产微生物絮凝剂菌株的筛选及产絮凝剂发酵条件的研究.doc

武武汉汉生生物物工工程程学学院院 毕毕业业论论文文 (设设计计) 题题 目目：产产微微生生物物絮絮凝凝剂剂菌菌株株的的筛筛选选及及 产产絮絮凝凝剂剂发发酵酵条条件件的的研研究究 学学 生生： 曾曾 威威 系系 别别： 生生物物技技术术系系 专专业业班班级级： 06 级级本本科科 3 班班 指指导导教教师师： 程程 爱爱 芳芳 辅辅导导教教师师： 程程 爱爱 芳芳 时时 间间：2009 年年 11 月月至至 2010 年年 5 月月 I 目 录 摘 要.II 关键词.II ABSTRACT.III KEY WORDS .III 0 引言 .1 1 材料与方法.1 1.1 材料.1 1.1.1 菌种来源 .1 1.1.2 培养基 .1 1.2 方法.1 1.2.1 土壤样品的采集及预处理 .1 1.2.2 富集培养 .2 1.2.3 菌种的分离与纯化 .2 1.2.4 初筛和复筛 .2 1.2.5 絮凝活性的测定 .2 2 结果与讨论.2 2.1 菌株分离及初筛结果 .2 2.2 复筛结果 .3 2.3 培养条件的优化 .3 2.3.1 培养温度对絮凝剂絮凝率的影响 .3 2.3.2 培养基初始 pH 值对絮凝剂产生速率的影响 .3 2.3.3 C1 产絮凝剂周期的测定.3 2.3.4 不同接种量对菌体产絮凝剂的影响 .4 3 结论 .4 参考文献 .6 致 谢 .6 II 产微生物絮凝剂菌株的筛选及产絮凝剂发酵条件的研究 摘 要 以活性污泥作为菌种来源，采用常规微生物学方法分离到36株菌株，初筛后有9株菌株有絮凝 活性，经复筛后有1株菌株C1絮凝活性最高。该菌株所产微生物絮凝剂沉降速度快，絮凝率高，显 示了该微生物絮凝剂良好的实际应用前景。对其生长曲线的研究表明，C1菌株的絮凝活性与菌体生 物量呈正相关性，培养24h即可达到最高絮凝活性。 关键词 微生物絮凝剂；筛选；优化 III Microbial flocculants strains in the screening and produce flocculants fermentation conditions Abstract As a source of activated sludge bacteria, isolated by conventional microbiological methods to 36 strains, 9 strains were isolated after screening a flocculating activity, after rescreening after a strain of the highest flocculating activity of C1. Flocculants produced by the strain settlement rate, flocculation rate, shows the practical application of microbial flocculants good prospects. The study shows that its growth curve, C1 strain of flocculating activity and cell biomass was positively correlated 24h culture can achieve the highest flocculating activity. Key words Microbial flocculants; Screening; Optimization 武汉生物工程学院学士学位论文（设计） 1 0 引言 目前国内外用于提高水质处理效率的一种既经济又简便的水处理技术之一就是添加适宜的絮 凝剂 ，絮凝剂被广泛应用于废水处理、食品加工和化工等工业过程。絮凝剂按其来源和性质可分 为无机絮凝剂、有机高分子絮凝剂和天然生物高分子絮凝剂。前2种絮凝剂不易降解，且其可能是 神经毒剂和致癌、致突变因子，现在许多领域已禁止或限量使用。微生物絮凝剂(microbial floeculants，MBF)是利用生物技术，从微生物体或其分泌物提取、纯化而获得的新型水处理剂，具 有安全、高效、可生物降解、不污染环境、可消除二次污染等特点，具有其它絮凝剂无法比拟的优 势，而且也易于实现工业化生产，所以MBF取代大部分传统的无机和合成有机高分子絮凝剂将成为 一种趋势。MBF的研制正成为当今世界絮凝剂研究的重要课题 絮凝在给水和排水中均发挥着不可缺少的重要作用，所应用的絮凝剂主要有传统的无机、有 机絮凝剂及生物絮凝剂，前者由于具有价格低廉，絮凝效果好等优点，因而被广泛使用，但由于其 对人类健康所形成的隐患使其应用越来越受到限制。微生物絮凝剂是一种由微生物产生的具有絮凝 活性的高分子化合物，具有絮凝沉降性能好、安全、无毒、无二次污染、易于生物降解等优点，不 仅能快速絮凝、沉淀各种水中的悬浮颗粒、金属离子，而且在废水脱色、高浓度有机物去除等方面 有独特效果，是一类极具发展前景的环境友好型水处理剂。同时，由于能产生絮凝作用的微生物种 类多、生长快、易于采取生物工程手段实现产业化 ，因此，研究和开发微生物絮凝剂具有深远的 现实意义和广阔的应用前景。 本实验从垃圾渗滤液中筛选出一株高效微生物絮凝剂产生菌C2,并对其的培养条件进行了优化， 以期提高其絮凝效率1。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种来源 以取自武汉生物工程学院柳园餐厅的生活污水以及餐厅旁的活性污泥作为菌种来源。 1.1.2 培养基 实验中采用牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)、高氏一号培养基(培养放线菌用)、查氏培养基 (培养霉菌用)、马铃薯葡萄糖培养基(培养真菌用)。本实验中，富集培养时选用上述培养基的液体 培养基，分离、保藏菌株时则采用相应的固体培养基2-3。 发酵培养基： 蔗糖150g， 尿素1g， MgSO47H2O 0.5g， KCl 015g，KH2PO4 0.08g，ZnSO47H2O 0.01g，MnSO4H2O 0.02g，蒸馏水1 000mL，pH值自然。 1.2 方法 1.2.1 土壤样品的采集及预处理 取自武汉生物工程学院柳园餐厅的生活污水以及餐厅旁的活性污泥用无菌水浸泡几分钟，过滤， 到入一个250ml已灭菌的锥形瓶中。 武汉生物工程学院学士学位论文（设计） 2 1.2.2 富集培养 分别在不加琼脂的PDA培养基，高氏一号培养基、查氏培养基、牛肉膏蛋白胨培养基中加入1mL 的土壤悬液，均富集培养两天，编号并注明日期。 1.2.3 菌种的分离与纯化 (1)稀释培养液。用移液管移取1mL的细菌富集培养液于一装有9mL无菌水的试管中，混匀，再 用另一支移液管移取此稀释液1mL于另一装有9mI无菌水的试管中，依次类推将富集培养液逐渐稀 释制成10-210-6各种梯度的培养液。其他的富集培养液以同样的方法稀释4。 (2)平板划线。在无菌条件下，用接种环取一环稀释倍数为l0-3的细菌培养液，在其培养基中划 线，平行划三个平板，同样的方法将稀释倍数为10-4、10-5培养液平行划三个平板，三个对照，编号， 注明日期后，倒置在生化培养箱中于37培养2天。放线菌，霉菌，真菌以同样的方法操作，于 28 倒置培养57天。 (3)菌落的选择和挑取。将透明圈比较大的菌落进行编号，分别接种于各自的斜面培养基中培 养5。 1.2.4 初筛和复筛 将分离菌株分别接种到相应的液体培养基中，在30摇床培养48h后，以高岭土悬浊液为模拟 废水，目测分离菌株对高岭土悬浊液的絮凝活性，初步筛选出絮凝活性较好的菌株。将初筛菌株分 别接种于装有150mL培养基的250mL三角瓶中，30、150rmin振荡培养，于24h、48h、72h取样， 测定培养液在不离心和3000rrain离心30min两种情况下，菌株发酵液对高岭土悬浊液的絮凝活性， 进行复筛6-7。 1.2.5 絮凝活性的测定 絮凝活性用絮凝率来表征。在100mL比色管中加入0.4g高岭土、2mL1.0 的CaCl2及2mL纯化培 养的培养液，加蒸馏水至100mL。盖上盖子做10次上下自然翻转，转速以每次翻转时气泡上升完毕 为准。静置10min，取比色管中75mL处的上清液并以蒸馏水为参比溶液，于波长为550nm处测其吸 光度。絮凝率的计算公式如下： 絮凝率=(A-B)A100 式中，A为原高岭土悬浊液上清液550nm处的吸光度值；B为处理后的高岭土悬浊液上清液550nm处 的吸光度值8-11。 2 结果与讨论 2.1 菌株分离及初筛结果 本实验共分离菌株36株，每种培养基9株，分别命名为P1、P2、P9(PDA培养基)， N1、N2、N9(牛肉膏蛋白胨培养基)，C1、C2、C9（查氏培养基） ， G1、G2、G9（高氏培养基）12-13。初筛后有絮凝活性的菌株共10株，其中牛肉膏蛋白胨培养 基1株，为N2，高氏一号培养基3株，分别为G2、G4、G5；查氏培养基6株，分别为 C1、C2、C3、C5、C7、C8；PDA培养基0株。 武汉生物工程学院学士学位论文（设计） 3 2.2 复筛结果 复筛结果如表1所示。其中絮凝活性最高的为C1，絮凝率为0.712，其次为C2、C8。将这三株 菌株重新接种培养，对培养液的发酵活性进行比较，结果显示C1菌株沉降速度最快，絮凝率最高， 且菌株悬液浓度较低，表明该菌株产微生物絮凝剂能力强，且培养液絮凝活性好。因此，以该菌株 作为后续研究对象14。 表1 不同菌株絮凝活性 菌株N2G2G4G5C1C2C3C5C7C8 絮凝率0.280.3080.1020.4720.7120.6210.320.3030.5070.541 2.3 培养条件的优化 2.3.1 培养温度对絮凝剂絮凝率的影响 表2 培养温度对絮凝剂絮凝率的影响 培养温度（）23252730333537 絮凝率0.5110.5240.5880.6920.6530.5470.501 由表2可知，当温度为30 时，絮凝剂絮凝率最大为0.692。2330之间时，絮凝剂絮凝率随 温度升高而增大，但温度为35时，絮凝剂絮凝率迅速下降。这是因为温度过低或过高时，微生物 生长过慢或过快，均不利于絮凝剂的积累15。因此，选择培养温度为30。 2.3.2 培养基初始 pH 值对絮凝剂产生速率的影响 表3 初始pH值对絮凝剂絮凝率的影响 pH 值456789 絮凝率0.4120.5290.6420.7120.6850.594 pH值对微生物的生长和代谢具有很大的影响。一方面，pH过高或过低都会引起微生物表面电 荷的改变，从而不利于细胞对营养物质的吸收；另一方面，pH过高或过低会使蛋白质、核酸等生 物大分子所带电荷发生变化，从而影响其生物活性16。由表3可以看出，pH在6.08.0的范围之间， 都有较高的絮凝活性，最佳pH在7.0左右，此时絮凝率达到71.2。 2.3.3 C1 产絮凝剂周期的测定 在250mL三角瓶内装50mL发酵培养基，初始pH值为7，在30 、180 rpm 条件下摇床培养， 每12h取样一次，测定发酵液絮凝活性。发酵液的絮凝率在12h之前均为负数，可能因为在培养初期， 絮凝剂产生菌尚未产生絮凝剂，相反在发酵液或高岭土中某些成分使吸光度增大，导致絮凝率为负 值17。培养中、后期絮凝活性逐步上升，发酵72h时絮凝率达到72%，之后絮凝率又逐渐下降。 表4 生长周期对絮凝剂絮凝率的影响 生长周期12h24h36h48h60h72h84h96h108h 絮凝率-0.1830.1540.2630.4210.5740.720.6740.6120.582 武汉生物工程学院学士学位论文（设计） 4 2.3.4 不同接种量对菌体产絮凝剂的影响 在发酵培养基中分别以1、2、3、4、5、6的接种量接入种子液，经摇床培养72h 后，分别测定各组培养液的絮凝活性，实验结果显示，接种量为 3时，絮凝率较高为70.5， 之后随着接种量的增大，絮凝率降低。因此，接种量也是影响 C1产絮凝剂的一个因素。由于接 种量过大，培养液中细菌的初始浓度高，生长初期细菌生长繁殖则会消耗大量的营养物质，导致 絮凝剂的产量下降；而接种量过小，培养液中的细菌浓度低，使得培养 周期过长18。 表5 不同接种量对絮凝剂絮凝率的影响 接种量 1%2 % 3 % 4 % 5 % 6 % 絮凝率0.5420.6740.705 0.682 0.6570.635 3 结论 以活性污泥作为菌种来源，采用常规微生物学方法从四种培养基中分离到 36 株菌株。经初筛 后有 10 株菌株有絮凝活性，经复筛后有 3 株菌株絮凝活性较高，其中 C1 菌株絮凝活性最高，可达 71.2% 。该菌株所产微生物絮凝剂絮凝率高，且生成絮体大，沉降速度快，显示了该微生物絮凝剂 良好的实际应用前景。 经过单因子实验的研究表明： （1）在温度为 30、絮凝剂絮凝率最大为 0.692。2330之间时，絮凝剂絮凝率随温度升高 而增大，但温度为 35时，絮凝剂絮凝率迅速下降。这是因为温度过低或过高时，微生物生长过 慢或过快，均不利于絮凝剂的积累。因此，选择培养温度为 30。 （2）pH 值为 7 时，一方面，pH 过高或过低都会引起微生物表面电荷的改变，从而不利于细胞 对营养物质的吸收；另一方面，pH 过高或过低会使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化， 从而影响其生物活性。由表 3 可以看出，pH 在 6.08.0 的范围之间，都有较高的絮凝活性，最佳 pH 在 7.0 左右，此时絮凝率达到 71.2。 （3）最佳生长周期为72h。发酵液的絮凝率在12h之前均为负数，可能因为在培养初期，絮凝剂 产生菌尚未产生絮凝剂，相反在发酵液或高岭土中某些成分使吸光度增大，导致絮凝率为负值。培 养中、后期絮凝活性逐步上升，发酵72h时絮凝率达到72%，之后絮凝率又逐渐下降。 （4）最佳接种量为3%。絮凝率较高为70.5，之后随着接种量的增大，絮凝率降低。因此， 由于接种量过大，培养液中细菌的初始浓度高，生长初期细菌生长繁殖则会消耗大量的营养物质， 导致絮凝剂的产量下降；而接种量过小，培养液中的细菌浓度低，使得培养 周期过长。 虽然当前对微生物絮凝剂菌株的研究比较多，但还是有很多地方还需要实质性的突破。我觉 得现在对微生物絮凝剂菌株研究的 重点是尽快将微生物絮凝剂推广应用到实际中去,实现微生物 絮凝剂的大规模推广,关键是要提高生产效率、降低成本、拓宽适用范围和使用效率。今后的研 究工作可能集中在以下几方面展开 ： (1) 继续从各角度研究微生物的絮凝机理仍将是各国科学工作者研究的热点。 (2) 在微生物发酵中, 诱导和利用自絮凝菌株实现微生物的高浓度培养 , 以提高目标产物的 浓度,优化运行条件、探索新工艺新方法。寻找物美价廉的微生物絮凝剂培养基与培养条件的研究 ,实 现连续发酵也是今后微生物絮凝剂应用研究的一个方向。 武汉生物工程学院学士学位论文（设计） 5 (3)在生物发酵产品的后提取中 , 针对具体的微生物发酵液体系 , 选择合适的絮凝剂进行絮凝 预处理, 从而改善其固液分离性能 , 以利于产品的进一步提纯 , 这将会大大降低后提取的成本 , 带来可观的经济效益;研究微生物絮凝剂与其它絮凝剂的配合使用 ,发挥互补作用,不但可提高絮 凝效率,而且还可降低投加量。 (4)从分子生物学的角度深入研究 ,运用基因工程和生物技术定向选育高絮凝活性、高降解能 力的工程菌将是其发展的方向之一。 参考文献 1 周礼, 张永奎, 陈晓等. 一种高效微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养基优化J. 环境科学学报, 2006, 26(4):52-58. 2 陶然, 杨朝晖, 曾光明等. 微生物絮凝剂产生菌的筛选、鉴定及其培养条件的优化研究J. 中国 生物工程杂志, 2005, 25(8):76-81. 3 董晓斌. 新型生物絮凝剂的研究与应用J. 甘肃联合大学学报(自然科学版), 2006, 20(1): 52-54. 4 赵凤, 张蔚萍, 胡庆华. 微生物絮凝剂的絮凝机理和应用研究J. 环境与可持续发展, 2009 (2):6- 8. 5 王键为, 李艳宾. 微生物絮凝剂在废水处理中的应用J. 河北化工, 2007, 30(6):75-76. 6 杨阿明，张志强，王学江高效微生物絮凝剂用于污泥脱水及其动力学研究J中国给水排水， 2007，23(90)：24-28. 7 陶然，杨朝晖，曾光明等微生物絮凝剂产生菌的筛选、鉴定及培养条件的优化研究J中国 生物工程杂志，2005，25(8):76