ，1 9 8 6 ；V e r s h i n i ne ta 1 ，1 9 9 5 ) ； 有的串联重复序列家族在不同物种中分布的位置不同，如忍jI 串联重复序列家族 在黑麦、大麦( H o r d e u m ) 和燕麦( E l y m u s ) 中位于亚端粒区域，而在小麦( T r i t i c u m ) 和山羊草( A e g i l o p s ) 中位于着丝粒区域( K i s h i ia n dT s u j i m o t o ，2 0 0 2 ) 。此外，还存 在染色体特异的臂间串联重复序列，如在黑麦地方栽培品种J N K 的2 R 长臂上存在 1 2 k b 的J N K 重复序列家族。到目前为止，还没有关于棉花亚端粒的相关报道。 1 1 2 散布重复序列 散布重复序列是指重复单元并不相连，而是分散地分布在整个基因组中的重复 序列。散布重复序列零散分布于低拷贝序列或其他重复序列之间，其分散程度与其 所在物种基因组大小有关。散布重复序列根据转座方式的不同主要有转座因子、反 转录因子等。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 1 2 1 转座因子( t r a n s p o s a b l ee l e m e n t s ) 转座因子是在基因组中可以移动的一段D N A 序列，其转座是通过剪切与插入的 机制从一个位置转到另一个位置( S m i ta n dR i g g s ，1 9 9 6 ) 。在转座机制上转座因子与 染色体结构变异有着本质的区别，转座机制的基本特点是：转座过程的发生不依 赖供体位点( d o n o rs i t e ) 与靶位点( t a r g e ts i t e ) 间序列的同源性，转座是属于不依赖 r e c A 酶的非同源重组过程；转座插入的靶位点并非完全随机，它不仅具有对核苷 酸重复序列的位点偏爱性，即表现插入热点( h o t s p o t s ) 的专一性，而且具有在特定 区域( 3 k b ) 内可随机插入所表现的区域优越性( r e g i o n a lp r e f e r e n c e ) ，基于这一特 点利用转座因子不易获得覆盖全基因组的插入突变体；某些转座因子( T n 3 ) 对 同类转座因子的插入具有排他性( 免疫性) ；转座事件发生后，靶序列在转座因 子两侧会形成正向重复( d i r e c tr e p e a t ，D R ) ；原核生物中的转座事件具有极型突变 效应，当转座子插入到某个操纵子时，不但能使被插入的结构基因功能丧失，还会 使该操纵子中位于靶位点下游的基因表达水平下降；转座因子的切除与转座将产 生复杂的遗传学效应。 B a r b a rM c C l i n t o c k 在玉米中发现了被称为A c D s 控制因子( c o n t r o le l e m e n t ) 的 转座因子，它是在植物中最先发现的转座子。除A c D s 控制因子外，玉米中还存在 E n - S p m 因子，在金鱼草中还存在T a m 转座子( M c C l i n t o c k , 1 9 6 1 ；C o e na n d C a r p e n t e r , 19 8 6 ；G i e r le ta 1 ，19 8 8 ) 。 1 1 2 2 反转录因子( r e t r o e l e m e n t s ) 反转录因子通过拷贝与插入的机制进行移动，依赖于R N A 介导的反转录酶活 性( O s t e r t a ga n dk a z a z i a n ，2 0 0 1 ) 。根据不同的特点，反转录因子可分为三类： R e t r o t r a n s p o s o n s 。R e t r o t r a n s p o s o n s 拥有长末端重复序列( L T R s ) ( K u b i se ta 1 ，19 9 8 ) ， 也包含了几个开放的阅读框( O I 强s ) ，编码特异蛋白质。根据第二个开放的阅读框 的基因顺序，可以将r e t r o t r a n s p o s o n s 分为两类，一类是T y 3 - g y p s yr e t r o t r a n s p o s o n s ， 另一类是T y l - c o p i ar e t r o t r a n s p o s o n s 。在T y 3 一g y p s y 反转录转座子中，编码整合酶的 区域位于反转录酶和R N A 酶H 的下游，T y 3 g y p s y 反转录转座子和逆转录酶病毒表 现出了高度的相似性。T y 3 g y p s y 反转录转座子广泛存在于植物基因组中，如玉米、 高梁、百合、小麦等植物中都存在T y 3 g y p s y 反转录转座子序列或类似T y 3 一g y p s y 反转录转座子序列( B e n n e t z e n ，1 9 9 6 ；S u o n i e m ie ta 1 ，1 9 9 8 ；F u k u ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在谷类 植物中，两个重复序列家族p S a u 3 A 和C C S l 都属于类似T y 3 一g y p s y 反转录转座子序 列的一部分，且它们都位于着丝粒区域( A r a g o n A l c a i d ee ta 1 ，1 9 9 6 ；J i a n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 4 海岛棉染色体组特异蕈复序列的筛选及哑克降分析 在T y l c o p i a 反转录转座子中，整合酶区域位于反转录酶的上游。T y l 一c o p i a 反转录 转座子也广泛存在于植物基因组中( F l a v e l le ta 1 ，1 9 9 2 a ；F l a v e l le ta 1 ，1 9 9 2 b ；V o y t a se t a 1 ，1 9 9 2 ；H i r o c h i k aa n dH i r o c h i k a ，1 9 9 3 ) 。T y l c o p i a 反转录转座子在植物染色体上分 布均匀。但在不同植物中也发现了区域性的缺失和扩增现象( H e s l o p H a r r i s o ne t a 1 1 9 9 9 ) 。T y l c o p i a 反转录转座子的一个重要特点是它具有高度的序列变化。大多 数植物中的T y l 一c o p i a 反转录转座子是转录失活的，但也发现了可转录事例 ( G r a n d b a s t i e ne ta 1 1 9 9 7 ) 。( 至) R e t r o p o s o n s 。R e t r o p o s o n s 不具备长末端重复序列 ( L T R s ) 的结构( K u b i se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。它的一个重要代表就是长散布核因子( L I N E s ) 。 目前人类和其它哺乳动物中的L I N E s 了解的最为清楚。在人类基因组中，L I N E 家 族L 1 H 大约有1 ，0 0 0 ，0 0 0 个拷贝，这些L I N E 因子的全长约为7 k b 。植物中的L I N E s 包括玉米中的t i n 4 因子、百合植物中的d e l 2 、甜菜中的B N R l 、拟南芥中的T a l l J 及绿藻中的Z e p p 等( S c h w a r z s o m m e re ta 1 ，19 8 7 ；L e e t o na n dS m y t h ，19 9 3 ；S c h m i d te t a 1 ，1 9 9 5 ；W r i g h te ta 1 ，1 9 9 6 ；H i g a s h i y a m ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。( 亘) R e t r o s e q u e n c e s ，包含了c D N A 和假基因，不能自动复制。 1 1 2 3 短散布核因子( S I N E s ) S I N E 的序列长度一般为1 0 0 5 0 0b p ，拷贝数可达数百至1 0 5 以上，散布或丛生 在基因组中，几乎可以分布于基因组中任何部位，是基因组中可转移的成分。S I N E 家族的分布具有一定的科属特异性，在真核基因组系统进化中扮演着十分重要的角 色，对基因组的复杂化、基因的钝化、新基因的产生、基因表达的调控都具有重要 意义。一个物种基因组中常有一种以上的S I N E ，同一种S I N E 的重复拷贝经常有若 干位点的差异，有的有删节( t r t m c a t i o n ) 现象，因此统称为S I N E 家族。根据这些差异 的大小和特异性的鉴别位点，很多家族可划分为若干亚家族。S I N E 虽然广布于真核 生物，但以哺乳动物为多。就某一S I N E 来说，有的分布非常广泛，有的则仅分布于某 一属中的少数几个种中。 S I N E 的起源和进化与生物进化历程密切相关。和转座相比，S I N E 的反转录转 座更具有不可逆性，可作为生物进化过程中的标记。越来越多的证据表明，许多S I N E 在生物类群中的分布具有特异性。因此，近年来已有一些研究者利用S I N E 来探讨有 关动植物类群的系统发生，以推动分子系统学的发展。 1 1 2 4 其它散布重复序列 植物基因组中除了以上的三种散布重复序列外，还存在其他散布重复序列。例 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 如甜菜中的p D R V 序列家族，它以散布的方式存在于甜菜基因组中，位于甜菜所有 染色体上，且在某些区域成簇出现及在着丝粒区域缺失( K u b i se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 2 重复序列的功能与应用 重复序列又称为自私D N A ，早期的研究者认为重复序列的扩增并不有利于个 体，而只是为了它们自己的扩增。那么这些所谓的自私D N A 既然并不有利于个体 的生存和繁殖，他们又如何在长期自然选择过程中得以保存而不被淘汰呢? 因此， 有些研究者认为，重复序列是基因组、细胞和后生遗传效应过程中的整体功能成分。 随着研究的发展，越来越多的研究者认为重复序列在整个基因组中起着重要的作 用。经过归纳和总结重复序列主要有编码功能、转座功能、控制结构基因重组和调 控、基因组分化、参与染色体联会和配对等几方面重要功能。 编码功能 高等生物的r D N A 和组蛋白基因都为高度串连重复序列，谷类作物中编码醇溶蛋 白和谷蛋白的基因均为高度重复序列家族。 转座功能 转座子( T r a n s p o n s o n s ) 和反转录转座子( R e t r o t r a n s p o n s o n s ) 随机插入基因组D N A 可引起插入位点的突变，并伴有明显的形态变化，甚至引起一些数量性状的变化。 在玉米中发现大量的转座子实际就是重复序列，它们插入到基因间区甚至基因内 部，影响和调控这些基因的表达。早期所观察到的染色体钮实际是一些串联重复序 列的积聚区。转座子的直接插入可引起许多突变，反转座子则是借助于反转录酶大 量复制自身的一类转座因子，其内部包含一个反转录酶合成基因，它是从D N A 到 m R N A 再到D N A 转座的关键因素。 控制结构基因重组和调控 重复序列是非编码区的重要组成元件，且处于一种动态变化之中，基因的表达可 能受重复序列的精确调控。同一基因插入不同位置，其表达量截然不同，甚至引起靶 基因的完全不表达，即通常所说的基因沉默( g e n es i l e n c e ) 。 基因组分化 基因组分化是重复序列在高等生物中的主要作用之一。在多倍体物种中，重复序 列的变化促使同源或部分同源的基因组向异源化方向发展，使这些物种减数分裂行 为二倍体化，即在减数分裂终变期和中期，全部染色体配对形成二价体，极少或不 形成多价体，从而保证了物种遗传的稳定性。 参与染色体联会和配对 6 海岛棉染色体组特异革复序列的筛选及弧克隆分析 重复序列在细胞分裂过程中，在维持染色体结构的稳定性、防止染色体错配和 非正常交换中起着举足轻重的作